Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), et P30-DK050306 (Subvention pilote à KJW).

Toutes les méthodes qui impliquent l'utilisation de souris sont conformes aux lignes directrices fournies par l'IACUC du Penn Office of Animal Welfare de l'Université de Pennsylvanie.
1. Préparation de réactif
<ol><li>
Cycloheximide Cycloheximide
	<ol>
<li>Pour faire 500 oL de cycloheximide de 0,1 g/mL, suspendre 50 mg de cycloheximide dans 500 l de méthanol. MISE EN GARDE: Le cycloheximide est extrêmement toxique pour l'environnement et peut causer...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq est une technique pour l'isolement de type cellulaire spécifique de traduire l'ARNm par l'intermédiaire de ribosomes épitope-marqués et présente une alternative aux approches FACS, car il contourne des limitations telles que des exigences de temps de FACS9. Au lieu de cela, TRAP permet l'isolement rapide et efficace de l'ARN directement à partir des tissus en vrac, aidant à éviter toute altération de l'expression des gènes. TRAP-seq est particulièrement bien adapté pour une ut...

En tant qu'organe métabolique principal chez les vertébrés, le foie est responsable de l'homéostasie du glucose, de la synthèse des protéines du sérum, de la sécrétion d'acide biliaire et du métabolisme et de la désintoxication xénobiotiques. Le foie possède une capacité extraordinaire de régénérer le parenchyme blessé lors de l'exposition aux toxines pour prévenir l'insuffisance hépatique immédiate1. Cependant, l'échec de la régénération peut se produire dans le cadre de l'acétaminophène ou la surconsommation d'alcool, qui peut conduire à une insuffisance hépatique aigue2. En outre, les dommages chroniques de foie provoqués par l'infection virale d'hépatite, la maladie de foie gras, et la stéatohépatite peuvent causer la fibrose de foie, la cirrhose, et le carcinome hépatocellulaire3. Le seul traitement curatif disponible pour la maladie hépatique en phase terminale est la transplantation, mais est limité par la pénurie d'organes, empêchant un traitement efficace pour tous les patients4. Une meilleure compréhension du processus de récupération après des lésions hépatiques toxiques est donc cruciale pour le développement de traitements visant à stimuler la régénération suffisante pour sauver la fonction dans l'organe malade.
Le système modèle le plus largement appliqué pour l'étude de la régénération du foie est l'hépatectomie partielle chez les rongeurs, dans laquelle une grande proportion du foie est réséquée pour stimuler l'expansion rapide des hépatocytes5. Cependant, l'hépatectomy partiel ne récapitule pas l'expansion d'hépatocyte suivant des dommages toxiques de foie dus au manque d'infiltration de cellules immunitaires et de nécrose de cellules d'hépatocyte souvent observées dans l'arrangement des dommages aigus de foie chez les humains6. Un système plus approprié pour modéliser cette forme de renouvellement d'organe est le Fah-/- souris, qui manque d'hydrolase fonctionnel de fumarylacetoacetate (FAH) exigé pour le métabolisme approprié de tyrosine et développe des dommages graves de foie menant à la mort7. Ces souris peuvent être maintenues dans un état sain indéfiniment par le traitement avec la nitisinone de drogue dans l'eau potable. Alternativement, l'expression de FAH peut être reconstituée par la livraison de transgène à un sous-ensemble d'hépatocytes, qui se développera pour repeupler le foie sur l'enlèvement de nitisinone8.
Pour profiler les changements d'expression génique des hépatocytes repoptant, un outil pour isoler spécifiquement les hépatocytes répliférants dans le Fah-/- souris sans contamination des hépatocytes blessés voisins et d'autres types de cellules est nécessaire. Malheureusement, le tri des cellules assistées par fluorescence (FACS) des hépatocytes est difficile puisque (1) la fragilité des hépatocytes repeuplent conduit à une mauvaise récupération après la perfusion du foie, (2) la reproduction des hépatocytes sont très variables en taille, ce qui rend l'isolement d'une population pure par FACS difficile, et (3) le temps de procédure de perfusion de foie à l'isolement d'ARN est plus grand que 2 h, donc les profils d'expression de gène peuvent subir des changements artificiels substantiels avant que des échantillons soient acquis9.
Alternativement, l'expression des ribosomes épitope-marqués spécifiquement dans les hépatocytes repoptant permet l'isolement rapide de traduire activement l'ARNm lié par des ribosomes utilisant la purification d'affinité immédiatement après la récolte d'organe, avec le foie en vrac lysates tissulaires. Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer la purification d'affinité de traduisme-ribosome (TRAP)10 suivie du séquençage à haut débit d'ARN (TRAP-seq), pour isoler et profiler spécifiquement l'ARNm dans les hépatocytes repoptant dans le Fah-/- souris9. La coexpression de la protéine nerbiomale fluorescente verte (GFP:RPL10A) avec FAH permet la purification d'affinité de traduire l'ARNm lié par des polysomes contenant GFP:RPL10A. Cette méthode évite toute dissociation cellulaire, comme la perfusion du foie pour isoler les hépatocytes repopuantfragiles. Au lieu de cela, il utilise la lyse de tissus d'organes entiers et des anticorps pour extraire rapidement l'ARN spécifiquement des cellules cibles. Enfin, l'isolement de l'ARNm abondant et de haute qualité via TRAP-seq permet aux applications en aval telles que l'analyse de séquençage de profiler le changement dynamique de l'expression des gènes pendant le processus de repeuplement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Le repeuplement du foie après une blessure est une caractéristique cruciale des mammifères qui empêche l'échec immédiat des organes et la mort après l'exposition des toxines environnementales. Une meilleure compréhension des changements dans l'expression des gènes qui se produisent pendant le repeuplement pourrait aider à identifier des cibles thérapeutiques pour favoriser la restauration de la fonction hépatique dans le cadre des blessures. Néanmoins, les méthodes pour isoler spécifiquement les hépatocytes repoptant sont inhibées par un manque de marqueurs cellulaires, un nombre limité de cellules, et la fragilité de ces cellules. Le développement de la technologie de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP) en conjonction avec le modèle fah-/souris pour récapituler le repeuplement dans le cadre des dommages de foie permet le profilage d'expression de gène du repopulating Hépatocytes. Avec TRAP, l'ARNm de traduction spécifique au type cellulaire est rapidement et efficacement isolé. Nous avons développé une méthode qui utilise TRAP avec l'isolement basé sur l'affinité de traduire l'ARNm des hépatocytes qui expriment sélectivement la protéine fluorescente verte (GFP)-étiquetée protéine ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP contourne la longue période de temps nécessaire pour le tri cellulaire activé par la fluorescence qui pourrait changer le profil d'expression génique. En outre, puisque seuls les hépatocytes repopant s'expriment la protéine de fusion GFP:RPL10A, l'ARNm isolé est dépourvu de contamination par les hépatocytes blessés environnants et d'autres types de cellules dans le foie. L'ARNm purifié par affinité est de haute qualité et permet l'analyse en aval du séquençage PCR ou à haut débit de l'expression génique.

Pour profiler l'expression des gènes dans les hépatocytes repopuants du Fah-/souris, la fusion Gfp:Rpl10a et les transgènes Fah sont co-livrés dans un plasmide8 contenant des transposons (vecteur TRAP) aux foies par injection hydrodynamique (Figure 1A). L'élimination de la nitisinone induit une lésion hépatique toxique qui crée une pression de sélection pour les hépatocyt...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

La traduction de la purification d'affinité de ribosome (TRAP) permet l'isolement rapide et efficace de l'ARNm de traduction de type de cellule-spécifique. Ici, nous démontrons une méthode qui combine l'injection hydrodynamique de queue-veine dans un modèle de souris de repeuplement de foie et de TRAP pour examiner le profil d'expression des hépatocytes repoptant.

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Avec TRAP-seq, nous pouvons isoler l’ARN de types cellulaires spécifiques, tels que les hépatocytes qui se répulsent dans le foie blessé pour analyser les changements d’expression génétique qui se produisent dans ces cellules. Il ne nécessite aucune étape pour enlever les cellules indésirables du tissu. L’ARN spécifique au type cellulaire est isolé par purification par affinité des lysates d’organes entiers.Cette technique nous aide à déterminer comment des cellules spécifiques réagissent aux blessures, ce qui pourrait aider à identifier de nouvelles stratégies ou médicaments pour lutter contre les maladies du foie. Cela pourrait être utilisé pour identifier comment les cellules hépatiques réagissent à différents types de lésions hépatiques. Actuellement, il y a peu d’options pour les dommages aigus graves de foie et cette méthode aidera à nous indice dans de nouveaux traitements.Cette méthode est née dans le cerveau. Dans le foie, nous avons envisagé qu’il pourrait être utilisé pour examiner les changements dynamiques dans une variété de types de cellules, les hépatocytes, les cellules des conduits biliaires, les cellules Kupffer, et les cellules endothéliales pour n’en nommer que quelques-uns. Amber Wang, une étudiante diplômée et ma mentée, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer, resuspendez les perles magnétiques par pipetting doux. Recueillir les perles sur un support magnétique pendant plus d’une minute et enlever le surnatant. Ensuite, retirez le tube de microcentrifugeuse du support magnétique et ajoutez un millilitre de PBS, suivi d’un tuyautage de haut en bas pour laver les perles.Remettre le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute pour recueillir les perles et retirer le PBS. Pour préparer les perles enrobées de protéines L, ajouter 16 microlitres de protéines biotinylées L aux perles magnétiques résuspendues et lavées et ajouter 1X PBS pour faire le volume final d’un millilitre, si vous utilisez un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, ou 1,5 millilitres, si vous utilisez un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres. Incuber les perles magnétiques avec de la protéine biotinylée L pendant 35 minutes à température ambiante sur un rotateur à tube.Ensuite, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le supernatant pour recueillir les perles enrobées de protéines L. Retirer le tube de microcentrifugeuse du support magnétique et ajouter un millilitre de PBS avec tampon 3%BSA, suivi d’un tuyautage doux au moins cinq fois pour laver les perles enrobées de protéines L. Encore une fois, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le supernatant pour recueillir les perles enduites.Répétez le lavage BSA encore quatre fois. Ensuite, ajoutez 50 microgrammes d’anticorps pour l’anticorps GFP 19C8 et l’anticorps GFP 19F7 chacun dans les perles enrobées de protéines L, et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius sur un rotateur à tube. Pour recueillir la matrice d’affinité, placez le tube sur le support magnétique pendant plus d’une minute et retirez le surnatant.Éloignez le tube du support magnétique et ajoutez un millilitre de tampon à faible teneur en sel. Pipet doucement de haut en bas pour laver la matrice d’affinité et répéter le tampon à faible teneur en sel laver encore deux fois. Resuspendez les perles dans 200 microlitres de tampon à faible teneur en sel, pour faire 200 microlitres de matrice d’affinité.Tout d’abord, installez le broyeur de tissu de sorte que les tubes en verre PTFE puissent être placés sur la glace pendant l’homogénéisation. Remplissez quatre millilitres de tampon de lyse froide dans les tubes en verre PTFE. Déposer le foie sur une boîte de Pétri.Utilisez un couteau pour isoler 200 à 500 milligrammes de morceaux de foie et passer dans les tubes en verre PTFE. Placer le reste du tissu hépatique dans un tube de microcentrifugeuse pré-réfrigéré et congeler le flash dans de l’azote liquide. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéiseur à moteur, à partir de 300 rpm pendant au moins cinq coups pour dissocier les hépatocytes de la structure hépatique.Abaissez le tube de verre à chaque fois. Prévenir l’aération, qui pourrait causer la dénaturation des protéines, en gardant le pilon en dessous de la solution. Ensuite, augmenter la vitesse à 900 rpm pour homogénéiser pleinement les tissus hépatiques pendant au moins 12 coups complets.Transférer le lysate dans des tubes étiquetés et pré-réfrigérés avec pas plus d’un millilitre de lysate chacun. Pour commencer la lyse nucléaire, centrifugeuse le foie lysate à 2000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, puis transférer le supernatant à un nouveau tube de microcentrifugeuse pré-réfrigéré sur la glace. Ajouter 1/9e du volume supernatant de 10%NP-40 dans le tube de microcentrifugeuse sur la glace et mélanger la solution en inversant doucement le tube.Faites tourner rapidement les tubes de microcentrifugeuse à l’aide d’une mini centrifugeuse et ajoutez 1/9e du volume de l’échantillon de 10 %DOC. Mélangez en inversant doucement les tubes de microcentrifugeuse et faites tourner rapidement les tubes de microcentrifugeuse et incubez sur la glace pendant cinq minutes. Centrifugeuse le lysate nucléaire à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et transférer le supernatant dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse pré-réfrigérés sur la glace.Pour chaque tube, sortez 1 % du volume total du supernatant comme contrôle pré-immunoprécipitation. Placez les commandes de pré-immunoprécipitation sur un rotateur à tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Prenez un soin supplémentaire à resuspendre doucement la matrice d’affinité par pipetting, puis ajoutez 200 microlitres à chaque échantillon.Incuber les lysates à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec un mélange doux sur un rotateur à tube. Pour isoler l’ARN, tournez rapidement vers le bas les tubes contenant les lysates dans la mini centrifugeuse et recueillez les perles en plaçant sur la grille magnétique pendant au moins une minute. Recueillir le supernatant dans d’autres tubes de microcentrifugeuse.Ajouter un millilitre de tampon frais à haute teneur en sel à chaque tube, suivi d’un tuyautage doux au moins cinq fois sans introduire de bulles. Recueillir les perles sur le support magnétique sur la glace pendant plus d’une minute et enlever le surnatant. Répétez les étapes de lavage encore quatre fois.Ensuite, retirez les tubes de microcentrifugeuse du support magnétique et placez-les à température ambiante pendant cinq minutes pour vous réchauffer. Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de lyse avec 0,7 microlitres de bêta-mercaptoéthanol pour libérer l’ARN lié de la matrice d’affinité. Vortex les tubes pendant au moins cinq secondes à la vitesse la plus élevée et tourner rapidement vers le bas.Ensuite, incuber les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Placez les tubes sur le support magnétique pendant au moins une minute, puis recueillez le supernatant et procédez immédiatement au nettoyage de l’ARN selon le protocole de purification de l’ARN dans le kit. Pour atteindre la qualité maximale de l’ARN isolé, effectuez toutes les étapes facultatives, y compris la digestion du DNase et toutes les étapes d’élitution de l’ARN, y compris le préchauffage recommandé du tampon d’élitution à 60 degrés Celsius.Dans cette étude, la fusion GFP-L10A et les transgènes Fah ont été co-livrés dans un vecteur de piège plasmide contenant du transposon aux foies par injection hydrodynamique. L’enlèvement de la nitisinone induit une lésion hépatique toxique. La coloration d’immunofluorescence a confirmé la coexpression de la protéine de fusion FAH et GFP-L10A et des hépatocytes répugnants après deux semaines de repeuplement de foie.L’échantillon quiescent a produit le rendement le plus élevé de protéine de fusion, puisque tous les hépatocytes expriment GFP-L10A après injection d’AAV8-TBG-Cre. Inversement, presque aucun ARN n’était détectable dans les contrôles de type sauvage qui n’avaient pas le transgène GFP-L10A, ce qui indique que la procédure TRAP est très spécifique et a un fond bas. Quand TRAP a été employé sur le tissu de foie subissant le repeuplement avec les hépatocytes transduced de GFP-L10A, l’ARN de haute qualité abondant a été obtenu.En revanche, aucune trace d’ARN n’a été détectée via Bioanalyzer pour l’échantillon de contrôle négatif. L’expression de Gsta1 a été induite par plus de dix fois dans les hépatocytes répugnants par rapport aux hépatocytes quiescents, alors qu’aucune valeur de cycle de seuil n’a été détectée avec l’ARN TRAP-isolé de la souris sauvage de type dû au manque d’ARN d’entrée. Lors de l’homogénéisation du tissu, assurez-vous de déplacer le pilon lentement pour empêcher l’aération.Après l’isolement de l’ARN, le séquençage à haut débit ou qPCR peut être effectué pour analyser l’expression des gènes. Avec TRAP-seq, nous avons maintenant une méthode pour isoler spécifiquement l’ARN des hépatocytes répugnants et analyser le changement dans l’expression des gènes pendant le repeuplement du foie. Cela nous permet d’identifier les gènes qui sont modifiés au cours de ce processus et les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des lésions hépatiques.Le cycloheximide et la TNT, présents dans plusieurs zones tampons, sont tous deux toxiques. Les déchets doivent être collectés et jetés conformément aux lignes directrices institutionnelles.

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