Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) y P30-DK050306 (Subvención piloto a KJW).

Todos los métodos que implican el uso de ratones son consistentes con las pautas proporcionadas por la IACUC de la Oficina Penn de Bienestar Animal de la Universidad de Pensilvania.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>
Cicloheximida
	<ol>
<li>Para hacer 500 ml de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspenda 50 mg de cicloheximida en 500 ml de metanol. PRECAUCION: La cicloheximida es extremadamente tóxica para el medio ambiente y puede causar malformación cong?...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq es una técnica para el aislamiento específico del tipo de celda de la traducción de ARNm a través de ribosomas etiquetados con epítopos y presenta una alternativa a los enfoques FACS, ya que elude limitaciones como los requisitos de tiempo de FACS9. En su lugar, TRAP permite el aislamiento rápido y eficiente del ARN directamente de los tejidos a granel, ayudando a evitar cualquier alteración en la expresión génica. TRAP-seq es especialmente adecuado para su uso en el repoblado h?...

Como el principal órgano metabólico en vertebrados, el hígado es responsable de la homeostasis de glucosa, síntesis de proteínas séricas, secreción de ácido biliar, y metabolismo xenobiótico y desintoxicación. El hígado posee una capacidad extraordinaria para regenerar el parénquima lesionado al exponerse a toxinas para prevenir la insuficiencia hepática inmediata1. Sin embargo, el fracaso de la regeneración puede ocurrir en el entorno de paracetamol o consumo excesivo de alcohol, que puede conducir a insuficiencia hepática aguda2. Además, la lesión hepática crónica causada por la infección por hepatitis viral, la enfermedad del hígado graso y la esteatohepatitis puede causar fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular3. El único tratamiento curativo disponible para la enfermedad hepática terminal es el trasplante, pero está limitado por la escasez de órganos, lo que impide un tratamiento eficiente para todos los pacientes4. Por lo tanto, una mejor comprensión del proceso de recuperación después de una lesión hepática tóxica es crucial para el desarrollo de tratamientos para estimular la regeneración suficiente para la función de rescate en el órgano enfermo.
El sistema modelo más ampliamente aplicado para el estudio de la regeneración hepática es la hepatectomía parcial en roedores, en la que una gran proporción del hígado se resecta para estimular la rápida expansión de los hepatocitos5. Sin embargo, la hepatoectomía parcial no recapitula la expansión de los hepatocitos después de una lesión hepática tóxica debido a la falta de infiltración de células inmunitarias y necrosis celular de hepatocitos a menudo observada en el entorno de lesión hepática aguda en humanos6. Un sistema más adecuado para modelar esta forma de renovación de órganos es el ratón Fah-/-, que carece de fumarylacetoacetato hidrolasa funcional (FAH) necesario para el metabolismo adecuado de la tirosina y desarrolla daño hepático grave que conduce a la muerte7. Estos ratones se pueden mantener en un estado saludable indefinidamente por el tratamiento con el medicamento nitisinona en el agua potable. Alternativamente, la expresión DE FAH se puede restaurar mediante la entrega transgénica a un subconjunto de hepatocitos, que se expandirán para repoblar el hígado tras la eliminación de nitisinona8.
Para perfilar los cambios en la expresión génica de los hepatocitos repoblados, se requiere una herramienta para aislar específicamente los hepatocitos replicantes en el ratón Fah-/- sin contaminación de los hepatocitos heridos vecinas y otros tipos de células. Desafortunadamente, la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) de hepatocitos es difícil ya que (1) la fragilidad de repoblar hepatocitos conduce a una mala recuperación después de la perfusión hepática, (2) replicar hepatocitos son muy variables en tamaño, haciendo que el aislamiento de una población pura por FACS difícil, y (3) el tiempo de procedimiento de la perfusión hepática al aislamiento de ARN es mayor que 2 h, por lo tanto los perfiles de expresión génica pueden sufrir cambios artificiales sustanciales antes de que se adquieran muestras9.
Alternativamente, la expresión de ribosomas etiquetados con epítopos específicamente en la repoblación de hepatocitos permite el aislamiento rápido de traducir activamente el ARNm unido por ribosomas utilizando la purificación de afinidad inmediatamente después de la cosecha de órganos, con hígado a granel tejidos. Aquí, describimos un protocolo para realizar la purificación de afinidad de traducción-ribosoma (TRAP)10 seguido de la secuenciación de ARN de alto rendimiento (TRAP-seq), para aislar y perfilar específicamente el ARNm en la repoblación de hepatocitos en el Fah-/- ratón9. La coexpresión de proteína ribosomal con etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH permite la purificación de afinidad de la traducción de ARNm unido por polisomas que contienen GFP:RPL10A. Este método evita cualquier paso de disociación celular, como la perfusión hepática para aislar los hepatocitos repobladores frágiles. En su lugar, utiliza lisis de tejido de órganoentero y anticuerpos para extraer rápidamente el ARN específicamente de las células diana. Por último, el aislamiento de ARNm abundante y de alta calidad a través de TRAP-seq permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de secuenciación, perfilen el cambio dinámico de la expresión génica durante el proceso de repoblación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

La repoblación hepática después de una lesión es una característica crucial de los mamíferos que evita la falla inmediata de los órganos y la muerte después de la exposición de toxinas ambientales. Una comprensión más profunda de los cambios en la expresión génica que se producen durante la repoblación podría ayudar a identificar dianas terapéuticas para promover la restauración de la función hepática en el entorno de lesiones. Sin embargo, los métodos para aislar específicamente los hepatocitos repobladores se ven inhibidos por la falta de marcadores celulares, números celulares limitados y la fragilidad de estas células. El desarrollo de la tecnología de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) en conjunto con el modelo de ratón Fah-/- para recapitular la repoblación en el entorno de la lesión hepática permite el perfil de expresión génica de la repoblación Hepatocitos. Con TRAP, el ARNm de traducción específico del tipo de celda se aísla rápida y eficientemente. Desarrollamos un método que utiliza TRAP con aislamiento basado en afinidad de traducir mRNA de hepatocitos que expresan selectivamente la proteína fluorescente verde (GFP) con etiqueta de proteína ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP elude el largo período de tiempo requerido para la clasificación celular activada por fluorescencia que podría cambiar el perfil de expresión génica. Además, dado que sólo los hepatocitos repobladores expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A, el ARNm aislado está desprovisto de contaminación de los hepatocitos heridos circundantes y otros tipos de células en el hígado. El ARNm purificado por afinidad es de alta calidad y permite el análisis basado en la secuenciación descendente de PCR o de alto rendimiento de la expresión génica.

Para perfilar la expresión génica en la repoblación de hepatocitos del ratón Fah-/-, la fusión Gfp:Rpl10a y los transgenes de Fah se entregan conjuntamente dentro de un plásmido que contiene transposón8 (vector TRAP) a los hígados por inyección hidrodinámica(Figura 1A). La eliminación de la nitisinona induce una lesión hepática tóxica que crea una presión de selecci?...

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Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Con TRAP-seq, podemos aislar el ARN de tipos celulares específicos, como los hepatocitos que repoblan en el hígado lesionado para analizar los cambios de expresión génica que ocurren en esas células. No requiere ningún paso para eliminar las células no deseadas del tejido. El ARN específico del tipo de célula se aísla mediante la purificación de afinidad a partir de lisatos de órganos enteros.Esta técnica nos ayuda a determinar cómo responden las células específicas a las lesiones, lo que podría ayudar a identificar nuevas estrategias o medicamentos para combatir la enfermedad hepática. Esto podría ser utilizado para identificar cómo las células hepáticas responden a diferentes tipos de lesiones hepáticas. Actualmente, hay pocas opciones para lesiones hepáticas agudas graves y este método nos ayudará a inslizarnos en nuevos tratamientos.Este método se originó en el cerebro. En el hígado, imaginamos que podría ser utilizado para examinar los cambios dinámicos en una variedad de tipos de células, los hepatocitos, células del conducto biliar, células Kupffer, y células endoteliales, por nombrar algunos. Demostrando el procedimiento estará Amber Wang, una estudiante graduada y mi estudiante.Para empezar, resuspender las cuentas magnéticas por pipeteo suave. Recoger las perlas en un soporte magnético durante más de un minuto y quitar el sobrenadante. A continuación, retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y agregue un mililitro de PBS, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo para lavar las perlas.Coloque el tubo de nuevo en el soporte magnético durante más de un minuto para recoger las perlas y quitar el PBS. Para preparar cuentas recubiertas de proteína L, agregue 16 microlitros de proteína biotinilada L a las perlas magnéticas resuspendidas y lavadas y agregue 1X PBS para hacer el volumen final de un mililitro, si utiliza un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, o 1,5 litros, si utiliza un tubo de microcentrífo de dos mililitros. Incubar las cuentas magnéticas con proteína biotinilada L durante 35 minutos a temperatura ambiente en un rotador de tubo.A continuación, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante para recoger las perlas recubiertas de proteína L. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada un mililitro de PBS con un tampón 3%BSA, seguido de pipeteo suave al menos cinco veces para lavar las cuentas recubiertas de L de proteína. Una vez más, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante para recoger las perlas recubiertas.Repita el lavado de la BSA otras cuatro veces. A continuación, añada 50 microgramos de anticuerpos para el anticuerpo GFP 19C8 y el anticuerpo GFP 19F7 cada uno en las cuentas recubiertas de L de proteína, e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius en un rotador de tubo. Para recoger la matriz de afinidad, coloque el tubo en el soporte magnético durante más de un minuto y retire el sobrenadante.Saque el tubo del soporte magnético y agregue un mililitro de tampón bajo en sal. Encote suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar la matriz de afinidad y repita el lavado con tampón bajo en sal otras dos veces. Resuspender las perlas en 200 microlitros de tampón bajo en sal, para hacer 200 microlitros de matriz de afinidad.En primer lugar, configure la amoladora de tejido para que los tubos de vidrio de PTFE se puedan colocar sobre hielo durante la homogeneización. Llene cuatro mililitros de tampón de lelisis fría en los tubos de vidrio PTFE. Poner el hígado sobre un plato de Petri.Utilice un cuchillo para aislar de 200 a 500 miligramos de trozos de hígado y pasar a los tubos de vidrio de PTFE. Coloque el tejido hepático restante en un tubo de microcentrífuga preenfriado y congele el flash en nitrógeno líquido. Homogeneizar las muestras en un homogeneizador motor, comenzando a 300 rpm durante al menos cinco accidentes cerebrovasculares para disociar hepatocitos de la estructura hepática.Baje el tubo de vidrio cada vez. Evitar la aireación, que podría causar desnaturalización de proteínas, manteniendo el pestle por debajo de la solución. A continuación, aumentar la velocidad a 900 rpm para homogeneizar completamente los tejidos hepáticos durante al menos 12 golpes completos.Transfiera el izado a tubos etiquetados y pre-refrigerados con no más de un mililitro de litote cada uno. Para iniciar la lelisis nuclear, centrifugar el sete del hígado a 2.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga pre-refrigerado sobre hielo. Agregue 1/9 del volumen de sobrenadante de 10%NP-40 en el tubo de microcentrífuga sobre hielo y mezcle la solución invirtiendo suavemente el tubo.Deslice rápidamente los tubos de microcentrífuga con una mini centrífuga y añada 1/9o del volumen de la muestra del 10%DOC. Mezcle invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga y gire rápidamente por los tubos de microcentrífuga e incubar en hielo durante cinco minutos. Centrifugar el izado nuclear a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga pre-enfriados sobre hielo.Para cada tubo, saque el 1% del volumen total del sobrenadante como control de pre-inmunoprecipitación. Coloque los controles de pre-inmunoprecipitación en un rotador de tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Tenga especial cuidado de resuspender suavemente la matriz de afinidad pipeteando, luego agregue 200 microlitros a cada muestra.Incubar los lysates a cuatro grados Centígrados durante la noche con una mezcla suave en un rotador de tubo. Para aislar el ARN, gire rápidamente hacia abajo los tubos que contienen los lysates en la mini centrífuga y recoja las perlas colocándolas en el bastidor magnético durante al menos un minuto. Recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga adicionales.Agregue un mililitro de tampón fresco de sal alta a cada tubo, seguido de pipeteo suave al menos cinco veces sin introducir burbujas. Recoger las cuentas en el soporte magnético en el hielo durante más de un minuto y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado otras cuatro veces.A continuación, retire los tubos de microcentrífuga del soporte magnético y colóquelos a temperatura ambiente durante cinco minutos para calentarlos. Resuspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lelisis con 0,7 microlitros de beta-mercaptoetanol para liberar ARN unido de la matriz de afinidad. Vórtice los tubos durante al menos cinco segundos a la velocidad más alta y girar rápidamente hacia abajo.Luego, incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético durante al menos un minuto, luego recoja el sobrenadante y proceda inmediatamente a la limpieza del ARN de acuerdo con el protocolo de purificación de ARN en el kit. Para lograr la máxima calidad del ARN aislado, realice todos los pasos opcionales, incluida la digestión DNase y todos los pasos de elución de ARN, incluido el precalentamiento recomendado del búfer de elución a 60 grados centígrados.En este estudio, la fusión GFP-L10A y Fah transgenes se entregaron conjuntamente dentro de un vector de trampa de plásmido que contiene transposones a los hígados mediante inyección hidrodinámica. La eliminación de nitisinona indujo una lesión hepática tóxica. La tinción de inmunofluorescencia confirmó la coexpresión de la proteína de fusión FAH y GFP-L10A y los hepatocitos repobladores después de dos semanas de repoblación hepática.La muestra de reposo produjo el mayor rendimiento de proteína de fusión, ya que todos los hepatocitos expresan GFP-L10A después de la inyección de AAV8-TBG-Cre. Por el contrario, apenas se detectó ARN en controles de tipo salvaje que no tenían el transgén GFP-L10A, lo que indica que el procedimiento TRAP es muy específico y tiene un fondo bajo. Cuando trap se utilizó en tejido hepático sometido a repoblación con hepatocitos transducidos por GFP-L10A, se obtuvo abundante ARN de alta calidad.Por el contrario, no se detectó rastro de ARN a través de Bioanalyzer para la muestra de control negativo. La expresión de Gsta1 fue inducida por más de diez veces en la repoblación de hepatocitos en comparación con los hepatocitos en reposo, mientras que no se detectaron valores de ciclo de umbral con ARN aislado TRAP del ratón de tipo salvaje debido a la falta de ARN de entrada. Cuando homogeneice el tejido, asegúrese de mover el pestle lentamente para evitar la aireación.Después de aislar el ARN, se puede realizar una secuenciación de alto rendimiento o qPCR para analizar la expresión génica. Con TRAP-seq, ahora tenemos un método para aislar específicamente el ARN de los hepatocitos repobladores y analizar el cambio en la expresión génica durante la repoblación hepática. Esto nos permite identificar genes que se alteran durante este proceso y posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de lesiones hepáticas.La cicloheximida y la TDT, que están presentes en varios amortiguadores, son tóxicas. Los residuos deben recogerse y desecharse de acuerdo con las directrices institucionales.

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