Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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この作業は、F31-DK113666 (AWW)、K01-DK102868 (AMZ)、K08-DK106478 (KJW)、および P30-DK050306 (KJW へのパイロット補助金) によってサポートされました。

マウスの使用を含むすべての方法は、ペンシルバニア大学のペン動物福祉局のIACUCによって提供されるガイドラインと一致しています。
1. 試薬の調製
<ol><li>
シクロヘキシミド
	<ol>
<li>0.1 g/mLシクロヘキシミドの500 μLを作るために、メタノールの500 μLでシクロヘキシミドの50mgを中断する。 注意:シクロヘキシミドは、環境に非常に有毒であり?...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seqは、エピトープタグ付きリボソームを介してmRNAを翻訳する細胞タイプ特異的な単離のための技術であり、FACS9の時間要件などの制限を回避するFACSアプローチに代わるものを提示する。その代わりに、TRAPはバルク組織から直接RNAを迅速かつ効率的に単離できるため、遺伝子発現の変化を回避できます。TRAP-seqは、ニチシノンの除去後の肝細胞拡張が細胞自律性であり、?...

脊椎動物の主要な代謝器官として、肝臓はグルコース恒常性、血清タンパク質合成、胆汁酸分泌、および異生物代謝および解毒を担当しています。肝臓は、即時肝不全を防ぐために毒素にさらされた場合に負傷したパレンキマを再生する特別な能力を有する1.しかし、再生の失敗は、アセトアミノフェンまたはアルコール過剰摂取の設定で起こり、急性肝不全2を引き起こす可能性がある。さらに、ウイルス性肝炎感染、脂肪肝疾患、および脂肪肝炎によって引き起こされる慢性肝損傷は、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌3を引き起こす可能性がある。終末期肝疾患に対する唯一の利用可能な治癒治療は移植であるが、臓器不足によって制限され、すべての患者に対する効率的な治療を妨げる4.したがって、有毒な肝臓損傷後の回復過程のより良い理解は、病気の臓器の機能を救出するのに十分な再生を刺激する治療法の開発のために重要である。
肝臓再生の研究のための最も広く適用されたモデルシステムは、げっ歯類の部分肝切除術であり、肝臓の大部分が急速な肝細胞拡張を刺激するために切除される5。しかし、部分的肝切除術は、ヒト6における急性肝傷害の設定においてしばしば観察される免疫細胞浸潤および肝細胞壊死の欠如による有毒な肝損傷に続く肝細胞拡張を再発しない。臓器再生のこの形態をモデル化するより適切なシステムは、適切なチロシン代謝に必要な機能性フマリアルセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)を欠き、死亡につながる重度の肝臓損傷を発症するFah-/-マウスである7。これらのマウスは、飲料水中の薬物ニティシネによる治療によって無期限に健康な状態に維持することができる。あるいは、FAH発現は、肝細胞のサブセットへのトランスジーン送達によって復元することができ、これはニティシノン除去8の際に肝臓を再設定するために拡大する。
再入発肝細胞の遺伝子発現変化をプロファイリングするためには、隣接する負傷した肝細胞および他の細胞型から汚染されることなく、Fah-/-マウス中の複製肝細胞を特異的に分離するツールが必要である。残念ながら、(1)肝細胞の再入発性の脆弱性は肝灌流後の回復不良につながり、(2)肝細胞の複製は大きさが大きく変動し、単離を行うため、肝細胞の蛍光補助細胞選別(FACS)は困難である。FACSによる純粋な集団の困難な、および(3)肝臓灌流からRNA単離までの手順時間が2時間を超えるため、遺伝子発現プロファイルは、サンプルが獲得される前に実質的な人工的な変化を受ける可能性がある9。
あるいは、肝細胞の再入発におけるエピトープタグ付きリボソームの発現は、臓器収穫直後の親和性精製を用いてリボソームに結合したmRNAをバルク肝臓で積極的に翻訳する迅速な単離を可能にする。組織は、ライサットします。ここでは、翻訳リボソームアフィニティ精製(TRAP)10に続いてハイスループットRNAシーケンシング(TRAP-seq)を行い、Fah-/--における肝細胞の再入発においてmRNAを特異的に分離およびプロファイルするプロトコルについて説明する。マウス9.FAHと緑色蛍光タンパク質タグ付きリボソームタンパク質(GFP:RPL10A)の共発現により、GFP:RPL10Aを含むポリソームに結合したmRNAの翻訳の親和性精製が可能になります。この方法は、肝細胞の再入発性に脆弱な再入発性を分離するために肝灌流などの細胞解離ステップを回避する。代わりに、臓器組織および抗体全体のリシスを利用して、標的細胞から特異的にRNAを迅速に抽出します。最後に、TRAP-seqを介した豊富で高品質なmRNAの単離により、シーケンシング解析などの下流アプリケーションを使用して、再集団化プロセス中の遺伝子発現の動的変化をプロファイリングすることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

損傷後の肝臓の再集団は、環境毒素の暴露後の即時臓器不全および死亡を防ぐ哺乳類の重要な特徴である。再集団化中に起こる遺伝子発現の変化をより深く理解することは、傷害の設定における肝機能の回復を促進する治療標的の同定に役立つ可能性がある。それにもかかわらず、再入発性肝細胞を特異的に単離する方法は、細胞マーカーの欠如、限られた細胞数、およびこれらの細胞の脆弱性によって阻害される。肝臓損傷の設定で再集団を再キャパチングするFah-/-マウスモデルと連動したリボソームアフィニティ精製(TRAP)技術の開発により、再入生の遺伝子発現プロファイリングが可能肝 細胞。TRAPを使用すると、細胞型特異的翻訳mRNAは迅速かつ効率的に単離されます。緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きリボソームタンパク質(RP)、GFP:RPL10Aを選択的に発現する肝細胞からのmRNAの翻訳を親和性ベースで単離したTRAPを利用する方法を開発した。TRAPは、遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある蛍光活性化細胞選別に必要な長い期間を回避します。さらに、再入発性肝細胞のみがGFP:RPL10A融合タンパク質を発現するので、単離されたmRNAは、肝臓の周囲の負傷した肝細胞および他の細胞型からの汚染を欠いている。親和性精製mRNAは高品質であり、遺伝子発現の下流PCRまたはハイスループットシーケンシングベースの解析を可能にします。

Fah-/-マウスの肝細胞を再移植する遺伝子発現をプロファイリングするために、Gfp:Rpl10a融合およびFahトランスジーンはトランスポゾン含有プラスミド8(TRAPベクター)内で肝臓に共送される流体力学注入 (図 1A)ニチシノンの除去は、負傷したパレンキマ9を再設定するために...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

TRAP-seqを使用すると、負傷した肝臓で再び再び行う肝細胞などの特定の細胞タイプからRNAを分離し、それらの細胞で起こる遺伝子発現変化を分析することができます。組織から不要な細胞を除去するための任意の手順を必要としません。.細胞型特異的RNAは、全臓器ライセートからの親和性精製によって単離される。この技術は、特定の細胞が傷害にどのように反応するかを決定するのに役立ちます, 肝臓病と戦うために新しい戦略や薬物を特定するのに役立ちます.これは、肝細胞が肝傷害の異なるタイプに応答する方法を識別するために使用することができます.現在、重度の急性肝損傷の選択肢はほとんどなく、この方法は新しい治療法を手がかりにするのに役立ちます。この方法は、脳に由来します。肝臓では、様々な細胞タイプ、肝細胞、胆管細胞、クファー細胞、内皮細胞の動的変化を調べるために使用できると思い描きました。手順を実証するには、大学院生のアンバー・ワンと私のメンティーです。まず、穏やかなピペットで磁気ビーズを再中断します。1分以上磁気スタンドにビーズを収集し、上清を取り除きます。次に、マイクロ遠心分離チューブを磁気スタンドから取り出し、PBSを1ミリリットル加え、続いて上下にピペット処理してビーズを洗浄します。チューブを磁気スタンドに1分以上戻し、ビーズを回収し、PBSを取り除きます。タンパク質Lコーティングビーズを調製するには、再懸濁および洗浄された磁気ビーズに16マイクロリットルのビオチン化タンパク質Lを加え、1.5ミリリットルのマイクロセントレンジフュージチューブを使用する場合は1ミリリットル、または2ミリリットルのマイクロ遠心チューブを使用する場合は1.5ミリリットルの最終体積を1ミリリットルにする1X PBSを追加します。ビオチン化タンパク質Lを用いた磁気ビーズをチューブローテーターの室温で35分間インキュベートします。次に、チューブを磁性スタンドに1分以上置き、上澄み液を取り除き、タンパク質Lコーティングビーズを採取します。磁気スタンドからマイクロ遠心分離チューブを取り出し、3%BSAバッファーを含むPBSの1ミリリットルを加え、続いて少なくとも5回穏やかなピペットを加え、タンパク質Lコーティングビーズを洗浄します。再度、1分以上磁気スタンドにチューブを置き、上清を取り除いてコーティングされたビーズを集める。BSAをもう4回洗う。次に、GFP抗体19C8およびGFP抗体19F7に対する抗体をそれぞれタンパク質Lコーティングビーズに50マイクログラム添加し、チューブローテーター上で摂氏4度で1時間インキュベートする。親和性マトリックスを収集するには、チューブを磁気スタンドに1分以上置き、上清を取り除きます。磁性スタンドからチューブを取り除き、低塩バッファーの1ミリリットルを追加します。上下に軽くピレットして親和性マトリックスを洗浄し、低塩バッファーをもう2回洗浄します。低塩バッファーの 200 マイクロリットルにビーズを再懸濁し、200 マイクロリットルの親和性マトリックスを作ります。まず、PTFEガラス管を均質化中に氷の上に置くことができるように組織粉砕機を設置する。4ミリリットルの冷たいライシスバッファーをPTFEガラスチューブに充填します。ペトリ皿の上に肝臓を置きます。ナイフを使って200~500ミリグラムの肝臓片を分離し、PTFEガラス管に移動します。残りの肝臓組織を冷やされたマイクロ遠心分離チューブに入れ、液体窒素でフラッシュフリーズします。肝臓構造から肝細胞を解離するために少なくとも5ストロークの場合、300rpmから始まるモータ駆動ホモジナイザーでサンプルを均質化する。ガラス管を毎回下げなさい。害虫を溶液の下に保つことによって、タンパク質の変性を引き起こす可能性のある通液を防ぎます。次に、少なくとも12の完全な脳卒中のために肝臓組織を完全に均質化するために900 rpmに速度を上げます。ライセートを、それぞれ1ミリリットル以下のラベル付きおよび冷蔵チューブに移します。核リシスを開始するには、肝臓リセートを摂氏4度で2,000倍の10分間遠心し、上清を氷の上の新しい冷蔵マイクロ遠心チューブに移します。氷上のマイクロ遠心分離管に10%NP-40の上清体積の1/9分を加え、チューブをそっと反転させて溶液を混ぜます。ミニ遠心分離機でマイクロ遠心チューブを素早く回転させ、サンプル量の1/9分の1を10%DOCに加え、マイクロ遠心チューブを優しく反転させ、マイクロ遠心チューブを素早く回転させ、氷の上で5分間インキュベートします。核ライゼを摂氏4度で20,000倍の10分間遠心分離し、上清を氷上の新しい冷蔵マイクロ遠心分離管に移す。各チューブについて、免疫沈降制御前として上清の総体積の1%を取り出す。一晩摂氏4度のチューブ回転器に免疫前沈降制御を置きます。ピペット処理で親和性マトリックスを穏やかに再中断し、各サンプルに200マイクロリットルを加えます。チューブ回転機に穏やかな混合で一晩摂氏4度でライセートをインキュベートします。RNAを単離するには、ミニ遠心分離機にライゼートを含むチューブを素早く回転させ、少なくとも1分間磁気ラックに置いてビーズを回収します。追加のマイクロ遠心チューブに上清を収集します。各チューブに新鮮な高塩バッファーを1ミリリットル加え、その後、泡を導入せずに少なくとも5回は穏やかなピペットを加えます。氷上の磁気スタンドにビーズを1分以上集め、上清を取り除きます。洗浄手順をさらに4回繰り返します。次に、磁気スタンドからマイクロ遠心チューブを取り出し、室温で5分間温めます。0.7マイクロリットルのβ-メルカプトエタノールでビーズを100マイクロリットルのリシスバッファーに再懸濁し、親和性マトリックスから結合RNAを放出する。最高速度で少なくとも5秒間チューブを渦し、すぐにスピンダウンします。その後、室温でチューブを10分間インキュベートする。チューブを磁気スタンドに少なくとも1分間置き、上清を回収し、キット内のRNA浄化プロトコルに従ってすぐにRNAクリーンアップに進みます。単離されたRNAの最高品質を達成するために、DNase消化および60°Cへの溶出バッファーの推奨予熱を含むすべてのRNA溶出ステップを含むすべての任意のステップを実行します。本研究では、GFP-L10A融合とFahトランス遺伝子を、トランスポゾン含有プラスミドトラップベクター内で流体力学的注射によって肝臓に共送した。ニティシニンの除去は、有毒な肝障害を誘発した。免疫蛍光染色は、2週間の肝臓再集団の後にFAHとGFP-L10A融合タンパク質および再ポピュレーション肝細胞の共発現を確認した。静止サンプルは、すべての肝細胞がAAV8-TBG-Cre注射後にGFP-L10Aを発現するため、融合タンパク質の最高収率を生み出した。逆に、GFP-L10Aトランスジーンを持たない野生型コントロールでは、ほとんどRNAが検出可能ではなく、TRAP手順が非常に特異的でバックグラウンドが低いことを示しています。TRAPをGFP-L10A導入肝細胞で再集団化した肝臓組織に使用した場合、豊富な高品質RNAが得られた。対照的に、陰性対照試料のバイオアナライザを介してRNAトレースは検出されなかった。Gsta1発現は、静止肝細胞と比較して肝細胞を再導入する際に10倍以上に誘導されたが、入力RNAの欠如のために野生型マウスからのTRAP分離RNAでは閾値サイクル値は検出されなかった。組織を均質化する際には、気圧を防ぐために、害虫をゆっくりと動かしてください。RNAを単離した後、ハイスループットシーケンシングまたはqPCRを行い、遺伝子発現を解析することができる。TRAP-seqでは、RNAを肝細胞の再導入から特異的に分離し、肝臓再集団における遺伝子発現の変化を解析する方法を有するようになりました。これにより、このプロセス中に変化する遺伝子と肝臓損傷の治療のための潜在的な治療標的を同定することができます。シクロヘキシミドとDTTは、いずれも毒性がある。廃棄物は、制度上のガイドラインに従って回収し、廃棄する必要があります。

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