Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelas seguintes concessões: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), e p30-DK050306 (concessão do piloto a KJW).

Todos os métodos que envolvem o uso de camundongos são consistentes com as diretrizes fornecidas pelo IACUC do Penn Office de bem-estar animal na Universidade da Pensilvânia.
1. preparação do reagente
<ol><li>
Cicloheximida
	<ol>
<li>Para fazer 500 μL de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspender 50 mg de cicloheximida em 500 μL de metanol. Atenção: A cicloheximida é extremamente tóxica para o meio ambiente e pode causar malformação congênita. Tod...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

A armadilha-seq é uma técnica para o isolamento tipo-específico da pilha de traduzir o mRNA através dos ribossomas epitope-etiquetados e apresenta uma alternativa às aproximações de FACS, porque contorna limitações tais como exigências de tempo de FACS9. Em vez disso, TRAP permite o isolamento rápido e eficiente do RNA diretamente dos tecidos a granel, ajudando a evitar quaisquer alterações na expressão gênica. Trap-seq é especialmente adequado para uso no fígado de repovoamento <...

Como o principal órgão metabólico em vertebrados, o fígado é responsável pela homeostase da glicose, síntese de proteínas séricas, secreção de ácido biliar e metabolismo xenobiótico e desintoxicação. O fígado possui uma extraordinária capacidade de regenerar o parênquima lesionado após a exposição a toxinas para prevenir a insuficiência hepática imediata1. Entretanto, a falha da regeneração pode ocorrer no ajuste do overconsumption do paracetamol ou do álcool, que pode conduzir à falha de fígado aguda2. Além disso, a lesão hepática crônica causada por infecção por hepatite viral, doença hepática gordurosa e esteatohepatite pode causar fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular3. O único tratamento curativo disponível para doença hepática em estágio terminal é o transplante, mas é limitado pela escassez de órgãos, impedindo o tratamento eficiente para todos os pacientes4. Uma melhor compreensão do processo de recuperação após lesão hepática tóxica é, portanto, crucial para o desenvolvimento de tratamentos para estimular a regeneração suficiente para resgatar a função no órgão doente.
O sistema modelo mais amplamente aplicado para o estudo da regeneração hepática é a hepatectomia parcial em roedores, em que uma grande proporção do fígado é ressecada para estimular a rápida expansão do hepatócitos5. No entanto, a hepatectomia parcial não recapitulou a expansão dos hepatócitos após lesão hepática tóxica devido à falta de infiltração de células imunológicas e necrose celular de hepatócitos, muitas vezes observada no ajuste de lesão hepática aguda em humanos6. Um sistema mais adequado para modelar esta forma de renovação de órgãos é o Fah-/- mouse, que carece de fumarilacetoacetato hidrolase funcional (Fah) necessário para o metabolismo da tirosina adequada e desenvolve danos graves no fígado levando à morte7. Estes ratos podem ser mantidos em um estado saudável indefinidamente pelo tratamento com o nitisinona da droga na água bebendo. Alternativamente, a expressão de Fah pode ser restaurada pela entrega do transgene a um subconjunto dos hepatocytes, que expandirá para repovoar o fígado em cima da remoção do nitisinona8.
Para analisar as alterações da expressão gênica de repovoamento de hepatócitos, é necessária uma ferramenta para isolar especificamente os hepatócitos replicantes no Fah-/- mouse sem contaminação dos hepatócitos feridos vizinhos e outros tipos de células. Infelizmente, a triagem celular por fluorescência (FACS) dos hepatócitos é difícil, pois (1) a fragilidade dos hepatócitos que repovoam leva à má recuperação após a perfusão hepática, (2) replicar hepatócitos são altamente variáveis em tamanho, tornando o isolamento de uma população pura por FACS difícil, e (3) o tempo do procedimento da perfusão do fígado ao isolamento do RNA é maior de 2 h, daqui os perfis da expressão de gene podem sofrer mudanças artificiais substanciais antes que as amostras estejam adquiridas9.
Alternativamente, a expressão de ribossomas epitope-etiquetados especificamente em repovoamento hepatócitos permite o isolamento rápido de traduzir ativamente o mRNA limitado por ribossomas usando a purificação da afinidade imediatamente depois da colheita do órgão, com fígado maioria lisados de tecido. Aqui, nós descrevemos um protocolo para executar a purificação da afinidade da traduzir-ribosome (armadilha)10 seguido pelo RNA-seqüenciamento da elevado-produção (armadilha-Seq), para isolar especificamente e perfil mRNA em repovoamento hepatócitos no Fah-/- rato9. A coexpressão da proteína ribossomal proteína-etiquetada verde fluorescente (GFP: RPL10A) com Fah permite a purificação da afinidade de traduzir o mRNA limitado por detectados que contem GFP: RPL10A. Este método evita todas as etapas da dissociação da pilha, tais como a perfusão do fígado para isolar os hepatocytes repovoamento frágeis. Em lugar de, utiliza o lysis do tecido inteiro do órgão e os anticorpos para extrair ràpida o RNA especificamente das pilhas do alvo. Finalmente, o isolamento de mRNA abundante e de alta qualidade via TRAP-Seq permite que aplicações downstream, como a análise de sequenciamento, analisem a mudança dinâmica da expressão gênica durante o processo de repopulação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

O repovoamento do fígado após ferimento é uma característica crucial dos mamíferos que impede a falha imediata do órgão e a morte após a exposição de toxinas ambientais. Uma compreensão mais profunda das mudanças na expressão gênica que ocorrem durante a repovoação poderia ajudar a identificar alvos terapêuticos para promover a restauração da função hepática no cenário de lesões. No entanto, os métodos para isolar especificamente os hepatócitos repovoadores são inibidos pela falta de marcadores celulares, números de células limitados e a fragilidade dessas células. O desenvolvimento de traduzir a tecnologia Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha) conjuntamente com o modelo de Fah-/- mouse para recapitular o repovoamento no ajuste de ferimento de fígado permite o perfilamento da expressão de gene do repovoamento Hepatócitos. Com TRAP, o tipo de célula-específico traduzindo mRNA é rapidamente e eficientemente isolado. Nós desenvolvemos um método que utilize a armadilha com isolação afinidade-baseada de traduzir o mRNA dos hepatócitos que expressam seletivamente a proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetaram a proteína ribosomal (RP), GFP: RPL10A. A armadilha contorna o período de tempo longo exigido para a classificação fluorescência-ativada da pilha que poderia mudar o perfil da expressão de Gene. Além disso, desde que somente os hepatócitos repovoamento expressam a proteína de fusão de GFP: RPL10A, o mRNA isolado é desprovido da contaminação dos hepatócitos feridos circunvizinhos e dos outros tipos da pilha no fígado. O mRNA afinidade-purified é da alta qualidade e permite a jusante PCR-ou a análise sequenciando-baseada high-throughput da expressão de Gene.

Para analisar a expressão gênica no repovoamento de hepatócitos do Fah-/- mouse, GFP: Rpl10a Fusion e Fah transgenes são coentregues dentro de um plasmídeo contendo Transposon8 (Trap vector) para fígados por injeção hidrodinâmica (Figura 1A). A remoção de nitisinona induz uma lesão hepática tóxica que cria uma pressão de seleção para os hepatócitos que expressam e...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Com o TRAP-seq, podemos isolar o RNA de tipos de células específicas, como os hepatócitos repovoando no fígado ferido para analisar as mudanças de expressão genética que ocorrem nessas células. Não requer nenhuma medida para remover células indesejadas do tecido. O RNA específico do tipo celular é isolado pela purificação de afinidade de órgãos inteiros.Essa técnica nos ajuda a determinar como células específicas respondem a lesões, o que poderia ajudar a identificar novas estratégias ou drogas para combater doenças hepáticas. Isso pode ser usado para identificar como as células hepáticas respondem a diferentes tipos de lesões hepáticas. Atualmente, existem poucas opções para lesões hepáticas agudas graves e este método ajudará a nos levar a novos tratamentos.Este método se originou no cérebro. No fígado, imaginamos que poderia ser usado para examinar mudanças dinâmicas em uma variedade de tipos celulares, hepatócitos, células do ducto biliar, células kupffer e células endoteliais para citar alguns. Demonstrando o procedimento será Amber Wang, uma estudante de pós-graduação e minha mentee.Para começar, resuspend contas magnéticas por tubulação suave. Colete as contas em uma posição magnética por mais de um minuto e remova o supernatante. Em seguida, remova o tubo de microcentrifuge do suporte magnético e adicione um mililitro de PBS, seguido de pipetação para cima e para baixo para lavar as contas.Coloque o tubo de volta no suporte magnético por mais de um minuto para coletar as contas e remover o PBS. Para preparar contas revestidas de proteína l, adicione 16 microliters de proteína biotinilada L às contas magnéticas resuspended e lavadas e adicione 1X PBS para fazer o volume final um mililitro, se usar um tubo de microcentrífustração de 1,5 mililitro, ou 1,5 mililitros, se usar um tubo de microcentrítrida de dois mililitros. Incubar as contas magnéticas com proteína biotinilada L por 35 minutos à temperatura ambiente em um rotador de tubo.Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o supernascido para coletar as contas revestidas de proteína L. Remova o tubo de microcentrifuge do suporte magnético e adicione um mililitro de PBS com tampão BSA de 3%, seguido de tubulação suave pelo menos cinco vezes para lavar as contas revestidas de proteína L. Novamente, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o sobrenatante para coletar as contas revestidas.Repita a lavagem da BSA mais quatro vezes. Em seguida, adicione 50 microgramas de anticorpos para anticorpo GFP 19C8 e anticorpo GFP 19F7 cada um nas contas revestidas de proteína L, e incubar por uma hora a quatro graus Celsius em um rotador de tubo. Para coletar a matriz de afinidade, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o supernasal.Retire o tubo do suporte magnético e adicione um mililitro de tampão de baixo sal. Cano suavemente para cima e para baixo para lavar a matriz de afinidade e repetir o tampão de baixo sal lavando mais duas vezes. Resuspenja as contas em 200 microliters de tampão de baixo sal, para fazer 200 microliters de matriz de afinidade.Primeiro, configure o moedor de tecido para que os tubos de vidro PTFE possam ser colocados no gelo durante a homogeneização. Encha quatro mililitros de tampão de lise fria nos tubos de vidro PTFE. Coloque o fígado em uma placa de Petri.Use uma faca para isolar de 200 a 500 miligramas de pedaços de fígado e mover-se para os tubos de vidro PTFE. Coloque o tecido hepático restante em um tubo de microcentrifuge pré-refrigerado e congele em nitrogênio líquido. Homogeneize as amostras em um homogeneizador motorizado, a partir de 300 rpm por pelo menos cinco traçados para dissociar hepatócitos da estrutura hepática.Abaixe o tubo de vidro cada vez. Prevenir a aeração, que poderia causar desnaturação de proteínas, mantendo o pilão abaixo da solução. Em seguida, eleve a velocidade para 900 rpm para homogeneizar totalmente os tecidos hepáticos por pelo menos 12 golpes completos.Transfira o lise em tubos rotulados e pré-refrigerados com não mais do que um mililitro de lise cada. Para iniciar a lise nuclear, centrifugar o fígado lysate a 2.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos, em seguida, transferir o supernascer para um novo tubo de microcentrifuuge pré-refrigerado no gelo. Adicione 1/9 do volume supernacido de 10%NP-40 no tubo de microcentrifuuge no gelo e misture a solução invertendo suavemente o tubo.Gire rapidamente os tubos de microcentrifuuge com uma mini centrífuga e adicione 1/9 do volume amostral de 10%DOC. Misture invertendo suavemente os tubos de microcentrifuuagem e gire rapidamente os tubos de microcentrifuuge e incubar no gelo por cinco minutos. Centrifugar o lise nuclear a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos e transferir o supernascer para novos tubos de microcentrifuuge pré-refrigerados no gelo.Para cada tubo, tire 1% do volume total do supernante como controle pré-imunoprecipitação. Coloque os controles de pré-imunoprecipitação em um rotador de tubo a quatro graus Celsius durante a noite. Tome cuidado extra para resuspensar suavemente a matriz de afinidade por pipetação, em seguida, adicionar 200 microliters a cada amostra.Incubar os lises a quatro graus Celsius durante a noite com mistura suave em um rotador de tubo. Para isolar o RNA, gire rapidamente os tubos contendo os lises na mini centrífuga e colete as contas colocando no rack magnético por pelo menos um minuto. Colete o supernatante em tubos de microcentrifuuagem adicionais.Adicione um mililitro de tampão fresco de sal alto a cada tubo, seguido de tubos suaves pelo menos cinco vezes sem introduzir bolhas. Colete as contas no suporte magnético no gelo por mais de um minuto e remova o supernatante. Repita os passos de lavagem mais quatro vezes.Em seguida, remova os tubos de microcentrifuuagem do suporte magnético e coloque em temperatura ambiente por cinco minutos para aquecer. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lise com 0,7 microliters de beta-mercaptoetanol para liberar RNA vinculado da matriz de afinidade. Vórtice os tubos por pelo menos cinco segundos na velocidade mais alta e rapidamente giram para baixo.Em seguida, incubar os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque os tubos no suporte magnético por pelo menos um minuto, depois colete o supernasce e prossiga imediatamente para a limpeza do RNA de acordo com o protocolo de purificação do RNA no kit. Para alcançar a máxima qualidade do RNA isolado, execute todas as etapas opcionais, incluindo digestão DNase e todas as etapas de elução de RNA, incluindo o pré-aquecimento recomendado do tampão de elução a 60 graus Celsius.Neste estudo, a fusão GFP-L10A e os transgenes Fah foram co-entregues dentro de um vetor de armadilha plasmida contendo transposon para fígados por injeção hidrodinâmica. A remoção de nitisina induziu uma lesão hepática tóxica. A coloração da imunofluorescência confirmou a coexpressão da proteína de fusão FAH e GFP-L10A e dos hepatócitos repovoantes após duas semanas de repopulação hepática.A amostra quiescente produziu o maior rendimento de proteína de fusão, uma vez que todos os hepatócitos expressam GFP-L10A após a injeção de AAV8-TBG-Cre. Por outro lado, quase nenhum RNA era detectável em controles do tipo selvagem que não tinham o transgene GFP-L10A, indicando que o procedimento TRAP é altamente específico e tem um baixo fundo. Quando o TRAP foi usado em tecido hepático submetido à repopulação com hepatócitos transduzidos GFP-L10A, obteve-se RNA abundante de alta qualidade.Em contraste, nenhum traço de RNA foi detectado via Bioanalyzer para a amostra de controle negativo. A expressão gsta1 foi induzida por mais de dez vezes em hepatócitos repovoantes em comparação com hepatócitos quiescentes, enquanto nenhum valor de ciclo limiar foi detectado com RNA isolado trap do rato tipo selvagem devido à falta de RNA de entrada. Ao homogeneizar o tecido, certifique-se de mover o pilão lentamente para evitar a aeração.Após isolar o RNA, o sequenciamento de alta throughput ou qPCR pode ser realizado para analisar a expressão genética. Com o TRAP-seq, agora temos um método para isolar especificamente o RNA de hepatócitos repovoantes e analisar a mudança na expressão genética durante a repopulação hepática. Isso nos permite identificar genes que são alterados durante esse processo e potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de lesões hepáticas.Cicloheximida e DTT, que estão presentes em vários buffers, são ambos tóxicos. Os resíduos devem ser coletados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

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