Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Detta arbete stöddes av följande bidrag: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), och P30-DK050306 (pilot Grant till KJW).

Alla metoder som involverar användning av möss är förenliga med de riktlinjer som tillhandahålls av IACUC av Penn Office of Animal Welfare vid University of Pennsylvania.
1. beredning av reagens
<ol><li>
Kungliga Automobilklubben
	<ol>
<li>För att göra 500 μl av 0,1 g/ml cykloheximid, suspendera 50 mg Kungliga Automobilklubben i 500 μl metanol. Försiktighet: Cykloheximid är extremt giftigt för miljön och kan orsaka medfödd missbildning. Allt...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-SEQ är en teknik för celltypspecifik isolering av översättning av mRNA via Epitope-märkta ribosomer och utgör ett alternativ till FACS metoder, eftersom det kringgår begränsningar såsom tids krav för FACS9. Istället, fälla tillåter snabb och effektiv isolering av RNA direkt från bulk vävnader, hjälper till att undvika eventuella förändringar i genuttryck. Trap-SEQ är särskilt väl lämpad för användning i återinplantering Fah-/- mus lever, som hepat...

Som den viktigaste metaboliska organ hos ryggradsdjur, levern är ansvarig för glukos homeostas, serumprotein syntes, Gall syra sekretion, och xenobiotiska metabolism och avgiftning. Levern besitter en extraordinär förmåga att regenerera den skadade parenkymet vid exponering för toxiner för att förhindra omedelbar leversvikt1. Emellertid, misslyckande regenerering kan inträffa i inställningen av paracetamol eller alkohol överkonsumtion, vilket kan leda till akut leversvikt2. Dessutom, kronisk leverskada orsakad av Viral hepatit infektion, fet leversjukdom, och steatohepatit kan orsaka leverfibros, cirros, och Hepatocellulär cancer3. Den enda tillgängliga kurativ behandling för slutstadiet leversjukdom är transplantation men begränsas av organbrist, förhindra effektiv behandling för alla patienter4. En bättre förståelse av återhämtningsprocessen efter toxisk leverskada är därför avgörande för utvecklingen av behandlingar för att stimulera förnyelse tillräcklig för att rädda funktion i sjuka organ.
Den mest allmänt tillämpade modellsystem för studiet av lever förnyelse är partiell hepatektomi hos gnagare, där en stor del av levern är resected att stimulera snabb hepatocyte expansion5. Emellertid, partiell hepatektomi inte recapitulate hepatocyte expansion efter toxisk leverskada på grund av bristen på immun cell infiltration och hepatocyte cell nekros ofta observerats i fastställandet av akut leverskada hos människor6. Ett mer lämpligt system för att modellera denna form av orgel förnyelse är Fah-/- mus, som saknar funktionell fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) krävs för korrekt tyrosin metabolism och utvecklar allvarliga leverskador som leder till döden7. Dessa möss kan upprätthållas i ett hälsosamt tillstånd på obestämd tid genom behandling med drogen nitisinon i dricksvattnet. Alternativt kan Fah uttryck återställas genom transgenens leverans till en delmängd av hepatocyter, som kommer att expandera för att återbefolka levern vid nitisinon avlägsnande8.
För att profilera gen uttrycks förändringar av återinplantering hepatocyter, ett verktyg för att specifikt isolera replikerande hepatocyter i Fah-/- mus utan kontaminering från angränsande skadade hepatocyter och andra celltyper krävs. Tyvärr, fluorescens-Assisted cell sortering (FACS) av hepatocyter är svårt eftersom (1) bräcklighet återinplantering hepatocyter leder till dålig återhämtning efter levern perfusion, (2) replikerande hepatocyter är mycket varierande i storlek, vilket gör isolering av en ren population av FACS svårt, och (3) förfarandet tid från levern perfusion till RNA isolering är större än 2 h, därav genuttrycksprofiler kan genomgå betydande konstgjorda förändringar innan proverna förvärvas9.
Alternativt, uttrycket av Epitope-märkta ribosomer specifikt i återinplantering hepatocyter möjliggör en snabb isolering av aktivt översätta mRNA bunden av ribosomer med hjälp av affinitetsrening omedelbart efter organskörd, med bulk lever vävnad Lysates. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra översätter-ribosome affinitetsrening (trap)10 följt av hög genomströmning RNA-sekvensering (trap-SEQ), att specifikt isolera och profilera mRNA i återinplantering hepatocyter i Fah-/- mus9. Coexpression av grönt fluorescerande protein-märkta ribosomalt protein (GFP: RPL10A) med FAH kan affinitetsrening av översätta mRNA bunden av polysomer som innehåller GFP: RPL10A. Denna metod undviker alla cell dissociation steg, såsom lever perfusion att isolera bräckliga återinplantering hepatocyter. Istället, det använder lys av hela orgel vävnad och antikroppar för att snabbt extrahera RNA specifikt från målcellerna. Slutligen, isolering av riklig, hög kvalitet mRNA via TRAP-SEQ möjliggör nedströms applikationer såsom sekvenserings analys för att profilera den dynamiska förändringen av genuttryck under återbefolkningsprocessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Lever återinsättning efter skada är ett viktigt inslag i däggdjur som förhindrar omedelbar organsvikt och död efter exponering av miljögifter. En djupare förståelse av de förändringar i genuttryck som uppstår under återinsättning kan bidra till att identifiera terapeutiska mål för att främja återställande av leverfunktionen vid fastställandet av skador. Icke desto mindre, metoder för att isolera specifikt återinplantering hepatocyter hämmas av en brist på cell markörer, begränsade cell nummer, och bräcklighet av dessa celler. Utvecklingen av att översätta ribosomteknik för affinitetsrening (trap) tillsammans med Fah-/-mus- modellen för att recapitulera återinsättning vid fastställandet av leverskada medger profilering av genuttryck för återinplantering Hepatocyter. Med TRAP, celltyp-specifika översätta mRNA är snabbt och effektivt isolerade. Vi utvecklade en metod som utnyttjar FÄLLAN med affinitetsbaserad isolering av översätta mRNA från hepatocyter som selektivt uttrycker den gröna fluorescerande protein (GFP)-märkta ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP kringgår den långa tidsperiod som krävs för fluorescensaktiverad cell sortering som kan förändra gen uttrycks profilen. Dessutom, eftersom endast de återinplantering hepatocyter uttrycka GFP: RPL10A fusionsprotein, den isolerade mRNA saknar förorening från omgivande skadade hepatocyter och andra celltyper i levern. Den affinitetsrenade mRNA är av hög kvalitet och medger nedströms PCR-eller högflödesekvensbaserad analys av genuttryck.

Att profilera genuttryck i återinplantering hepatocyter av Fah-/- mus, GFP: Rpl10a fusion och Fah transgener samlevereras inom en transposon-innehållande plasmid8 (trap Vector) till lever av hydrodynamisk injektion (figur 1A). Avlägsnandet av nitisinon inducerar en toxisk leverskada som skapar ett urvals tryck för hepatocyter stabilt uttrycker Fah att återbefolka den skadade p...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Att översätta ribosom affinitetsrening (fälla) möjliggör snabb och effektiv isolering av celltypspecifika översätta mRNA. Här visar vi en metod som kombinerar hydrodynamisk svans-ven injektion i en musmodell av lever återinsättning och fälla för att undersöka uttrycks profilen för återinplantering hepatocyter.

Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Med TRAP-seq kan vi isolera RNA från specifika celltyper, såsom hepatocyterna som återbefolkar sig i skadad lever för att analysera de genuttrycksförändringar som sker i dessa celler. Det kräver inte några åtgärder för att ta bort oönskade celler från vävnaden. Celltypspecifika RNA isoleras genom affinitetsrening från hela organ lysates.Denna teknik hjälper oss att avgöra hur specifika celler reagerar på skador, vilket kan hjälpa till att identifiera nya strategier eller läkemedel för att bekämpa leversjukdom. Detta kan användas för att identifiera hur leverceller svarar på olika typer av leverskador. För närvarande finns det få alternativ för allvarliga akuta leverskador och denna metod kommer att bidra till att ledtråd oss till nya behandlingar.Denna metod har sitt ursprung i hjärnan. I levern, vi tänkt att det skulle kunna användas för att undersöka dynamiska förändringar i en mängd olika celltyper, hepatocyterna, gallans kanalceller, Kupffer celler och endotelceller för att nämna några. Demonstrerar proceduren blir Amber Wang, en doktorand och min mentee.Till att börja med resuspend magnetiska pärlor av mild pipettering. Samla in pärlorna på ett magnetiskt stativ i mer än en minut och ta bort supernatanten. Ta sedan bort mikrocentrifugröret från magnetstativet och tillsätt en milliliter PBS, följt av pipettering upp och ner för att tvätta pärlorna.Placera tillbaka röret på magnetstativ i mer än en minut för att samla in pärlorna och ta bort PBS. För att förbereda protein L-belagda pärlor, tillsätt 16 mikroliter av biotinylerat protein L till de återanvända och tvättade magnetiska pärlorna och tillsätt 1X PBS för att göra den slutliga volymen en milliliter, om du använder ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör, eller 1,5 milliliter, om du använder ett två milliliter mikrocentrifugerör. Inkubera de magnetiska pärlorna med biotinylerat protein L i 35 minuter vid rumstemperatur på en rörrotator.Placera sedan röret på magnetstativ i mer än en minut och ta bort supernatanten för att samla in proteinet L-belagd pärlor. Ta bort mikrocentrifugröret från magnetstativet och tillsätt en milliliter PBS med 3%BSA buffert, följt av skonsam pipettering minst fem gånger för att tvätta proteinet L-belagd pärlor. Återigen, placera röret på magnetstativ i mer än en minut och ta bort supernatanten för att samla de belagda pärlorna.Upprepa BSA-tvätten ytterligare fyra gånger. Därefter lägger du till 50 mikrogram antikroppar för GFP-antikropp 19C8 och GFP-antikropp 19F7 vardera i proteinet L-belagda pärlor och inkubera i en timme vid fyra grader Celsius på en rörrotator. För att samla ihop affinitetsmatrisen, placera röret på magnetstativet i mer än en minut och ta bort supernatanten.Ta röret bort från magnetstativ och tillsätt en milliliter lågsaltbuffert. Försiktigt pipet upp-och-ner för att tvätta affinitet matris och upprepa låg-salt buffert tvätt ytterligare två gånger. Resuspend pärlorna i 200 mikroliter av lågsalt buffert, att göra 200 mikroliter av affinitet matris.Ställ först upp vävnadskvarnen så att PTFE-glasrören kan placeras på is under homogenisering. Fyll fyra milliliter kalllyssbuffert i PTFE-glasrören. Lägg levern på en petriskål.Använd en kniv för att isolera 200 till 500 milligram lever bitar och flytta in i PTFE glasrör. Placera den återstående levervävnaden i ett förkylt mikrocentrifugrör och flashfrys i flytande kväve. Homogenisera proverna i en motordriven homogenisator, med början vid 300 rpm i minst fem slag för att dissocera hepatocyter från leverstrukturen.Sänk ner glasröret varje gång. Förhindra aeration, vilket kan orsaka protein denaturering, genom att hålla mortelstöten under lösningen. Sedan, höja hastigheten till 900 rpm för att helt homogenisera levervävnaderna för minst 12 fulla slag.Överför lysate i märkta och förkylda rör med högst en milliliter lysate vardera. För att starta kärnlyss, centrifug levern lysate på 2, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 10 minuter, sedan överföra supernatanten till en ny pre-kyld mikrocentrifug röret på is. Tillsätt 1/9th av supernatantvolymen på 10%NP-40 i mikrocentrifugröret på is och blanda lösningen genom att försiktigt vända röret.Snurra snabbt ner mikrocentrifugrören med en minicentrifug och tillsätt 1/9th av provvolymen på 10%DOC. Blanda genom att försiktigt vända inverterande mikrocentrifugrören och snurra snabbt ner mikrocentrifugrören och inkubera på is i fem minuter. Centrifugera den nukleära lysate vid 20, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 10 minuter och överföra supernatanten till nya förkylda mikrocentrifugrör på is.För varje rör, ta ut 1%av supernatantens totala volym som en kontroll före immunprecipitation. Placera kontrollerna före immunoprecipitation på en rörrotator vid fyra grader Celsius över natten. Var extra noga med att försiktigt återanvända affinitetsmatrisen genom pipettering, tillsätt sedan 200 mikroliter till varje prov.Inkubera lysaterna vid fyra grader Celsius över natten med skonsam blandning på en rörrotator. För att isolera RNA, snurra snabbt ner rören som innehåller lysaterna i minicentrifugen och samla in pärlorna genom att placera på magnetställningen i minst en minut. Samla upp supernatanten i ytterligare mikrocentrifugrör.Tillsätt en milliliter färsk högsaltbuffert till varje rör, följt av mild pipettering minst fem gånger utan att införa bubblor. Samla in pärlorna på magnetstativ på is i över en minut och ta bort supernatanten. Upprepa tvättstegen ytterligare fyra gånger.Ta sedan bort mikrocentrifugrören från magnetstativ och placera i rumstemperatur i fem minuter för att värma upp. Resuspend pärlorna i 100 mikroliter av lysbuffert med 0,7 mikroliter av beta-merkaptoetanol för att frigöra bundet RNA från affinitetsmatrisen. Vortexa rören i minst fem sekunder i högsta hastighet och snurra snabbt ner.Därefter, inkubera rören i rumstemperatur i 10 minuter. Placera rören på magnetstativ i minst en minut, samla sedan upp supernatanten och fortsätt omedelbart till RNA-sanering enligt RNA-reningsprotokollet i satsen. För att uppnå maximal kvalitet på det isolerade RNA, utför alla valfria steg, inklusive DNase-matsmältning och alla RNA-elueringssteg, inklusive den rekommenderade förvärmningen av elueringsbufferten till 60 grader Celsius.I denna studie, GFP-L10A fusion och Fah transgener var co-levereras inom en transposon-innehållande plasmid fälla vektor till lever genom hydrodynamic injektion. Avlägsnandet av nitisinon inducerade en giftig leverskada. Immunofluorescens färgning bekräftade coexpression av FAH och GFP-L10A fusion protein och de repopulating hepatocytes efter två veckor av lever återbefolkning.Den quiescent provet producerade den högsta avkastningen av fusion protein, eftersom alla hepatocyter uttrycka GFP-L10A efter AAV8-TBG-Cre injektion. Omvänt var knappt något RNA detekterbart i vilda kontroller som inte hade GFP-L10A-transgen, vilket indikerar trap-proceduren är mycket specifik och har en låg bakgrund. När TRAP användes på levervävnad genomgår återbefolkning med GFP-L10A transduced hepatocyter, riklig hög kvalitet RNA erhölls.Däremot upptäcktes inga RNA-spår via Bioanalyzer för det negativa kontrollprovet. Gsta1 uttryck framkallades av över tiofaldigt i repopulating hepatocytes jämfört med quiescent hepatocytes, medan inga tröskelvärdet cykel värden upptäcktes med TRAP-isolerade RNA från vild typ musen på grund av bristen på inmatnings-RNA. När homogenisera vävnaden, se till att flytta mortelstöten långsamt för att förhindra avering.Efter att ha isolerat RNA, kan hög-genomströmning sekvensering eller qPCR utföras för att analysera genuttryck. Med TRAP-seq har vi nu en metod för att specifikt isolera RNA från att återbefolka hepatocyter och analysera förändringen i genuttryck under leveromvandlar. Detta gör det möjligt för oss att identifiera gener som ändras under denna process och potentiella terapeutiska mål för behandling av leverskada.Cykloheximid och DTT, som finns i flera buffertar, är båda giftiga. Avfall bör samlas in och kasseras enligt institutionella riktlinjer.

cell-type-specific-gene-expression-profiling-in-the-mouse-liver

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In utero och ex vivo elektroporation för genuttryck i Mus Retinal ganglion celler

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

Heterokaryon Teknik för analys av Cell Typspecifika Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Metabolisk märkning av nyligen transkriberade RNA för högupplöst profilering av genuttryck för RNA syntes, bearbetning och förfall i cellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...