Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Detta arbete stöddes av följande bidrag: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), och P30-DK050306 (pilot Grant till KJW).

Alla metoder som involverar användning av möss är förenliga med de riktlinjer som tillhandahålls av IACUC av Penn Office of Animal Welfare vid University of Pennsylvania.
1. beredning av reagens
<ol><li>
Kungliga Automobilklubben
	<ol>
<li>För att göra 500 μl av 0,1 g/ml cykloheximid, suspendera 50 mg Kungliga Automobilklubben i 500 μl metanol. Försiktighet: Cykloheximid är extremt giftigt för miljön och kan orsaka medfödd missbildning. Allt...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-SEQ är en teknik för celltypspecifik isolering av översättning av mRNA via Epitope-märkta ribosomer och utgör ett alternativ till FACS metoder, eftersom det kringgår begränsningar såsom tids krav för FACS9. Istället, fälla tillåter snabb och effektiv isolering av RNA direkt från bulk vävnader, hjälper till att undvika eventuella förändringar i genuttryck. Trap-SEQ är särskilt väl lämpad för användning i återinplantering Fah-/- mus lever, som hepat...

Som den viktigaste metaboliska organ hos ryggradsdjur, levern är ansvarig för glukos homeostas, serumprotein syntes, Gall syra sekretion, och xenobiotiska metabolism och avgiftning. Levern besitter en extraordinär förmåga att regenerera den skadade parenkymet vid exponering för toxiner för att förhindra omedelbar leversvikt1. Emellertid, misslyckande regenerering kan inträffa i inställningen av paracetamol eller alkohol överkonsumtion, vilket kan leda till akut leversvikt2. Dessutom, kronisk leverskada orsakad av Viral hepatit infektion, fet leversjukdom, och steatohepatit kan orsaka leverfibros, cirros, och Hepatocellulär cancer3. Den enda tillgängliga kurativ behandling för slutstadiet leversjukdom är transplantation men begränsas av organbrist, förhindra effektiv behandling för alla patienter4. En bättre förståelse av återhämtningsprocessen efter toxisk leverskada är därför avgörande för utvecklingen av behandlingar för att stimulera förnyelse tillräcklig för att rädda funktion i sjuka organ.
Den mest allmänt tillämpade modellsystem för studiet av lever förnyelse är partiell hepatektomi hos gnagare, där en stor del av levern är resected att stimulera snabb hepatocyte expansion5. Emellertid, partiell hepatektomi inte recapitulate hepatocyte expansion efter toxisk leverskada på grund av bristen på immun cell infiltration och hepatocyte cell nekros ofta observerats i fastställandet av akut leverskada hos människor6. Ett mer lämpligt system för att modellera denna form av orgel förnyelse är Fah-/- mus, som saknar funktionell fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) krävs för korrekt tyrosin metabolism och utvecklar allvarliga leverskador som leder till döden7. Dessa möss kan upprätthållas i ett hälsosamt tillstånd på obestämd tid genom behandling med drogen nitisinon i dricksvattnet. Alternativt kan Fah uttryck återställas genom transgenens leverans till en delmängd av hepatocyter, som kommer att expandera för att återbefolka levern vid nitisinon avlägsnande8.
För att profilera gen uttrycks förändringar av återinplantering hepatocyter, ett verktyg för att specifikt isolera replikerande hepatocyter i Fah-/- mus utan kontaminering från angränsande skadade hepatocyter och andra celltyper krävs. Tyvärr, fluorescens-Assisted cell sortering (FACS) av hepatocyter är svårt eftersom (1) bräcklighet återinplantering hepatocyter leder till dålig återhämtning efter levern perfusion, (2) replikerande hepatocyter är mycket varierande i storlek, vilket gör isolering av en ren population av FACS svårt, och (3) förfarandet tid från levern perfusion till RNA isolering är större än 2 h, därav genuttrycksprofiler kan genomgå betydande konstgjorda förändringar innan proverna förvärvas9.
Alternativt, uttrycket av Epitope-märkta ribosomer specifikt i återinplantering hepatocyter möjliggör en snabb isolering av aktivt översätta mRNA bunden av ribosomer med hjälp av affinitetsrening omedelbart efter organskörd, med bulk lever vävnad Lysates. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra översätter-ribosome affinitetsrening (trap)10 följt av hög genomströmning RNA-sekvensering (trap-SEQ), att specifikt isolera och profilera mRNA i återinplantering hepatocyter i Fah-/- mus9. Coexpression av grönt fluorescerande protein-märkta ribosomalt protein (GFP: RPL10A) med FAH kan affinitetsrening av översätta mRNA bunden av polysomer som innehåller GFP: RPL10A. Denna metod undviker alla cell dissociation steg, såsom lever perfusion att isolera bräckliga återinplantering hepatocyter. Istället, det använder lys av hela orgel vävnad och antikroppar för att snabbt extrahera RNA specifikt från målcellerna. Slutligen, isolering av riklig, hög kvalitet mRNA via TRAP-SEQ möjliggör nedströms applikationer såsom sekvenserings analys för att profilera den dynamiska förändringen av genuttryck under återbefolkningsprocessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Lever återinsättning efter skada är ett viktigt inslag i däggdjur som förhindrar omedelbar organsvikt och död efter exponering av miljögifter. En djupare förståelse av de förändringar i genuttryck som uppstår under återinsättning kan bidra till att identifiera terapeutiska mål för att främja återställande av leverfunktionen vid fastställandet av skador. Icke desto mindre, metoder för att isolera specifikt återinplantering hepatocyter hämmas av en brist på cell markörer, begränsade cell nummer, och bräcklighet av dessa celler. Utvecklingen av att översätta ribosomteknik för affinitetsrening (trap) tillsammans med Fah-/-mus- modellen för att recapitulera återinsättning vid fastställandet av leverskada medger profilering av genuttryck för återinplantering Hepatocyter. Med TRAP, celltyp-specifika översätta mRNA är snabbt och effektivt isolerade. Vi utvecklade en metod som utnyttjar FÄLLAN med affinitetsbaserad isolering av översätta mRNA från hepatocyter som selektivt uttrycker den gröna fluorescerande protein (GFP)-märkta ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP kringgår den långa tidsperiod som krävs för fluorescensaktiverad cell sortering som kan förändra gen uttrycks profilen. Dessutom, eftersom endast de återinplantering hepatocyter uttrycka GFP: RPL10A fusionsprotein, den isolerade mRNA saknar förorening från omgivande skadade hepatocyter och andra celltyper i levern. Den affinitetsrenade mRNA är av hög kvalitet och medger nedströms PCR-eller högflödesekvensbaserad analys av genuttryck.

Att profilera genuttryck i återinplantering hepatocyter av Fah-/- mus, GFP: Rpl10a fusion och Fah transgener samlevereras inom en transposon-innehållande plasmid8 (trap Vector) till lever av hydrodynamisk injektion (figur 1A). Avlägsnandet av nitisinon inducerar en toxisk leverskada som skapar ett urvals tryck för hepatocyter stabilt uttrycker Fah att återbefolka den skadade p...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Att översätta ribosom affinitetsrening (fälla) möjliggör snabb och effektiv isolering av celltypspecifika översätta mRNA. Här visar vi en metod som kombinerar hydrodynamisk svans-ven injektion i en musmodell av lever återinsättning och fälla för att undersöka uttrycks profilen för återinplantering hepatocyter.

Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Med TRAP-seq kan vi isolera RNA från specifika celltyper, såsom hepatocyterna som återbefolkar sig i skadad lever för att analysera de genuttrycksförändringar som sker i dessa celler. Det kräver inte några åtgärder för att ta bort oönskade celler från vävnaden. Celltypspecifika RNA isoleras genom affinitetsrening från hela organ lysates.Denna teknik hjälper oss att avgöra hur specifika celler reagerar på skador, vilket kan hjälpa till att identifiera nya strategier eller läkemedel för att bekämpa leversjukdom. Detta kan användas för att identifiera hur leverceller svarar på olika typer av leverskador. För närvarande finns det få alternativ för allvarliga akuta leverskador och denna metod kommer att bidra till att ledtråd oss till nya behandlingar.Denna metod har sitt ursprung i hjärnan. I levern, vi tänkt att det skulle kunna användas för att undersöka dynamiska förändringar i en mängd olika celltyper, hepatocyterna, gallans kanalceller, Kupffer celler och endotelceller för att nämna några. Demonstrerar proceduren blir Amber Wang, en doktorand och min mentee.Till att börja med resuspend magnetiska pärlor av mild pipettering. Samla in pärlorna på ett magnetiskt stativ i mer än en minut och ta bort supernatanten. Ta sedan bort mikrocentrifugröret från magnetstativet och tillsätt en milliliter PBS, följt av pipettering upp och ner för att tvätta pärlorna.Placera tillbaka röret på magnetstativ i mer än en minut för att samla in pärlorna och ta bort PBS. För att förbereda protein L-belagda pärlor, tillsätt 16 mikroliter av biotinylerat protein L till de återanvända och tvättade magnetiska pärlorna och tillsätt 1X PBS för att göra den slutliga volymen en milliliter, om du använder ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör, eller 1,5 milliliter, om du använder ett två milliliter mikrocentrifugerör. Inkubera de magnetiska pärlorna med biotinylerat protein L i 35 minuter vid rumstemperatur på en rörrotator.Placera sedan röret på magnetstativ i mer än en minut och ta bort supernatanten för att samla in proteinet L-belagd pärlor. Ta bort mikrocentrifugröret från magnetstativet och tillsätt en milliliter PBS med 3%BSA buffert, följt av skonsam pipettering minst fem gånger för att tvätta proteinet L-belagd pärlor. Återigen, placera röret på magnetstativ i mer än en minut och ta bort supernatanten för att samla de belagda pärlorna.Upprepa BSA-tvätten ytterligare fyra gånger. Därefter lägger du till 50 mikrogram antikroppar för GFP-antikropp 19C8 och GFP-antikropp 19F7 vardera i proteinet L-belagda pärlor och inkubera i en timme vid fyra grader Celsius på en rörrotator. För att samla ihop affinitetsmatrisen, placera röret på magnetstativet i mer än en minut och ta bort supernatanten.Ta röret bort från magnetstativ och tillsätt en milliliter lågsaltbuffert. Försiktigt pipet upp-och-ner för att tvätta affinitet matris och upprepa låg-salt buffert tvätt ytterligare två gånger. Resuspend pärlorna i 200 mikroliter av lågsalt buffert, att göra 200 mikroliter av affinitet matris.Ställ först upp vävnadskvarnen så att PTFE-glasrören kan placeras på is under homogenisering. Fyll fyra milliliter kalllyssbuffert i PTFE-glasrören. Lägg levern på en petriskål.Använd en kniv för att isolera 200 till 500 milligram lever bitar och flytta in i PTFE glasrör. Placera den återstående levervävnaden i ett förkylt mikrocentrifugrör och flashfrys i flytande kväve. Homogenisera proverna i en motordriven homogenisator, med början vid 300 rpm i minst fem slag för att dissocera hepatocyter från leverstrukturen.Sänk ner glasröret varje gång. Förhindra aeration, vilket kan orsaka protein denaturering, genom att hålla mortelstöten under lösningen. Sedan, höja hastigheten till 900 rpm för att helt homogenisera levervävnaderna för minst 12 fulla slag.Överför lysate i märkta och förkylda rör med högst en milliliter lysate vardera. För att starta kärnlyss, centrifug levern lysate på 2, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 10 minuter, sedan överföra supernatanten till en ny pre-kyld mikrocentrifug röret på is. Tillsätt 1/9th av supernatantvolymen på 10%NP-40 i mikrocentrifugröret på is och blanda lösningen genom att försiktigt vända röret.Snurra snabbt ner mikrocentrifugrören med en minicentrifug och tillsätt 1/9th av provvolymen på 10%DOC. Blanda genom att försiktigt vända inverterande mikrocentrifugrören och snurra snabbt ner mikrocentrifugrören och inkubera på is i fem minuter. Centrifugera den nukleära lysate vid 20, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 10 minuter och överföra supernatanten till nya förkylda mikrocentrifugrör på is.För varje rör, ta ut 1%av supernatantens totala volym som en kontroll före immunprecipitation. Placera kontrollerna före immunoprecipitation på en rörrotator vid fyra grader Celsius över natten. Var extra noga med att försiktigt återanvända affinitetsmatrisen genom pipettering, tillsätt sedan 200 mikroliter till varje prov.Inkubera lysaterna vid fyra grader Celsius över natten med skonsam blandning på en rörrotator. För att isolera RNA, snurra snabbt ner rören som innehåller lysaterna i minicentrifugen och samla in pärlorna genom att placera på magnetställningen i minst en minut. Samla upp supernatanten i ytterligare mikrocentrifugrör.Tillsätt en milliliter färsk högsaltbuffert till varje rör, följt av mild pipettering minst fem gånger utan att införa bubblor. Samla in pärlorna på magnetstativ på is i över en minut och ta bort supernatanten. Upprepa tvättstegen ytterligare fyra gånger.Ta sedan bort mikrocentrifugrören från magnetstativ och placera i rumstemperatur i fem minuter för att värma upp. Resuspend pärlorna i 100 mikroliter av lysbuffert med 0,7 mikroliter av beta-merkaptoetanol för att frigöra bundet RNA från affinitetsmatrisen. Vortexa rören i minst fem sekunder i högsta hastighet och snurra snabbt ner.Därefter, inkubera rören i rumstemperatur i 10 minuter. Placera rören på magnetstativ i minst en minut, samla sedan upp supernatanten och fortsätt omedelbart till RNA-sanering enligt RNA-reningsprotokollet i satsen. För att uppnå maximal kvalitet på det isolerade RNA, utför alla valfria steg, inklusive DNase-matsmältning och alla RNA-elueringssteg, inklusive den rekommenderade förvärmningen av elueringsbufferten till 60 grader Celsius.I denna studie, GFP-L10A fusion och Fah transgener var co-levereras inom en transposon-innehållande plasmid fälla vektor till lever genom hydrodynamic injektion. Avlägsnandet av nitisinon inducerade en giftig leverskada. Immunofluorescens färgning bekräftade coexpression av FAH och GFP-L10A fusion protein och de repopulating hepatocytes efter två veckor av lever återbefolkning.Den quiescent provet producerade den högsta avkastningen av fusion protein, eftersom alla hepatocyter uttrycka GFP-L10A efter AAV8-TBG-Cre injektion. Omvänt var knappt något RNA detekterbart i vilda kontroller som inte hade GFP-L10A-transgen, vilket indikerar trap-proceduren är mycket specifik och har en låg bakgrund. När TRAP användes på levervävnad genomgår återbefolkning med GFP-L10A transduced hepatocyter, riklig hög kvalitet RNA erhölls.Däremot upptäcktes inga RNA-spår via Bioanalyzer för det negativa kontrollprovet. Gsta1 uttryck framkallades av över tiofaldigt i repopulating hepatocytes jämfört med quiescent hepatocytes, medan inga tröskelvärdet cykel värden upptäcktes med TRAP-isolerade RNA från vild typ musen på grund av bristen på inmatnings-RNA. När homogenisera vävnaden, se till att flytta mortelstöten långsamt för att förhindra avering.Efter att ha isolerat RNA, kan hög-genomströmning sekvensering eller qPCR utföras för att analysera genuttryck. Med TRAP-seq har vi nu en metod för att specifikt isolera RNA från att återbefolka hepatocyter och analysera förändringen i genuttryck under leveromvandlar. Detta gör det möjligt för oss att identifiera gener som ändras under denna process och potentiella terapeutiska mål för behandling av leverskada.Cykloheximid och DTT, som finns i flera buffertar, är båda giftiga. Avfall bör samlas in och kasseras enligt institutionella riktlinjer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero och ex vivo elektroporation för genuttryck i Mus Retinal ganglion celler

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Teknik för analys av Cell Typspecifika Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...