Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Эта работа была поддержана следующими грантами: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (АМЗ), K08-DK106478 (KJW) и P30-DK050306 (пилотный грант KJW).

Все методы, связанные с использованием мышей, согласуются с руководящими принципами, предусмотренными IACUC Управления пенна по защите животных при Университете Пенсильвании.
1. Подготовка реагента
<ol><li>
Циклогексид
	<ol>
<li>Чтобы сделать 500 л 0,1 г/мл циклогексидида, ...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq является методом для клеточного типа-специфической изоляции перевода мРНК через эпитоп-тегами рибосомы и представляет собой альтернативу faCS подходов, так как он обходит ограничения, такие как временные требования FACS9. Вместо этого, TRAP позволяет быстрой и эффективной ...

Как основной метаболический орган у позвоночных, печень отвечает за гомеостаз глюкозы, синтез белка сыворотки, секрецию желчных кислот, ксенобиотический метаболизм и детоксикацию. Печень обладает чрезвычайной способностью к регенерации травмированной паренхимы при воздействии токсинов, чтобы предотвратить немедленную печеночную недостаточность1. Однако сбой регенерации может произойти при возникновении ацетаминофена или алкогольного чрезмерного потребления, что может привести к острой печеночной недостаточности2. Кроме того, хроническая травма печени, вызванная вирусной инфекцией гепатита, жировой болезнью печени и стеатогепатитом, может вызвать фиброз печени, цирроз и гепатоцеллюлялическую карциному3. Единственным доступным лечебным лечением заболевания печени на конечном этапе является трансплантация, но она ограничена нехваткой органов, что препятствует эффективному лечению для всех пациентов4. Более глубокое понимание процесса восстановления после токсической травмы печени, следовательно, имеет решающее значение для развития лечения, чтобы стимулировать регенерацию достаточно, чтобы спасти функцию в больном органе.
Наиболее широко применяемой модельной системой для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия у грызунов, при которой значительная часть печени резецируется для стимуляции быстрого расширения гепатоцитов5. Тем не менее, частичная гепатэктомия не резюмирует расширение гепатоцитов после токсической травмы печени из-за отсутствия инфильтрации иммунных клеток и некроза клеток гепатоцитов, часто наблюдаемых при установлении острой травмы печени у людей6. Более подходящей системой для моделирования этой формы обновления органов является Fah-/- мышь, которая не имеет функциональной гидролазы фумарицетоацета (FAH), необходимой для правильного метаболизма тирозинов и развивает серьезные повреждения печени, приводящие к смерти7. Эти мыши могут поддерживаться в здоровом состоянии на неопределенный срок путем лечения препаратом нитинон в питьевой воде. Кроме того, выражение FAH может быть восстановлено трансгенной доставкой в подмножество гепатоцитов, которые будут расширяться, чтобы заселить печень после удаления нитисинона8.
Для профиля изменения экспрессии генов перенаселенности гепатоцитов, инструмент для специального изолировать репликации гепатоцитов в Фах-/- мышь без загрязнения от соседних раненых гепатоцитов и других типов клеток не требуется. К сожалению, флуоресценция при содействии клеточной сортировки (FACS) гепатоцитов трудно, так как (1) хрупкость перенаселенности гепатоцитов приводит к плохому восстановлению после перфузии печени, (2) репликации гепатоцитов весьма изменчивы по размеру, что делает изоляцию чистой популяции FACS трудно, и (3) процедура время от перфузии печени до изоляции РНК больше, чем 2 ч, следовательно, профили экспрессии генов могут претерпеть существенные искусственные изменения, прежде чем образцы приобретены9.
Кроме того, выражение эпитоп-тегами рибосом, специально в перенаселенности гепатоцитов позволяет быстро изоляции активно перевод яРНК связаны рибосомы с помощью сродства очистки сразу после сбора органов, с объемной печени тл. Здесь мы описываем протокол для выполнения очистки сродства с сородия для перевода (TRAP)10 с последующим высокой пропускной способностью РНК-секвенирования (TRAP-seq), чтобы специально изолировать и профиль мРНК в перенаселенности гепатоцитов в Фах-/- мышь9. Коэкспрессия зеленого флуоресцентного белка помечены рибосомный белок (GFP:RPL10A) с FAH позволяет сродство очистки перевода мРНК связаны полисомы, содержащие GFP:RPL10A. Этот метод позволяет избежать любых клеточных этапов диссоциации, таких как перфузия печени, чтобы изолировать хрупкие перенаселенности гепатоцитов. Вместо этого, он использует лисис целой ткани органа и антител, чтобы быстро извлечь РНК специально из клеток-мишеней. Наконец, изоляция обильной, высококачественной мРНК через TRAP-seq позволяет приложениям вниз по течению, таким как анализ секвенирования, профилировать динамическое изменение экспрессии генов в процессе перенаселения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Репопуляция печени после травмы является важной особенностью млекопитающих, которая предотвращает немедленную отказ органов и смерть после воздействия токсинов окружающей среды. Более глубокое понимание изменений в экспрессии генов, которые происходят во время репопуляции может помочь определить терапевтические цели для содействия восстановлению функции печени в обстановке травм. Тем не менее, методы изоляции конкретно перенаселенности гепатоцитов тормозятся отсутствием клеточных маркеров, ограниченным и хрупкость этих клеток. Развитие технологии очистки рибосомы сродства (TRAP) в сочетании с моделью мыши для повторения репопуляции при настройке травмы печени позволяет профилировать экспрессию генов в перенаселенности Гепатоцитов. С TRAP, тип клеток конкретных перевода мРНК быстро и эффективно изолированы. Мы разработали метод, который использует TRAP с сродством основе изоляции перевода мРНК от гепатоцитов, которые избирательно выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) помечены рибосомный белок (RP), GFP:RPL10A. TRAP обходит длительный период времени, необходимый для сортировки клеток, активированных флуоресценцией, который может изменить профиль экспрессии гена. Кроме того, поскольку только перенаселенности гепатоцитов выражают GFP:RPL10A синтез белка, изолированные мРНК лишен загрязнения от окружающих поврежденных гепатоцитов и других типов клеток в печени. Сродство очищенной мРНК имеет высокое качество и позволяет ниже по течению ПЦР- или высокой пропускной способности на основе анализа экспрессии генов.

Для профиля экспрессии генов в перенаселенности гепатоцитов Фах-/- мышь, Gfp:Rpl10a слияния и Fah трансгены совместно доставлены в транспозон-содержащих плазмид8 (TRAP вектор) к печени гидродинамический впрыск(рисунок 1A).</st...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Перевод рибосомной очистки сродства (TRAP) обеспечивает быструю и эффективную изоляцию клеточного типа переноса мРНК. Здесь мы демонстрируем метод, который сочетает в себе гидродинамические инъекции хвостовой вена в мышиной модели репопуляции печени и TRAP для изучения экспрессии профиля перенаселенности гепатоцитов.

Сотовый тип-специфический Джин Выражение Профилирование в печени мыши

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

С ПОМОЩЬю TRAP-seq мы можем изолировать РНК от определенных типов клеток, таких как гепатоциты, заселяющиеся в поврежденную печень, чтобы проанализировать изменения экспрессии генов, происходящие в этих клетках. Он не требует каких-либо шагов для удаления нежелательных клеток из ткани. Клеточная РНК, специфичная для клеток, изолирована от очищения сродства от лизолатов всего органа.Этот метод помогает нам определить, как конкретные клетки реагируют на травмы, которые могли бы помочь определить новые стратегии или препараты для борьбы с заболеваниями печени. Это может быть использовано для определения того, как клетки печени реагировать на различные типы травм печени. В настоящее время Есть несколько вариантов для тяжелых острых травм печени, и этот метод поможет ключ нас к новым лечения.Этот метод возник в головном мозге. В печени, мы предполагали, что он может быть использован для изучения динамических изменений в различных типах клеток, гепатоцитов, желчных клеток протоков, клеток Купфера, и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. Демонстрацией процедуры будет Эмбер Ван, аспирант и мой подоный.Для начала, resuspend магнитные бусины нежным пипетки. Соберите бисер на магнитной подгоке в течение более одной минуты и удалить супернатант. Затем снимите трубку микроцентрифуга с магнитного стенда и добавьте один миллилитр PBS, а затем трубчатые вверх и вниз, чтобы вымыть бисер.Поместите трубку обратно на магнитный стенд в течение более одной минуты, чтобы собрать бисер и удалить PBS. Для приготовления белка L-покрытие бисера, добавить 16 микролитров биотинилированного белка L в перерасход и промытые магнитные бусины и добавить 1X PBS, чтобы сделать окончательный объем один миллилитр, при использовании 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки, или 1,5 миллилитров, при использовании двухмилилитровой микроцентрифуг трубки. Инкубировать магнитные бусы биотинилированным белком L в течение 35 минут при комнатной температуре на трубчатом ротаторе.Затем поместите трубку на магнитный стенд в течение более одной минуты и удалите супернатант, чтобы собрать белок L-покрытые бисером. Удалите трубку микроцентрифуга с магнитного стенда и добавьте один миллилитр PBS с буфером 3%BSA, а затем нежный пипетки по крайней мере пять раз, чтобы вымыть белок L-покрытием бисера. Опять же, поместите трубку на магнитный стенд в течение более одной минуты и удалить супернатант, чтобы собрать покрытием бисера.Повторите промывку BSA еще четыре раза. Затем добавьте 50 микрограммов антител к антителам GFP 19C8 и GFP антитела 19F7 каждый в белок L-покрытые бусины, и инкубировать в течение одного часа при четырех градусах цельсия на трубчатом ротаторе. Чтобы собрать матрицу сродства, поместите трубку на магнитный стенд более чем на одну минуту и удалите супернатант.Возьмите трубку от магнитного стенда и добавьте один миллилитр низкосоленого буфера. Аккуратно трубят вверх-вниз, чтобы вымыть матрицу сродства и повторить низкосолевой буфер мыть еще два раза. Перезаполнить бисер в 200 микролитров низкосоленого буфера, чтобы сделать 200 микролитров матрицы сродства.Во-первых, настроить ткань шлифовальной машины так, что PTFE стеклянные трубки могут быть размещены на льду во время гомогенизации. Заполните четыре миллилитров холодного лиза буфера в стеклянные трубки PTFE. Положите печень на чашку Петри.Используйте нож, чтобы изолировать от 200 до 500 миллиграммов кусочков печени и перейти в PTFE стеклянные трубки. Поместите оставшуюся ткань печени в предварительно охлажденную микроцентрифугную трубку и заморозьте в жидком азоте. Гомогенизировать образцы в мотор-управляемый гомогенизатор, начиная с 300 об / мин, по крайней мере пять ударов, чтобы отмежеваться гепатоцитов от структуры печени.Каждый раз опустите стеклянную трубку. Предотвратить аэрацию, которая может вызвать денатурацию белка, сохраняя пестик ниже раствора. Затем поднимите скорость до 900 об/мин, чтобы полностью гомогенизировать ткани печени, по крайней мере 12 полных ударов.Перенесите лизат в помеченные и предварительно охлажденные трубки с не более чем одним миллилитром лизата каждый. Чтобы начать ядерныйлиз, центрифуга печени лизать на 2000 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем передать супернатант в новый предварительно охлажденный микроцентрифуг трубки на льду. Добавьте 1/9th из supernatant тома 10%NP-40 в пробку микроцентрифуга на льду и смешайте разрешение путем нежно инвертировать пробку.Быстро спина вниз микроцентрифуг трубки с мини центрифугой и добавить 1/9th объема выборки 10%DOC. Смешайте, мягко инвертирование микроцентрифуг труб и быстро спина вниз микроцентрифуг труб и инкубировать на льду в течение пяти минут. Центрифуга ядерного лизатата на 20000 раз г при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут и передачи супернатанта в новые предварительно охлажденные микроцентрифуг трубки на льду.Для каждой трубки вынюхив 1% от общего объема супернатанта в качестве контроля пре-иммунопреципиентации. Поместите преддеммупрессивный контроль на трубчатый ротатор при четырех градусах Цельсия за одну ночь. Позаботьтесь о дополнительной осторожностью, чтобы аккуратно повторно использовать матрицу сродства путем трубопроводов, а затем добавить 200 микролитров к каждому образцу.Инкубировать лисаты при четырех градусах по Цельсию на ночь с нежным смешивания на трубчатом ротаторе. Чтобы изолировать РНК, быстро вращай трубки, содержащие лизоли в мини-центрифуге, и собирайте бисер, поместив на магнитную стойку, по крайней мере, на одну минуту. Соберите супернатант в дополнительных микроцентрифуговых трубках.Добавьте один миллилитр свежего высокосоленого буфера в каждую трубку, а затем нежный трубчатый по крайней мере пять раз без введения пузырьков. Соберите бисер на магнитной подстоять на льду в течение одной минуты и удалить супернатант. Повторите шаги стирки еще четыре раза.Затем снимите микроцентрифуг трубки с магнитного стенда и поместите при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы согреться. Перезапись бисера в 100 микролитров лиза буфера с 0,7 микролитров бета-меркаптоэтанола, чтобы освободить связанную РНК из матрицы сродства. Vortex труб, по крайней мере пять секунд на самой высокой скорости и быстро вращаться вниз.Затем инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 10 минут. Поместите трубки на магнитный стенд, по крайней мере одну минуту, а затем собрать супернатант и немедленно приступить к очистке РНК в соответствии с протоколом очистки РНК в комплекте. Для достижения максимального качества изолированной РНК выполните все дополнительные шаги, включая пищеварение DNase и все шаги по элюции РНК, включая рекомендуемое разогрев буфера элюции до 60 градусов по Цельсию.В этом исследовании, GFP-L10A слияния и Фах трансгены были совместно доставлены в транспосон-содержащих плазмидных ловушки вектор печени путем гидродинамических инъекций. Удаление нитизинона вызвало токсичную травму печени. Иммунофлюоресценция окрашивания подтвердил коэкспрессии FAH и GFP-L10A синтез белка и перенаселения гепатоцитов после двух недель перенаселения печени.В тихие образцы производится самый высокий выход синтеза белка, так как все гепатоциты выражают GFP-L10A после инъекции AAV8-TBG-Cre. И наоборот, практически ни одна РНК не была обнаружена в управлениях дикого типа, которые не имеют трансгена GFP-L10A, что указывает на то, что процедура TRAP является весьма специфической и имеет низкий фон. Когда TRAP был использован на ткани печени проходит перенаселение с GFP-L10A транс индуцированных гепатоцитов, обильные высококачественные РНК была получена.В отличие от этого, никаких следов РНК не было обнаружено через Bioanalyzer для отрицательного образца контроля. Выражение Gsta1 было вызвано более чем десятикратным увеличением перенаселения гепатоцитов по сравнению с тихими гепатоцитами, в то время как значения порогового цикла не были обнаружены с помощью изолированной TRAP РНК от мыши дикого типа из-за отсутствия входной РНК. При гомогенизации ткани, убедитесь, что двигаться пестик медленно, чтобы предотвратить аэрацию.После изоляции РНК для анализа экспрессии генов может быть выполнено секвенирование высокой пропускной способности или qPCR. С TRAP-seq, теперь у нас есть метод, чтобы конкретно изолировать РНК от перенаселения гепатоцитов и проанализировать изменения в экспрессии генов во время перенаселения печени. Это позволяет нам определить гены, которые изменяются в ходе этого процесса и потенциальных терапевтических целей для лечения травмы печени.Циклохексимид и DTT, которые присутствуют в нескольких буферах, являются токсичными. Отходы должны собираться и выбрасываться в соответствии с институциональными руководящими принципами.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

В утробе матери и исключая виво Электропорация для экспрессии генов у мыши ганглиозных клеток сетчатки

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

Спинной мозг электрофизиологии

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...