Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de volgende subsidies: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) en P30-DK050306 (Pilot Grant aan KJW).

Alle methoden die betrekking hebben op het gebruik van muizen zijn consistent met de richtlijnen die door de IACUC van de Penn Office of Animal Welfare aan de Universiteit van Pennsylvania.
1. bereiding van het reagens
<ol><li>
Haring
	<ol>
<li>Om 500 μl van 0,1 g/ml haring te maken, schorst u 50 mg haring in 500 μL methanol. Let op: Cycloheximide is zeer giftig voor het milieu en kan aangeboren misvorming veroorzaken. Alle afvalstoffen en buffers die h...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-SEQ is een techniek voor celtypespecifieke isolatie van het vertalen van mRNA via epitope-Tagged ribosomen en presenteert een alternatief voor FACS benaderingen, als het omzeilt beperkingen zoals tijd vereisten van FACS9. In plaats daarvan, TRAP maakt snelle en efficiënte isolatie van RNA rechtstreeks uit bulk weefsels, helpen om te voorkomen dat eventuele veranderingen in genexpressie. De trap-SEQ is bijzonder geschikt voor gebruik in de herbevolkende Fah-/- Mouse lever...

Als de belangrijkste metabole orgaan in gewervelde dieren, de lever is verantwoordelijk voor glucose homeostase, serumeiwit synthese, gal zuur secretie, en xenobiotische metabolisme en detoxificatie. De lever bezit een buitengewone capaciteit om het geblesseerde parenchym te regenereren bij blootstelling aan toxines om onmiddellijke leverfalen1te voorkomen. Echter, falen van regeneratie kan optreden in de setting van paracetamol of alcohol overconsumptie, wat kan leiden tot acuut leverfalen2. Bovendien, chronische leverschade veroorzaakt door virale hepatitis infectie, vette leverziekte, en Steatohepatitis kan leverfibrose veroorzaken, cirrose, en hepatocellulaire carcinoom3. De enige beschikbare curatieve behandeling voor eindstadium leverziekte is transplantatie, maar wordt beperkt door orgaan tekort, waardoor een efficiënte behandeling voor alle patiënten4. Een beter begrip van het herstelproces na toxische leverbeschadiging is daarom cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen om regeneratie te stimuleren die voldoende is om de functie in het zieke orgaan te redden.
Het meest breed toegepaste modelsysteem voor de studie van lever regeneratie is partiële hepatectomie bij knaagdieren, waarbij een groot deel van de lever wordt doorgeperfectioneerd om snelle hepatocyten uitbreiding5te stimuleren. Echter, partiële hepatectomie niet recapituleren hepatocyten expansie na toxische leverschade als gevolg van het gebrek aan immuuncel infiltratie en hepatocyten cel necrose vaak waargenomen in de setting van acute leverschade bij de mens6. Een geschikter systeem om deze vorm van orgel vernieuwing te modelleren is de Fah-/- Mouse, die geen functionele fumarylacetoacetaat hydrolase (FAH) vereist voor een goede tyrosine metabolisme en ontwikkelt ernstige leverschade leidt tot de dood7. Deze muizen kunnen worden gehandhaafd in een gezonde toestand voor onbepaalde tijd door behandeling met de drug nitisinon in het drinkwater. Als alternatief kan Fah expressie worden hersteld door transgen levering aan een subset van hepatocyten, die zal uitbreiden naar de lever opnieuw bevolken op nitisinon verwijderen8.
Voor het profiel van de genetische expressie veranderingen van het herbevolgen van hepatocyten, een instrument om specifiek te isoleren repliceren hepatocyten in de Fah-/- Mouse zonder besmetting van de naburige gewonde hepatocyten en andere celtypen is vereist. Helaas, fluorescentie-geassisteerde celsortering (FACS) van hepatocyten is moeilijk sinds (1) de kwetsbaarheid van het hervullen van hepatocyten leidt tot slecht herstel na lever perfusie, (2) replicerende hepatocyten zijn zeer variabel in grootte, waardoor isolatie van een zuivere populatie door FACS moeilijk, en (3) de procedure tijd van lever perfusie tot RNA-isolatie is groter dan 2 uur, vandaar dat genexpressie profielen aanzienlijke kunstmatige veranderingen kunnen ondergaan voordat monsters worden verworven9.
Als alternatief kan de uitdrukking van met epitope gelabelde ribosomen die specifiek zijn voor het hervullen van hepatocyten, de snelle isolatie van actief vertalen van mRNA gebonden door ribosomen met behulp van affiniteits zuivering onmiddellijk na orgaanoogst, met bulk lever weefsel lysaten. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van vertalen-ribosome affiniteits zuivering (TRAP)10 gevolgd door RNA-sequencing met hoge doorvoer (trap-SEQ), om specifiek mRNA te isoleren en te profiel bij het hervullen van hepatocyten in de Fah-/- muis9. Coexpressie van groen fluorescerend eiwit-gelabeld ribosomaal eiwit (GFP: RPL10A) met FAH maakt affiniteits zuivering van het vertalen van mRNA gebonden door polysomes met GFP: RPL10A. Deze methode vermijdt elke celdissociatie stappen, zoals lever perfusie om fragiele repopulatie hepatocyten te isoleren. In plaats daarvan maakt het gebruik van Lysis van heel orgaanweefsel en antilichamen om snel het RNA specifiek uit de doelcellen te halen. Tot slot maakt het isoleren van overvloedige, kwalitatief hoogwaardige mRNA via TRAP-SEQ downstreamtoepassingen zoals sequentieanalyse mogelijk om de dynamische verandering van genexpressie tijdens het repopulatie proces te profiel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Lever repopulatie na letsel is een cruciaal kenmerk van zoogdieren die onmiddellijk orgaan falen en overlijden na blootstelling van milieu-toxines voorkomt. Een dieper begrip van de veranderingen in genexpressie die optreden tijdens de herbevolking kan helpen bij het identificeren van therapeutische doelen ter bevordering van het herstel van de leverfunctie bij het instellen van verwondingen. Niettemin, methoden om specifiek te isoleren van de herbevolkingende hepatocyten worden geremd door een gebrek aan celmarkeringen, beperkte celaantallen, en de kwetsbaarheid van deze cellen. De ontwikkeling van het vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) technologie in combinatie met de Fah-/- Mouse model te even herbevolking in de setting van leverletsel maakt het mogelijk genexpressie profilering van de repopulatie hepatocyten. Met TRAP, Cell Type-specifieke vertalen mRNA is snel en efficiënt geïsoleerd. We ontwikkelden een methode die gebruik maakt van TRAP met affiniteit gebaseerde isolatie van het vertalen van mRNA van hepatocyten die selectief uitdrukken het groene fluorescerende eiwit (GFP)-tagged ribosomale eiwitten (RP), GFP: RPL10A. TRAP omzeilt de lange periode die nodig is voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen die het genexpressie profiel kunnen veranderen. Bovendien, aangezien alleen de herbevolkende hepatocyten Express de GFP: RPL10A fusie-eiwit, de geïsoleerde mRNA is verstoken van besmetting van de omringende geblesseerde hepatocyten en andere celtypen in de lever. De affiniteits-gezuiverde mRNA is van hoge kwaliteit en maakt downstream PCR-of high-throughput sequencing-gebaseerde analyse van genexpressie mogelijk.

Voor het profiel van genexpressie bij het hervullen van hepatocyten van de Fah-/- Mouse, worden GFP: Rpl10a Fusion en Fah transgenes samen geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide8 (trap vector) tot levers door hydrodynamische injectie (Figuur 1A). De verwijdering van nitisinon induceert een toxische leverbeschadiging die een selectiedruk creëert voor hepatocyten die een...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Met TRAP-seq kunnen we het RNA isoleren van specifieke celtypen, zoals de hepatocyten die opnieuw in gewonde lever komen om de veranderingen in genexpressie in die cellen te analyseren. Het vereist geen stappen om ongewenste cellen uit het weefsel te verwijderen. Het celtype-specifieke RNA wordt geïsoleerd door affiniteitszuivering van hele orgaanlysates.Deze techniek helpt ons bepalen hoe specifieke cellen reageren op verwondingen, die kunnen helpen bij het identificeren van nieuwe strategieën of geneesmiddelen om leverziekte te bestrijden. Dit kan worden gebruikt om te bepalen hoe levercellen reageren op verschillende soorten leverletsels. Momenteel zijn er weinig opties voor ernstige acute leverletsels en deze methode zal helpen om aanwijzing ons in nieuwe behandelingen.Deze methode is ontstaan in de hersenen. In de lever, we voor ogen het zou kunnen worden gebruikt om dynamische veranderingen in een verscheidenheid van celtypes te onderzoeken, de hepatocyten, galkanaalcellen, Kupffer cellen, en endotheelcellen om er een paar te noemen. Demonstreren van de procedure zal Amber Wang, een afgestudeerde student en mijn mentee.Om te beginnen, resuspend magnetische kralen door zachte pipetting. Verzamel de kralen op een magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Verwijder vervolgens de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe, gevolgd door pipetten op en neer om de kralen te wassen.Plaats de buis terug op de magnetische standaard voor meer dan een minuut om de kralen te verzamelen en verwijder de PBS. Om eiwit L-gecoate kralen voor te bereiden, voeg 16 microliter biotinylated eiwit L toe aan de opnieuw opgespente en gewassen magnetische kralen en voeg 1X PBS toe om het uiteindelijke volume een milliliter te maken, bij gebruik van een 1,5-milliliter microcentrifugebuis, of 1,5 milliliter, bij gebruik van een twee-milliliter microcentrifuge buis. Broed de magnetische kralen met biotinylated eiwit L gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur op een buis rotator.Plaats vervolgens de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijder de supernatant om het eiwit L-gecoate kralen te verzamelen. Haal de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe met een BSA-buffer van 3%, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetten om de eiwit L-gecoate kralen te wassen. Nogmaals, plaats de buis op de magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant om de gecoate kralen te verzamelen.Herhaal de BSA wassen nog eens vier keer. Voeg vervolgens 50 microgram antilichamen voor GFP-antilichaam 19C8 en GFP-antilichaam 19F7 toe aan het eiwit L-gecoate kralen en broed gedurende een uur bij vier graden Celsius op een buisdrammer. Om de affiniteitsmatrix te verzamelen, plaatst u de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijdert u de supernatant.Haal de buis uit de buurt van de magnetische standaard en voeg een milliliter zoutbuffer toe. Voorzichtig pipet op-en-neer om de affiniteit matrix te wassen en herhaal de zoutarme buffer wassen nog eens twee keer. Resuspend de kralen in 200 microliters van low-salt buffer, om 200 microliters van affiniteit matrix te maken.Stel eerst de weefselmolen in zodat de PTFE-glasbuizen tijdens de homogenisatie op ijs kunnen worden geplaatst. Vul vier milliliter koude lyse buffer in de PTFE glazen buizen. Leg de lever op een petrischaaltje.Gebruik een mes om 200 tot 500 milligram leverstukken te isoleren en in de PTFE glazen buizen te gaan. Plaats het resterende leverweefsel in een voorgekoelde microcentrifugebuis en flash freeze in vloeibare stikstof. Homogenize de monsters in een motorisch aangedreven homogenisator, beginnend bij 300 rpm gedurende ten minste vijf slagen om hepatocyten te scheiden van de leverstructuur.Laat de glazen buis telkens zakken. Voorkom beerting, die eiwitverdenaturatie kan veroorzaken, door de stamper onder de oplossing te houden. Verhoog vervolgens de snelheid naar 900 rpm om de leverweefsels volledig te homogeniseren voor ten minste 12 volledige slagen.Breng het lysaat in gelabelde en voorgekoelde buizen met niet meer dan een milliliter lysaat elk. Om te beginnen met nucleaire lysis, centrifugeren de lever lysaat op 2,000 keer g op vier graden Celsius gedurende 10 minuten, dan de overdracht van de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs. Voeg 1/9e van het supernatant volume van 10%NP-40 toe aan de microcentrifugebuis op ijs en meng de oplossing door de buis voorzichtig om te keren.Draai snel de microcentrifugebuizen met een minicentrifuge naar beneden en voeg 1/9e van het monstervolume van 10% DOC. Meng door de microcentrifugebuizen voorzichtig om te keren en draai snel de microcentrifugebuizen naar beneden en broed gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer het kernlysaat op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en breng het supernatant over op nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuizen op ijs.Neem voor elke buis 1% van het totale volume van de supernatant eruit als pre-immunoprecipitatiecontrole. Plaats de pre-immunoprecipitatie controles op een buis rotator op vier graden Celsius 's nachts. Wees extra voorzichtig met het voorzichtig opnieuw oplichten van de affiniteitsmatrix door pipetting en voeg vervolgens 200 microliters toe aan elk monster.Incubeer de lysates op vier graden Celsius 's nachts met zachte mengen op een buis rotator. Om RNA te isoleren, draai je snel de buizen met de lysaten in de minicentrifuge naar beneden en verzamel je de kralen door minstens één minuut op het magnetische rek te plaatsen. Verzamel de supernatant in extra microcentrifugebuizen.Voeg een milliliter verse zoutbuffer met veel zout toe aan elke buis, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetting zonder bellen te introduceren. Verzamel de kralen op de magnetische standaard op ijs voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Herhaal de wasstappen nog vier keer.Verwijder vervolgens de microcentrifugebuizen van de magnetische standaard en plaats vijf minuten op kamertemperatuur om op te warmen. Resuspend de kralen in 100 microliters van lyse buffer met 0,7 microliter bèta-mercaptoethanol om gebonden RNA vrij te geven van de affiniteit matrix. Vortex de buizen voor ten minste vijf seconden op de hoogste snelheid en snel spin naar beneden.Vervolgens, incubeer de buizen op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Plaats de buizen minstens één minuut op de magnetische standaard, verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk door naar RNA-opruiming volgens het RNA-zuiveringsprotocol in de kit. Voer alle optionele stappen uit, inclusief DNase-vertering en alle RNA-elutiestappen, inclusief de aanbevolen voorverwarming van de elutiebuffer tot 60 graden Celsius.In deze studie werden GFP-L10A-fusie en Fah-transgenes mede-geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide valvector naar levers door hydrodynamische injectie. Het verwijderen van nitisinone veroorzaakte een toxisch leverletsel. Immunofluorescentie kleuring bevestigde de coexpressie van de FAH en GFP-L10A fusie-eiwit en de herbevolking hepatocyten na twee weken van leverherbevolking.Het rustige monster produceerde de hoogste opbrengst van fusie-eiwit, omdat alle hepatocyten na AAV8-TBG-Cre injectie GFP-L10A uitdrukken. Omgekeerd was er nauwelijks RNA detecteerbaar in wild-type controles die niet over de GFP-L10A transgene, wat aangeeft dat de TRAP procedure is zeer specifiek en heeft een lage achtergrond. Toen TRAP werd gebruikt op leverweefsel dat herbevolking onderging met GFP-L10A-transduceerde hepatocyten, werd overvloedig RNA van hoge kwaliteit verkregen.Daarentegen werd geen RNA-spoor gedetecteerd via Bioanalyzer voor het negatieve controlemonster. Gsta1 expressie werd veroorzaakt door meer dan tienvoudige in het herbevolken van hepatocyten in vergelijking met rustige hepatocyten, terwijl er geen drempelcyclus waarden werd gedetecteerd met TRAP-geïsoleerde RNA van het wilde type muis als gevolg van het ontbreken van input RNA. Bij het homogeniseren van het weefsel, zorg ervoor dat de stamper langzaam te verplaatsen om beerting te voorkomen.Na het isoleren van het RNA kunnen hoge-doorvoer sequencing of qPCR worden uitgevoerd om genexpressie te analyseren. Met TRAP-seq hebben we nu een methode om RNA specifiek te isoleren van het herbevolken van hepatocyten en de verandering in genexpressie tijdens leverherbevolking te analyseren. Dit stelt ons in staat om genen te identificeren die tijdens dit proces worden gewijzigd en potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van leverletsel.Cycloheximide en DTT, die aanwezig zijn in verschillende buffers, zijn beide giftig. Afval moet worden ingezameld en weggegooid volgens institutionele richtlijnen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...