Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) und P30-DK050306 (Pilotzuschuss an KJW).

Alle Methoden, die die Verwendung von Mäusen beinhalten, stehen im Einklang mit den Richtlinien des IACUC des Penn Office of Animal Welfare an der University of Pennsylvania.
1. Reagenz-Vorbereitung
<ol><li>
Cycloheximid
	<ol>
<li>Um 500 l mit 0,1 g/ml Cycloheximid herzustellen, 50 mg Cycloheximid in 500 l Methanol auszusetzen. ACHTUNG: Cycloheximid ist extrem umweltschädlich und kann angeborene Fehlbildungen verursachen. Alle Abfälle und Puffer, die C...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS9umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah-/- </...

Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern1. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann2. Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatohepatitis Leberfibrose, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom3verursachen. Die einzige verfügbare heilende Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ist die Transplantation, wird aber durch Organmangel begrenzt, wodurch eine effiziente Behandlung für alle Patienten verhindert wird4. Ein besseres Verständnis des Genesungsprozesses nach toxischen Leberverletzungen ist daher entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen zur Stimulierung der Regeneration ausreichend, um die Funktion im erkrankten Organ zu retten.
Das am weitesten verbreitete Modellsystem zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie bei Nagetieren, bei der ein großer Teil der Leber reseciert wird, um die schnelle Hepatozytenexpansion zu stimulieren5. Jedoch, partielle Hepatectomie rekapituliert Hepatozyten-Expansion nach toxischen Leberverletzungen aufgrund des Mangels an Immunzellinfiltration und Hepatozytenzellnekrose oft bei der Einstellung von akuten Leberverletzungen beim Menschen beobachtet6. Ein geeigneteres System zur Modellierung dieser Form der Organerneuerung ist die Fah-/- Maus, der es an funktionellem Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) fehlt, das für den richtigen Tyrosinstoffwechsel erforderlich ist und schwere Leberschäden entwickelt, die zum Tod führen7. Diese Mäuse können in einem gesunden Zustand auf unbestimmte Zeit durch die Behandlung mit dem Medikament Nitisinon im Trinkwasser gehalten werden. Alternativ kann der FAH-Ausdruck durch Transgenabgabe an eine Teilmenge von Hepatozyten wiederhergestellt werden, die sich ausdehnen wird, um die Leber bei Nitisinonentfernung wieder zu bevölkern8.
Um die Genexpressionsänderungen von wiederbevölkerten Hepatozyten zu profilieren, ist ein Werkzeug erforderlich, um replizierende Hepatozyten in der Fah-/- Maus ohne Kontamination durch die benachbarten verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen gezielt zu isolieren. Leider ist die fluoreszenbasierte Zellsortierung (FACS) von Hepatozyten schwierig, da (1) die Fragilität der wiederbevölkerten Hepatozyten zu einer schlechten Erholung nach Leberperfusion führt, (2) die Replizieren von Hepatozyten sind sehr variabel in der Größe, was die Isolation einer reinen Population durch FACS schwierig ist, und (3) die Verfahrenszeit von der Leberperfusion bis zur RNA-Isolierung größer als 2 h ist, daher können Genexpressionsprofile erheblichen künstlichen Veränderungen unterzogen werden, bevor Proben erworben werden9.
Alternativ ermöglicht die Expression von Epitop-markierten Ribosomen speziell bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten die schnelle Isolierung der aktiv übersetzenden mRNA, die durch Ribosomen gebunden ist, indem sie unmittelbar nach der Organernte mit Bulk-Leber Gewebelysate. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Translating-Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)10, gefolgt von RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (TRAP-seq), um mRNA gezielt zu isolieren und zu profilieren, um Hepatozyten im Fah-/- Maus9. Die Coexpression von grünem fluoreszierendem proteingetaggtem ribosomalem Protein (GFP:RPL10A) mit FAH ermöglicht die Affinitätsreinigung der Übersetzung von mRNA gebunden durch Polysomen, die GFP:RPL10A enthalten. Diese Methode vermeidet alle Zelldissoziationsschritte, wie Leberperfusion, um zerbrechliche wiederbevölkerende Hepatozyten zu isolieren. Stattdessen nutzt es die Lyse des gesamten Organgewebes und Antikörper, um die RNA schnell gezielt aus den Zielzellen zu extrahieren. Schließlich ermöglicht die Isolierung reichlich vorhandener, hochwertiger mRNA über TRAP-seq nachgeschaltete Anwendungen wie sequenziumierende Analysen, um die dynamische Veränderung der Genexpression während des Repopulation-Prozesses zu profilieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.

Um die Genexpression in wiederbevölkerten Hepatozyten der Fah-/- Maus, Gfp:Rpl10a-Fusion und Fah-Transgenes zu profilieren, werden sie innerhalb eines transposonhaltigen Plasmids8 (TRAP-Vektor) hydrodynamische Injektion (Abbildung 1A). Die Entfernung von Nitisinon induziert eine giftige Leberverletzung, die einen Selektionsdruck für Hepatozyten schafft, die STABIL FAH ausdrücken...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Mit TRAP-seq können wir die RNA von bestimmten Zelltypen isolieren, wie z. B. den Hepatozyten, die in der verletzten Leber wieder bevölkert werden, um die in diesen Zellen auftretenden Veränderungen der Genexpression zu analysieren. Es erfordert keine Schritte, um unerwünschte Zellen aus dem Gewebe zu entfernen. Die zelltypspezifische RNA wird durch Affinitätsreinigung aus ganzen Organlysaten isoliert.Diese Technik hilft uns zu bestimmen, wie bestimmte Zellen auf Verletzungen reagieren, die helfen könnten, neue Strategien oder Medikamente zur Bekämpfung von Lebererkrankungen zu identifizieren. Dies könnte verwendet werden, um zu identifizieren, wie Leberzellen auf verschiedene Arten von Leberverletzungen reagieren. Derzeit gibt es nur wenige Möglichkeiten für schwere akute Leberverletzungen und diese Methode wird uns helfen, uns in neue Behandlungen zu hinweisen.Diese Methode stammt aus dem Gehirn. In der Leber, wir stellten uns vor, es könnte verwendet werden, um dynamische Veränderungen in einer Vielzahl von Zelltypen zu untersuchen, die Hepatozyten, Gallengangszellen, Kupffer-Zellen, und Endothelzellen, um nur einige zu nennen. Demonstriert wird das Verfahren von Amber Wang, einer Studentin und meiner Mentee.Um zu beginnen, setzen Sie magnetische Perlen durch sanftePipettierung wieder auf. Sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer für mehr als eine Minute und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie dann das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, gefolgt von Pipetten nach oben und unten, um die Perlen zu waschen.Legen Sie das Rohr für mehr als eine Minute wieder auf den magnetischen Ständer, um die Perlen zu sammeln und die PBS zu entfernen. Um Protein-L-beschichtete Perlen vorzubereiten, fügen Sie 16 Mikroliter biotinyliertes Protein L zu den resuspendierten und gewaschenen Magnetperlen hinzu und fügen Sie 1X PBS hinzu, um das endgültige Volumen zu einem Milliliter zu machen, wenn Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr oder 1,5 Milliliter verwenden, wenn Sie ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verwenden. Die Magnetperlen mit biotinyliertem Protein L 35 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rohrrotator inkubieren.Legen Sie dann die Röhre für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand, um das Protein L-beschichtete Perlen zu sammeln. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie einen Milliliter PBS mit 3%BSA Puffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung mindestens fünfmal, um das Protein L-beschichtete Perlen zu waschen. Stellen Sie das Rohr wieder für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand, um die beschichteten Perlen zu sammeln.Wiederholen Sie das BSA-Waschen noch viermal. Als nächstes fügen Sie 50 Mikrogramm Antikörper für GFP-Antikörper 19C8 und GFP-Antikörper 19F7 jeweils in das Protein L-beschichtete Perlen ein und inkubieren Sie für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einem Rohrrotator. Um die Affinitätsmatrix zu sammeln, legen Sie das Rohr für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand.Nehmen Sie das Rohr vom magnetischen Ständer weg und fügen Sie einen Milliliter Salzpuffer hinzu. Sanft nach oben und unten pfeifen, um die Affinitätsmatrix zu waschen und den salzarmen Puffer noch zweimal zu wiederholen. Setzen Sie die Perlen in 200 Mikroliter Salzpuffer aus, um 200 Mikroliter Affinitätsmatrix zu bilden.Richten Sie zunächst den Gewebeschleifer so ein, dass die PTFE-Glasröhren während der Homogenisierung auf Eis gelegt werden können. Füllen Sie vier Milliliter Kaltlysepuffer in die PTFE-Glasröhren. Legen Sie die Leber auf eine Petrischale.Verwenden Sie ein Messer, um 200 bis 500 Milligramm Leberstücke zu isolieren und in die PTFE-Glasröhren zu bewegen. Legen Sie das restliche Lebergewebe in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff ein. Homogenisieren Sie die Proben in einem motorgetriebenen Homogenisator, beginnend bei 300 U/min für mindestens fünf Schläge, um Hepatozyten von der Leberstruktur zu trennen.Senken Sie das Glasrohr jedes Mal. Verhindern Sie die Belüftung, die eine Proteindenaturierung verursachen könnte, indem Sie den Stößel unter der Lösung halten. Dann erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 900 U/min, um das Lebergewebe für mindestens 12 volle Schlaganfälle vollständig zu homogenisieren.Übertragen Sie das Lysat in beschriftete und vorgekühlte Schläuche mit jeweils nicht mehr als einem Milliliter Lysat. Um mit der Kernlyse zu beginnen, zentrifugieren Sie die Leber bei 2.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, und übertragen Sie dann den Überstand auf ein neues vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Fügen Sie 1/9 des Überstandvolumens von 10%NP-40 in das Mikrozentrifugenrohr auf Eis ein und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr sanft invertieren.Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre mit einer Minizentrifuge schnell herunter und fügen Sie 1/9 des Probenvolumens von 10%DOC hinzu. Mischen Sie die Mikrozentrifugenrohre sanft umundkehren Sie die Mikrozentrifugenrohre und tauchen Sie fünf Minuten lang auf Eis aus. Zentrifugieren Sie das Kernlysat bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf neue vorgekühlte Mikrozentrifugenröhren auf Eis.Nehmen Sie für jede Röhre 1% des Gesamtvolumens des Überstandes als Prä-Immunitizipationskontrolle heraus. Platzieren Sie die Vorimmunitisitier-Steuerung enden sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rohrrotator. Achten Sie besonders darauf, die Affinitätsmatrix durch Pipettieren vorsichtig wieder aufzuhängen und dann 200 Mikroliter zu jeder Probe hinzuzufügen.Inkubieren Sie die Lysate bei vier Grad Celsius über Nacht mit sanftem Mischen auf einem Rohrrotator. Um die RNA zu isolieren, drehen Sie die Röhren, die die Lysate in der Minizentrifuge enthalten, schnell herunter und sammeln Sie die Perlen, indem Sie sie mindestens eine Minute lang auf das magnetische Rack legen. Sammeln Sie den Überstand in zusätzlichen Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter frischen Hochsalzpuffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung mindestens fünfmal, ohne Blasen einzuschleusen. Sammeln Sie die Perlen auf dem magnetischen Ständer auf Eis für mehr als eine Minute und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte noch viermal.Dann entfernen Sie die Mikrozentrifugenrohre aus dem magnetischen Ständer und legen Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten auf, um sich aufzuwärmen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Lysepuffer mit 0,7 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol aus, um gebundene RNA aus der Affinitätsmatrix freizusetzen. Wirbeln Sie die Rohre für mindestens fünf Sekunden bei der höchsten Geschwindigkeit und drehen Sie schnell nach unten.Dann inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Legen Sie die Röhren mindestens eine Minute lang auf den magnetischen Ständer, sammeln Sie dann den Überstand und gehen Sie sofort zur RNA-Reinigung gemäß dem RNA-Reinigungsprotokoll im Kit über. Um eine maximale Qualität der isolierten RNA zu erreichen, führen Sie alle optionalen Schritte durch, einschließlich der DNase-Verdauung und aller RNA-Elutionsschritte, einschließlich der empfohlenen Vorwärmung des Elutionspuffers auf 60 Grad Celsius.In dieser Studie wurden GFP-L10A-Fusion und Fah-Transgene im Rahmen eines transposonhaltigen Plasmidfallenvektors durch hydrodynamische Injektion an Lebern abgegeben. Die Entfernung von Nitisinon induzierte eine giftige Leberverletzung. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die Koexpression des Fusionsproteins FAH und GFP-L10A und der wiederbevölkerten Hepatozyten nach zwei Wochen Leberrepopulation.Die Ruheprobe produzierte den höchsten Ertrag an Fusionsprotein, da alle Hepatozyten GFP-L10A nach AAV8-TBG-Cre-Injektion ausdrücken. Umgekehrt war kaum rna in Wildtyp-Kontrollen nachweisbar, die nicht über das GFP-L10A-Transgen verfügten, was darauf hindeutet, dass das TRAP-Verfahren sehr spezifisch ist und einen niedrigen Hintergrund hat. Als TRAP auf Lebergewebe verwendet wurde, das mit GFP-L10A transduced Hepatozyten wieder belebt wurde, wurde reichlich hochwertige RNA erhalten.Im Gegensatz dazu wurde über Bioanalyzer keine RNA-Spur für die Negative-Kontroll-Probe nachgewiesen. Die Gsta1-Expression wurde durch mehr als das Zehnfache bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten im Vergleich zu stillen Hepatozyten induziert, während mit TRAP-isolierter RNA von der Wild-Type-Maus aufgrund des Mangels an Eingangs-RNA keine Schwellenwerte für den Zyklus festgestellt wurden. Bei der Homogenisierung des Gewebes, stellen Sie sicher, dass die Stößel langsam zu bewegen, um Belüftung zu verhindern.Nach der Isolierung der RNA können Hochdurchsatz-Sequenzierungen oder qPCR durchgeführt werden, um die Genexpression zu analysieren. Mit TRAP-seq haben wir nun eine Methode, um RNA gezielt von repopulating hepatocyten zu isolieren und die Veränderung der Genexpression während der Leberrepopulation zu analysieren. Dies ermöglicht es uns, Gene zu identifizieren, die während dieses Prozesses verändert werden, und mögliche therapeutische Ziele für die Behandlung von Leberverletzungen.Cycloheximid und DTT, die in mehreren Puffern vorhanden sind, sind beide toxisch. Abfälle sollten gemäß den institutionellen Leitlinien gesammelt und entsorgt werden.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

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Forschung

Biologie

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