Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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이 작품은 F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), P30-DK050306 (KJW에 대한 파일럿 보조금)에 의해 지원되었습니다.

마우스의 사용을 관련시키는 모든 방법은 펜실베니아 대학에 있는 동물 복지의 펜트 오피스의 IACUC에 의해 제공된 지침과 일치합니다.
1. 시약 준비
<ol><li>
사이클로색시미드
	<ol>
<li>0.1 g/mL 사이클로헨시미드 500 μL을 만들려면 50 mg의 사이클로헵시미드를 메탄올 500 μL에 일시 중단하십시오. 주의 사항: 사이클로육시미드는 환경에 매우 독성이 있으...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq는 에피토프 태그리보솜을 통해 mRNA를 번역하는 세포 유형별 격리를 위한 기술이며 FACS9의시간 요구 사항과 같은 제한을 우회하기 때문에 FACS 접근법에 대한 대안을 제시한다. 대신, TRAP은 대량 조직에서 직접 RNA의 신속하고 효율적인 격리를 허용, 유전자 발현에 있는 어떤 변경든지 피하는 것을 돕습니다. TRAP-seq는 특히 다시 채우는 Fah-/- 마우스 간에서 사용...

척추 동물의 주요 대사 기관으로, 간은 포도 당 항상성에 대 한 책임, 혈 청 단백질 합성, 담 즙 산 분 비, 그리고 xenobiotic 물질 대사 와 해독. 간은 즉각적인 간 부전을 방지하기 위해 독소에 노출시 부상당한 자렌치를 재생하는 특별한 능력을 가지고1. 그러나, 재생의 실패는 급성 간 기능 부전으로 이어질 수있는 아세트 아미노 펜 또는 알코올 과소비의 설정에서 발생할 수 있습니다2. 또한, 바이러스성 간염 감염, 지방간 질환 및 지방 간염으로 인한 만성 간 손상은 간 섬유증, 간경변 및 간세포 암종을 일으킬 수 있습니다3. 말기 간 질환에 대한 유일한 치료 치료는 이식이지만 장기 부족에 의해 제한되어 모든 환자에 대한 효율적인 치료를방지4. 따라서 독성 간 손상 후 회복 과정을 더 잘 이해하는 것은 병들린 장기의 기능을 구출하기에 충분한 재생을 자극하는 치료법의 개발에 중요합니다.
간 재생 연구를 위한 가장 광범위하게 적용된 모델 시스템은 설치류의 부분 간절제술이며, 이 때 간장의 상당 부분이 절제되어 급속한 간세포 팽창을자극한다 5. 그러나, 부분 간절제술은 인간에서 급성 간 손상의 설정에서 종종 관찰되는 면역 세포 침윤 및 간세포 괴사의 부족으로 인한 독성 간 손상에 따른 간세포 팽창을 되풀이하지 않는다6. 장기 재생의이 형태를 모델링하는 더 적합한 시스템은 Fah-/- 마우스, 이는 적절한 티로신 대사에 필요한 기능적 fumarylacetoacetatetatehydrolase (FAH)가 부족하고 죽음에 이르는 심각한 간 손상을 개발7. 이들 마우스는 식수에서 니티시논의 약물로 치료함으로써 무기한 건강한 상태로 유지될 수 있다. 대안적으로, FAH 발현은 간세포의 서브세트로의 이식유전자 전달에 의해 복원될 수 있으며, 이는 니티시노네 제거 시 간을 다시 채우도록 확장될 것이다8.
간세포 를 다시 채우는 유전자 발현 변화를 프로파일링하기 위해, 이웃의 부상당한 간세포 및 기타 세포 유형으로부터의 오염 없이Fah-/- 마우스에서 복제 된 간세포를 구체적으로 분리하는 도구가 필요합니다. 불행하게도, 간세포의 형광 보조 세포 선별 (FACS)은 (1) 간 관류 후 가난한 회복으로 이어지기 때문에 어렵고, (2) 간세포를 복제하는 것은 크기가 매우 다양하여 격리를 만듭니다. FACS에 의한 순수한 집단의 어렵고, (3) 간 관류에서 RNA 격리까지의 절차 시간이 2시간보다 크므로, 따라서 유전자 발현 프로파일은 샘플이 획득되기 전에 상당한 인공 변화를 겪을 수 있다9.
양자구를 다시 채우는 데 에피토프 태그가 달린 리보솜의 발현은 장기 수확 직후, 대량 간으로 리보솜에 의해 결합된 리보솜에 의한 mRNA를 능동적으로 번역하는 신속한 분리를 허용한다. 조직이 lysates. 여기서, 우리는 번역-리보솜 친화도 정제(TRAP)10을 수행하고 고처리량 RNA-seq(TRAP-seq)를 수행하는 프로토콜을 설명하고, Fah에서간세포를 재채우시에서 mRNA를 구체적으로 분리및 프로파일링하는 데있다.-- 마우스9. FAH를 가진 녹색 형광 단백질 태그 리보솜 단백질 (GFP:RPL10A)의 공동 발현은 GFP:RPL10A를 포함하는 폴리좀에 의해 결합된 mRNA번역의 친화도 정제를 허용합니다. 이 방법은 간 관류와 같은 모든 세포 해리 단계를 피하여 간세포를 다시 채우는 연약한 것을 분리합니다. 대신, 그것은 표적으로 한 세포에서 RNA를 급속하게 추출하기 위하여 전체 기관 조직 및 항체의 lysis를 이용합니다. 마지막으로 TRAP-seq를 통해 풍부하고 고품질의 mRNA를 분리하면 시퀀싱 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션을 통해 재수집 프로세스 중에 유전자 발현의 동적 변화를 프로파일링할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

상해 후에 간 재인구는 환경 독소의 노출 후에 즉각적인 기관 실패 그리고 죽음을 방지하는 포유동물의 중요한 특징입니다. 재인구 도중 생기는 유전자 발현에 있는 변경의 더 깊은 이해는 상해의 조정에 있는 간 기능의 회복을 승진시키기 위하여 치료 표적을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고, 재채백 간세포를 구체적으로 분리하는 방법은 세포 마커의 부족, 제한된 세포 수, 및 이들 세포의 취약성에 의해 억제된다. Fah -/- 마우스 모델과 함께 리보솜 친화성 정제(TRAP) 기술을 번역하여 간 손상 설정에서 재인구를 재추정할 수 있도록 하여 재채우기의 유전자 발현 프로파일링을 허용합니다. 간세포. TRAP을 사용하면 세포 유형별 번역 mRNA가 신속하고 효율적으로 분리됩니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)태그 리보좀 단백질 (RP), GFP :RPL10A를 선택적으로 발현하는 간세포에서 mRNA를 번역하는 친화성 기반 격리와 TRAP을 활용하는 방법을 개발했습니다. TRAP은 유전자 발현 단면도를 바꿀 수 있는 형광 활성화 세포 선별에 필요한 긴 기간을 우회한다. 더욱이, 재채백 된 간세포만이 GFP:RPL10A 융합 단백질을 발현하기 때문에, 단리된 mRNA는 주변의 부상당한 간세포 및 간에서 다른 세포 유형으로부터의 오염이 결여된다. 친화도 정제 mRNA는 고품질이며 다운스트림 PCR- 또는 고처리량 시퀀싱 기반 유전자 발현 분석을 허용합니다.

Fah-/- 마우스의 간세포를 다시 채우는 유전자 발현을 프로파일링하기 위해, Gfp:Rpl10a 융합 및 Fah 트랜스게전유전자는 트랜스포종 함유 플라스미드8(TRAP 벡터) 내에서 간으로 공동 전달된다. 유체 역학 주입(그림 1A). 니티시돈의 제거는 부상당한 자렌치마를 다시 채우기 위해 FAH를 안정적으로 ?...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

TRAP-seq를 사용하면, 우리는 그 세포에서 발생하는 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 부상당한 간에서 다시 채우는 간세포와 같은 특정 세포 유형으로부터 RNA를 분리할 수 있습니다. 그것은 조직에서 원치 않는 세포를 제거하는 어떤 단계를 필요로하지 않습니다. 세포 유형별 RNA는 전체 장기 용해로부터의 친화성 정화에 의해 격리된다.이 기술은 우리가 특정 세포가 상해에 어떻게 반응하는지 결정하는 것을 돕습니다, 이는 간 질병을 싸우기 위하여 새로운 전략 또는 약을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 간 세포 간 부상의 다른 종류에 응답 하는 방법을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 현재, 심각한 급성 간 부상에 대 한 몇 가지 옵션이 있으며이 방법은 새로운 치료에 우리를 단서 하는 데 도움이 될 것입니다.이 방법은 뇌에서 유래. 간에서, 우리는 몇몇 이름을 하기 위하여 세포 모형, 간세포, 담즙 덕트 세포, Kupffer 세포 및 내피 세포의 다이내믹한 변경을 검토하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 구상했습니다. 절차를 시연하는 것은 앰버 왕, 대학원생 및 내 멘티가 될 것입니다.시작하려면 부드러운 파이펫팅으로 자기 구슬을 다시 중단합니다. 자기 스탠드에서 구슬을 1분 이상 수집하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 자기 스탠드에서 미세 원심 분리기를 제거하고 PBS의 1 밀리리터를 넣고 구슬을 씻기 위해 위아래로 피펫팅합니다.튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 다시 배치하여 구슬을 수집하고 PBS를 제거합니다. 단백질 L 코팅 구슬을 준비하려면 16 마이크로리터의 바이오티니드 단백질 L을 재일시 및 세척된 마그네틱 비즈에 추가하고 1.5밀리리터 미세 센트리슈지 튜브 또는 1.5 밀리리터를 사용하는 경우 1X PBS를 추가하여 2밀리리터 미세 심선 분리기를 사용하는 경우 최종 볼륨을 1밀리리터로 만듭니다. 자기 구슬을 생체개화 단백질 L로 배양하여 튜브 회전기의 실온에서 35분 간 배양합니다.그런 다음, 튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 놓고 상체를 제거하여 단백질 L-코팅 구슬을 수집합니다. 마그네틱 스탠드에서 마이크로센심심분리기 튜브를 제거하고 3%BSA 버퍼로 PBS 1밀리리터를 추가한 다음, 단백질 L 코팅 구슬을 세척하기 위해 최소 5회 이상 부드러운 파이펫을 넣습니다. 다시 말하지만, 튜브를 자기 스탠드에 1 분 이상 놓고 코팅 된 구슬을 수집하기 위해 상체를 제거하십시오.BSA세탁을 4번 더 반복합니다. 다음으로, GFP 항체 19C8 및 GFP 항체 19F7을 위한 항체 50 마이크로그램을 단백질 L 코팅 구슬에 각각 추가하고, 튜브 회전기에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한다. 친화성 매트릭스를 수집하려면 튜브를 자기 스탠드에 1분 이상 배치하고 상체를 제거합니다.자기 스탠드에서 튜브를 가져 와서 저염 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오. 상하로 부드럽게 파이프를 사용하여 선호도 매트릭스를 세척하고 저염 버퍼를 두 번 더 세척합니다. 200 마이크로리터의 저염 완충제에서 구슬을 재연하여 200마이크로리터의 친화성 매트릭스를 만듭니다.먼저, PTFE 유리 튜브가 균질화 중에 얼음위에 배치될 수 있도록 조직 분쇄기를 설치합니다. PTFE 유리 튜브에 차가운 리시스 버퍼 4밀리리터를 채웁니다. 페트리 접시에 간을 놓습니다.칼을 사용하여 200~500밀리그램의 간 조각을 분리하고 PTFE 유리 튜브로 이동합니다. 나머지 간 조직을 미리 차가운 미세 원심 분리튜브에 넣고 액체 질소에 플래시 동결하십시오. 간 구조에서 간세포화하기 위해 적어도 5개의 뇌졸중을 위해 300rpm부터 시작하여 모터 구동 균질화로 샘플을 균질화합니다.매번 유리 튜브를 낮춥습니다. 유봉을 용액 아래에 두어 단백질 변포화를 일으킬 수 있는 폭합을 방지하십시오. 그런 다음, 속도를 900 rpm으로 올려 적어도 12개의 전체 스트로크에 대한 간 조직을 완전히 균질화합니다.용해를 라벨과 미리 차가운 튜브로 옮기고 1밀리리터 이하의 용하가 없습니다. 핵 용액을 시작하려면 간 용액을 섭리 2, 000 g에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 얼음에 있는 새로운 미리 차가운 미세 원심 분리 튜브로 상체를 옮긴다. 얼음의 미세 원심 분리튜브에 10%NP-40의 상체 부피의 1/9을 넣고 튜브를 부드럽게 반전시켜 용액을 혼합합니다.마이크로원심분리기 튜브를 미니 원심분리기로 빠르게 회전시키고 10%DOC의 시료 부피의 1/9을 추가합니다. 원심분리기핵은 섭씨 4도에서 20배, 000배, 얼음 위에 차가운 미세센심분리기 튜브로 상전자관을 옮긴다.각 튜브에 대해, 면역 전 침전 대조군으로서 상체의 총 부피의 1%를 꺼내십시오. 하룻밤 사이에 튜브 회전기에 면역 강수전 제어를 배치합니다. 파이펫팅을 통해 선호도 매트릭스를 부드럽게 다시 한 번 반복한 다음 각 샘플에 200 마이크로리터를 추가하십시오.하룻밤 사이에 4도에서 튜브 회전기에서 부드러운 혼합으로 lysates를 배양합니다. RNA를 분리하려면 미니 원심분리기에 용액이 들어 있는 튜브를 빠르게 회전시키고 적어도 1분 동안 자기 랙에 배치하여 구슬을 수집합니다. 추가 미세 원심 분리기 튜브에서 상체를 수집합니다.각 튜브에 신선한 고염 버퍼 1밀리리터를 넣고 거품을 도입하지 않고 최소 5회 이상 부드러운 파이펫을 넣습니다. 얼음위에 있는 마그네틱 스탠드의 구슬을 1분 이상 모아 상수포를 제거합니다. 세탁 단계를 4번 더 반복합니다.그런 다음 자기 스탠드에서 미세 원심 분리기를 제거하고 실온에서 5 분 동안 데워지지 않습니다. 비드를 100 마이크로리터의 용액 버퍼에 베타-메카토에탄올의 0.7 마이크로리터로 재연하여 친화성 매트릭스로부터 바운드 RNA를 방출한다. 가장 빠른 속도로 적어도 5초 동안 튜브를 소용돌이쳐 빠르게 회전합니다.그런 다음 실온에서 튜브를 10 분 동안 배양하십시오. 자기 스탠드에 튜브를 1분 이상 놓고, 상체를 수집한 다음 키트내RNA 정화 프로토콜에 따라 RNA 정화로 즉시 진행한다. 절연 된 RNA의 최대 품질을 달성하기 위해, DNase 소화 및 60 섭씨에 용출 버퍼의 권장 예열을 포함하여 모든 RNA 용출 단계를 포함한 모든 선택적 단계를 수행.이 연구에서는, GFP-L10A 융합 및 Fah transgenes는 유체 역학 주입에 의해 간으로 트랜스포슨 함유 플라스미드 트랩 벡터 내에서 공동 전달되었다. 니티시네온의 제거는 독성 간 손상을 유도. 면역형광 염색은 FAH 및 GFP-L10A 융합 단백질및 간 재채우기 2주 후에 재채우기 간세포의 공동 발현을 확인했습니다.모든 간세포가 AAV8-TBG-Cre 주입 후 GFP-L10A를 발현하기 때문에 정지 성 샘플은 퓨전 단백질의 가장 높은 수율을 생산했습니다. 반대로, 거의 모든 RNA는 GFP-L10A 트랜스진이 없는 야생형 대조군에서 검출가능했으며, 이는 TRAP 절차가 매우 특이적이며 배경이 낮다는 것을 나타낸다. TRAP이 GFP-L10A로 재구를 겪고 있는 간 조직에 사용되었을 때 간세포로 변형된 풍부한 고품질 RNA를 얻었다.대조적으로, 부정적인 대조군 견본을 위한 Bioanalyzer를 통해 RNA 추적이 검출되지 않았습니다. Gsta1 발현은 정지 성 간세포에 비해 간구를 다시 채우는 데 10배 이상 유도되었으며, 입력 RNA의 부족으로 인해 야생형 마우스로부터 TRAP 절연 RNA로 임계값 사이클 값이 검출되지 않았다. 조직을 균질화 할 때, 폭기를 방지하기 위해 천천히 유봉을 이동해야합니다.RNA를 격리한 후, 고처리량 시퀀싱 또는 qPCR은 유전자 발현을 분석하기 위해 수행될 수 있다. TRAP-seq를 사용하면 간세포를 다시 채우는 RNA를 구체적으로 분리하고 간 재인구 중 유전자 발현의 변화를 분석하는 방법이 있습니다. 이것은 우리가 간 상해의 처리를 위한 이 프로세스 및 잠재적인 치료 표적 도중 변경되는 유전자를 확인하는 것을 허용합니다.여러 완충제에 존재하는 사이클로헤시미드와 DTT는 모두 독성이 있다. 폐기물은 제도적 지침에 따라 수거및 폐기해야 합니다.

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