Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), ו P30-DK050306 (פיילוט מענק KJW).

כל השיטות המערבות את השימוש בעכברים תואמים את ההנחיות המסופקות על ידי IACUC של משרד פן לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנה מגיב
<ol><li>
ציקלוהexiמיד
	<ol>
<li>כדי להפוך 500 μL של 0.1 g/mL cycloheximide להשעות 50 mg של cycloheximide ב 500 μL של מתנול. זהירות: הציקלוחלמיד היא רעי...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

מלכודת seq היא טכניקה עבור סוג תא ספציפי בידוד של תרגום mRNA באמצעות אפיזומים מתויג ומציג חלופה לגישות FACS, כפי שהוא מוגבל מגבלות כגון דרישות הזמן של FACS9. במקום זאת, המלכודת מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של RNA ישירות מרקמות בצובר, ומסייע למנוע כל שינוי בביטוי הגנים. מלכודת seq מתאימה במיוחד...

כמו איבר חילוף החומרים העיקרי של בעלי חוליות, הכבד אחראי על הומאוסטזיס גלוקוז, סרום חלבון סינתזה, הפרשה חומצה מרה, ומטבוליזם xenoביוטי ודטוקסיפיקציה. הכבד בעל יכולת יוצאת דופן כדי לחדש את כימוכימה הפצועים בעת החשיפה לרעלים כדי למנוע כשל כבד מיידית1. עם זאת, כישלון של התחדשות יכול להתרחש בהגדרה של פרצטמול או אלכוהול צריכת יתר, אשר יכול להוביל לכשל כבד אקוטי2. יתר על כן, פגיעה בכבד כרונית נגרמת על ידי דלקת הפטיטיס ויראלי, מחלת כבד שומני, ו steatohepatitis יכול לגרום פיברוזיס בכבד, שחמת, ו סרטן hepatocellular3. הטיפול הרפואי היחיד הזמין עבור מחלת הכבד בשלב הסופי הוא השתלת אבל הוא מוגבל על ידי המחסור איברים, מניעת טיפול יעיל עבור כל המטופלים4. הבנה טובה יותר של תהליך ההחלמה לאחר פגיעה בכבד רעיל הוא אפוא חיוני לפיתוח של טיפולים לעורר התחדשות מספיק כדי להציל את תפקוד האיבר החולה.
המערכת הרחבה ביותר מודל שימושית לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת המעי חלקית במכרסמים, שבו חלק גדול של הכבד הוא resected כדי לעורר הרחבת hepatectomy מהירה5. עם זאת, כריתת הפפאציט חלקית לא לכידה התרחבות hepatectomy בעקבות פגיעה בכבד רעיל בשל היעדר חדירת תאים חיסוניים ונמק תא hepatectomy נצפו לעתים קרובות בקביעת פציעה חמורה בכבד בבני אדם6. מערכת מתאימה יותר כדי לדגמן צורה זו של התחדשות איברים הוא פה -/- עכבר, אשר חסר פונקציונלי fumarylacetoacetate (אח) נדרש עבור חילוף החומרים הנכון טירולה, מפתחת נזק כבד חמור המוביל למוות7. עכברים אלה יכולים להישמר במצב בריא ללא הגבלה על ידי טיפול עם התרופה nitisinone במים השתייה. לחילופין, ביטוי פה יכול להיות משוחזר על ידי המסירה הטרנסגנטית לקבוצת משנה של hepatocytes, אשר תרחיב לאכלס את הכבד על ידי הסרת nitisinone8.
כדי לפרופיל את השינויים בביטוי הגנים של אכלוס מחדש של hepatocytes, כלי כדי לבודד באופן ספציפי שכפול hepatocytes ב-פה-/- עכבר ללא זיהום של hepatocytes השכןנפגע וסוגי תאים אחרים נדרש. למרבה הצער, מיון תאים בסיוע בלתי מבוקר (FACS) של hepatocytes הוא קשה מאז (1) שבריאת האכלוס מחדש של hepatocytes מוביל להחלמה ירודה לאחר הכבד פרזיה, (2) שכפול hepatocytes הם מאוד משתנה בגודל, עושה בידוד של אוכלוסייה טהורה על ידי facs קשה, ו (3) את זמן ההליך מתוך זלוף הכבד כדי בידוד RNA הוא גדול מ 2 h, ולכן פרופילי ביטוי גנים עשויים לעבור שינויים מלאכותיים משמעותי לפני שנרכשו דגימות9.
לחילופין, הביטוי של אפימוטים-מתויג הריבוזומים במיוחד באכלוס מחדש של hepatocytes מאפשר הבידוד המהיר של באופן פעיל בתרגום mRNA כרוך על ידי הריבוזומים באמצעות טיהור אהדה מיד לאחר הקציר איברים, עם כבד בתפזורת רקמות כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבצע תרגום-ריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת)10 ולאחריה תפוקה גבוהה RNA-רצף (השמנה-seq), כדי לבודד במיוחד פרופיל mrna באכלוס מחדש של hepatocytes ב- אח-/- עכבר9. Coexpression של חלבון פלורסנט ירוק-מתויג חלבון ריבוזומלי (GFP: RPL10A) עם פה מאפשר טיהור אהדה של תרגום mRNA כרוך על ידי פוליזומים המכילים GFP: RPL10A. שיטה זו מונעת כל שלבי הדיסוציאציה של התאים, כגון מיזוג כבד כדי לבודד את האכלוס מחדש של המופיציטים. במקום זאת, היא משתמשת הליזה של רקמת איברים שלמים ונוגדנים לחלץ במהירות RNA במיוחד מתאי היעד. בסופו של דבר, בידוד שופע של mRNA באיכות גבוהה באמצעות השמנה-seq מאפשר יישומים במורד הזרם כגון ניתוח רצף לפרופיל השינוי הדינאמי של ביטוי הגנים במהלך תהליך האכלוס מחדש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

אוכלוסיית הכבד לאחר הפציעה היא תכונה קריטית של יונקים אשר מונע כשל איברים מיידיים ומוות לאחר חשיפת רעלים סביבתיים. הבנה עמוקה יותר של השינויים בביטוי הגנים המתרחשים במהלך האוכלוסיה יכולה לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות כדי לקדם את שיקום תפקודי הכבד בקביעת הפציעות. עם זאת, שיטות לבודד במיוחד את האכלוס מחדש של hepatocytes מעוכבים על ידי חוסר של סמנים תא, מספרי תאים מוגבלים, ואת שבריאת התאים האלה. ההתפתחות של תרגום הריבוכמה הזיקה של טיהור (מלכודת ) הטכנולוגיהבשילוב עם פה-/- מודל העכבר כדי לשחזר את האוכלוסייה מחדש במסגרת של פגיעה בכבד מאפשר פרופיל ביטוי גנים של האכלוס מחדש הפטציטים. עם המלכודת, סוג תא ספציפי לתרגם mRNA הוא במהירות וביעילות מבודד. פיתחנו שיטה אשר משתמשת מלכודת עם אהדה מבוססת בידוד של תרגום mRNA מ hepatocytes כי באופן סלקטיבי לבטא את חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויג חלבון ריבוזומבית (RP), GFP: RPL10A. ההשמנה מפעילה את פרק הזמן הארוך הנדרש למיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית שיכולה לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. יתר על כן, מאז רק האכלוס מחדש של hepatocytes לבטא GFP: RPL10A היתוך חלבון, mRNA המבודד הוא נטול זיהום של hepatocytes הפצועים שמסביב וסוגי תאים אחרים בכבד. MRNA מטוהר האהדה הוא באיכות גבוהה ומאפשר במורד הזרם PCR או התפוקה הגבוהה ניתוח מבוסס רצף של ביטוי גנים.

כדי לפרופיל ביטוי הגנים באכלוס מחדש של hepatocytes של פה -/- עכבר, gfp: Rpl10a fusion ו- פה transgenes מועברים בתוך הטרנספסון המכיל את הפלסטיק8 (וקטור המלכודת) לכבד על ידי הזרקת הידרודינמית(איור 1א). הסרת nitisinone גורמת לפציעה בכבד רעיל ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

עם TRAP-seq, אנו יכולים לבודד את ה- RNA מסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes אכלוס מחדש בכבד פצוע כדי לנתח את השינויים ביטוי הגנים המתרחשים בתאים אלה. זה לא דורש שום צעדים כדי להסיר תאים לא רצויים מן הרקמה. ה- RNA הספציפי לסוג התא מבודד על ידי טיהור זיקה מילים שלם של איברים.טכניקה זו מסייעת לנו לקבוע כיצד תאים ספציפיים מגיבים לפציעות, אשר יכול לעזור לזהות אסטרטגיות חדשות או תרופות להילחם במחלות כבד. זה יכול לשמש כדי לזהות כיצד תאי הכבד מגיבים סוגים שונים של פציעות בכבד. נכון לעכשיו, יש מעט אפשרויות לפציעות כבד חמורות ושיטת זה יעזור לרמוז לנו על טיפולים חדשים.מקורה של שיטה זו במוח. בכבד, דמיינו שזה יכול לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים במגוון סוגי תאים, hepatocytes, תאי צינור המרה, תאי קופפר, ותאי אנדותל שם כמה. מדגימה את ההליך תהיה אמבר וונג, סטודנטית לתואר שני והתלמידה שלי.כדי להתחיל, תן שימוש חוזר חרוזים מגנטיים על ידי צינורות עדינים. לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להסיר את צינור microcentrifuge מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS, ואחריו צינור למעלה ולמטה לשטוף את חרוזים.מניחים את הצינור בחזרה על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת כדי לאסוף את חרוזים ולהסיר את PBS. להכנת גם 16 מיקרוליטרים של חלבון ביוטינילציה L לחרוזים המגנטיים המתווסתים ושטופים ומוסיפים 1X PBS כדי להפוך את הנפח הסופי למיליליטר אחד, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, או 1.5 מיליליטר, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. הדגירה את חרוזים מגנטיים עם חלבון biotinylated L במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב צינור.לאחר מכן, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את החלבון L מצופה חרוזים. מוציאים את צינור המיקרוצנטריפוגה מהעמוד המגנטי ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS עם חיץ של 3%BSA, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים כדי לשטוף את קדילי החלבון מצופים L. שוב, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את חרוזים מצופים.חזור על שטיפת BSA עוד ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוגרם נוגדנים לנוגדן GFP 19C8 ונוגדן GFP 19F7 כל אחד לתוך חרוזי החלבון מצופה L, והדגירה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס על מסובב צינור. כדי לאסוף את מטריצת הזיקה, מניחים את הצינור על המגנטי במשך יותר מדקה אחת ומסירים את העל-טבעי.קח את הצינור מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ מלח נמוך. יש לשטוף בעדינות את מטריצת הזיקה ולחזור על שטיפת המאגר עם המלח הנמוך פעמיים נוספות. תוכלו להשתמש מחדש ב-200 מיקרוליטרים של מאגר מלח נמוך, כדי ליצור 200 מיקרוליטרים של מטריצת אהדה.ראשית, להגדיר את מטחנת הרקמות, כך צינורות זכוכית PTFE ניתן להציב על קרח במהלך הומוגניזציה. מלא ארבעה מיליליטר של חיץ תזה קרה לתוך צינורות הזכוכית PTFE. מניחים את הכבד על צלחת פטרי.השתמש בסכין כדי לבודד 200 עד 500 מיליגרם של חתיכות כבד ולעבור לתוך צינורות זכוכית PTFE. מניחים את רקמת הכבד הנותרת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש והקפאת פלאש בחנקן נוזלי. הומוגניזציה של הדגימות homogenizer מונחה מנוע, החל מ 300 סל"ד עבור לפחות חמש משיכות כדי לנתק hepatocytes ממבנה הכבד.מנמיך את צינור הזכוכית בכל פעם. מניעת aeration, אשר יכול לגרום denaturation חלבון, על ידי שמירה על העלי מתחת לפתרון. לאחר מכן, להעלות את המהירות ל 900 סל"ד כדי הומוגניזציה מלאה של רקמות הכבד לפחות 12 משיכות מלאות.מעבירים את ה-lysate לצינורות מסומנים ומצוננים מראש עם לא יותר ממיליליטר של ליט כל אחד. כדי להתחיל תמוגה גרעינית, צנטריפוגה הכבד lysate ב 2, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את העל טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה מצונן מראש חדש על קרח. הוסיפו 1/9 מהנפח העל-טבעי של 10%NP-40 לצינור המיקרוצנטריפוגה על הקרח וערבבו את הפתרון על ידי היפוך עדין של הצינור.סובבו במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה עם מיני צנטריפוגה והוסיפו 1/9 מנפח הדגימה של 10%DOC. מערבבים על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרוצנטריפוגה ומסובבים במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה והדגירה על הקרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ליאזט גרעיני ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את העל טבעי צינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש חדש על קרח.עבור כל צינור, להוציא 1% מהנפח הכולל של העל-טבעי כבקרה טרום אימונו-אימונpreציפציציה. מניחים את פקדי הקדם-אימונו-ציפציה על מסובב צינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לדאוג במיוחד כדי לעכל בעדינות את מטריצת הזיקה על-ידי צינורות, ולאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטרים לכל דגימה.דגירה lysates בארבע מעלות צלזיוס לילה עם ערבוב עדין על מסובב צינור. כדי לבודד RNA, במהירות לסובב את הצינורות המכילים את lysates בצנטריפוגה מיני ולאסוף את חרוזים על ידי הנחת על המדף המגנטי לפחות דקה אחת. אסוף את העל-טבעי בצינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ מלח גבוה טרי לכל צינור, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים מבלי להציג בועות. לאסוף את חרוזים על לעמוד מגנטי על הקרח במשך יותר מדקה ולהסיר את supernatant. חזור על שלבי הכביסה ארבע פעמים נוספות.לאחר מכן, להסיר את צינורות microcentrifuge מהעמוד המגנטי מקום בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להתחמם. תן מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר תיזה עם 0.7 מיקרוליטרים של בטא-מרפטואתנול כדי לשחרר רנ"א כבול ממטריצת הזיקה. מערבולת הצינורות למשך חמש שניות לפחות במהירות הגבוהה ביותר ומסתובבים במהירות למטה.לאחר מכן, הדגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי לפחות דקה אחת, ואז לאסוף את supernatant ולהמשיך מיד ניקוי RNA על פי פרוטוקול טיהור RNA בערכה. כדי להשיג איכות מרבית של ה- RNA המבודד, בצע את כל השלבים האופציונליים, כולל עיכול DNase וכל שלבי האלוטיון של RNA, כולל ההתחממות המוקדמת המומלצת של מאגר האלוטיון ל-60 מעלות צלזיוס.במחקר זה, היתוך GFP-L10A וטרנסגנס פה נמסרו במשותף בתוך וקטור מלכודת פלסמיד המכיל טרנספוזון לכבדים על ידי הזרקה הידרודינמית. הסרת nitisinone גרמה לפגיעה בכבד רעיל. כתמי שפעת חיסונית אישרו את הדו-דיכוי של חלבון ההיתוך FAH ו- GFP-L10A ואת ההפטוציטים המאכלסים מחדש לאחר שבועיים של אכלס מחדש את הכבד.דגימת ההפוגה ייצרה את התשואה הגבוהה ביותר של חלבון היתוך, שכן כל ההפטוציטים מבטאים GFP-L10A לאחר הזרקת AAV8-TBG-Cre. לעומת זאת, בקושי כל RNA היה מזוהה בפקדים מסוג פראי שלא היה להם את המשדר GFP-L10A, המציין את הליך TRAP הוא ספציפי מאוד ויש לו רקע נמוך. כאשר TRAP שימש על רקמת הכבד עובר התחדשות עם hepatocytes מתמר GFP-L10A, RNA באיכות גבוהה בשפע הושג.לעומת זאת, לא זוהה מעקב RNA באמצעות Bioanalyzer עבור מדגם הבקרה השלילית. ביטוי Gsta1 היה המושרה על ידי למעלה מעשרה פי עשרה בהחזרת hepatocytes לעומת hepatocytes התרדה, בעוד ערכי מחזור סף לא זוהה עם RNA מבודד TRAP מעכבר סוג הבר בשל היעדר RNA קלט. כאשר homogenizing הרקמה, הקפד להזיז את העלי לאט כדי למנוע aeration.לאחר בידוד ה- RNA, ניתן לבצע רצף תפוקה גבוהה או qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. עם TRAP-seq, עכשיו יש לנו שיטה לבודד באופן ספציפי RNA מ אכלוס מחדש hepatocytes ולנתח את השינוי בביטוי גנים במהלך אכלוס הכבד. זה מאפשר לנו לזהות גנים שהשתנו במהלך תהליך זה ויעדים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בפגיעה בכבד.Cycloheximide ו DTT, אשר נמצאים במספר מאגרים, שניהם רעילים. יש לאסוף ולהשליך פסולת בהתאם להנחיות המוסדיים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon טכניקה לניתוח של לוקליזציה Cell סוג ספציפי

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...