Name: cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: F31-DK1136666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) ve P30-DK050306 (KJW pilot hibe).

Farelerin kullanımını içeren tüm yöntemler Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Penn Hayvan Refahı Ofisi'nin IACUC tarafından sağlanan kurallarla uyumludır.
1. Reaktif Hazırlama
<ol><li>
Siklohekmid
	<ol>
<li>0.1 g/mL siklohekamid 500 μL yapmak için, metanol 500 μL sikloheximid 50 mg askıya. DİkKAT: Siklohekmid çevre için son derece toksik ve konjenital malformasyona neden olabilir. Siklohekmid içeren tüm atıklar ve tamponlar uygun bertar...

<ol>
	<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiologies+of+acute+liver+failure.">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li><li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment.">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li><li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+transplantation:+Current+status+and+challenges.">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy:+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas.">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice.">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes &amp; Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li><li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+somatic,+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver.">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-seq+identifies+cystine/glutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury.">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).</li><li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).</li><li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury.">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li><li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver.">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver.">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq.">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish.">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver.">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled?.">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?.</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li></ol>

TRAP-seq, mRNA'nın epitop etiketli ribozomlar aracılığıyla hücre tipine özgü izolasyonu için bir tekniktir ve FACS9'unzaman gereksinimleri gibi sınırlamaları atlatırken FACS yaklaşımlarına alternatif sunar. Bunun yerine TRAP, RNA'nın doğrudan dökme dokulardan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesine izin verir ve gen ekspresyonundaki herhangi bir değişikliği önlemeye yardımcı olur. TRAP-seq özellikle çoğalan Fah-/- fare karaciğerinde kullan...

Omurgalılarda ana metabolik organ olarak, karaciğer glikoz homeostazı sorumludur, serum protein sentezi, safra asidi salgılanması, ve kksorubiyotik metabolizma ve detoksifikasyon. Karaciğer acil karaciğer yetmezliği önlemek için toksinlere maruz kalma üzerine yaralı parankim yeniden olağanüstü bir kapasiteye sahiptir1. Ancak, rejenerasyon yetmezliği asetaminofen veya alkol aşırı tüketimi ayarında oluşabilir, hangi akut karaciğer yetmezliğine yol açabilir2. Ayrıca, viral hepatit enfeksiyonu, yağlı karaciğer hastalığı ve steatohepatit neden olduğu kronik karaciğer hasarı karaciğer fibrozis, siroz ve hepatosellüler karsinom neden olabilir3. Son dönem karaciğer hastalığı için mevcut tek küratif tedavi transplantasyondur ancak organ yetersizliği ile sınırlıdır, tüm hastalar için verimli tedaviyi önler4. Toksik karaciğer hasarı sonrası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması bu nedenle hastalıklı organda fonksiyon kurtarmak için yeterli rejenerasyon uyarmak için tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.
Karaciğer rejenerasyon çalışmaları için en geniş uygulanan model sistemi kemirgenlerde kısmi hepatektomi, hangi karaciğer in büyük bir kısmı hızlı hepatosit genişlemesi ni uyarmak için rezeke edilir5. Ancak, parsiyel hepatektomi, immün hücre infiltrasyonu ve hepatosit hücre nekrozunun eksikliği nedeniyle toksik karaciğer hasarı sonrasında hepatosit genişlemesini tekrarlamaz6. Organ yenileme bu formu modellemek için daha uygun bir sistem Fah-/- fare, fonksiyonel fumarylacetoacetate hydrolase yoksun (FAH) uygun tirozin metabolizması için gerekli ve ölüme yol açan ciddi karaciğer hasarı gelişir7. Bu fareler içme suyunda ilaç nitisinone ile tedavi ile süresiz olarak sağlıklı bir durumda muhafaza edilebilir. Alternatif olarak, FAH ekspresyonu hepatosit bir alt kümesine transgen teslimi ile geri yüklenebilir, hangi nitisinone kaldırma üzerine karaciğer yeniden genişletmek olacak8.
Yeniden popülasyon hepatositlerin gen ekspresyonundaki değişikliklerin profilini çıkarmak için, komşu yaralı hepatositlerden ve diğer hücre tiplerinden kirlenme olmadan Fah-/- faredeki çoğalan hepatositleri özellikle izole etmek için bir araç gereklidir. Ne yazık ki, hepatositfloresan destekli hücre tasnifi (FACS) zordur çünkü (1) karaciğer perfüzyonu sonrası karaciğer perfüzyonu sonrası geri lüzeleme kırılganlık, (2) hepatosit çoğaltma boyutu son derece değişkendir, izolasyon yapma FACS tarafından saf bir popülasyonun zor, ve (3) karaciğer perfüzyonu RNA izolasyoniçin işlem süresi 2 h daha büyüktür, bu nedenle gen ekspresyonu profilleri örnekleri elde edilmeden önce önemli yapay değişikliklere uğrayabilir9.
Alternatif olarak, epitop etiketli ribozomların özellikle hepatositlerin yeniden doldurulmasında ekspresyonu, organ hasattan hemen sonra, toplu karaciğer ile, ribozomlarla bağlı mRNA'nın aktif olarak çevrilmesine olanak sağlar. doku lysates. Burada, translating-ribozom afinite (TRAP)10 ve ardından yüksek iş itimli RNA-sıralama (TRAP-seq) gerçekleştirmek için bir protokol açıklar, özellikle izole etmek ve fahhepatositler yeniden doldurma mRNA profil-/- fare9. Fah ile yeşil floresan protein etiketli ribozomal proteinin (GFP:RPL10A) birlikte ekspresyonu, GFP:RPL10A içeren polizomlarla bağlanan mRNA'nın çevrilmesine olanak sağlar. Bu yöntem, kırılgan yeniden popülasyon hepatositleri izole etmek için karaciğer perfüzyonu gibi herhangi bir hücre ayrışma adımlarını önler. Bunun yerine, tüm organ dokusu ve antikorların lysis hızla hedef hücrelerden özellikle RNA ayıklamak için kullanır. Son olarak, bol, yüksek kaliteli mRNA'nın TRAP-seq ile izolasyonu, yeniden popülasyon sürecinde gen ekspresyonunun dinamik değişimini profillemek için sıralama analizi gibi aşağı akım uygulamaları sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>358007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibodies</td>
			<td>Memorial Sloan-Kettering Antibody &#38; Bioresource Core</td>
			<td colspan="2">GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid, DOC</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose, Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ16924AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VV-83061-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7490S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overhead Stirrer</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>903475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit &#38; Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, NaHCO3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase&#183;In RNase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell type-specific gene expression profiling in the mouse liver

Yaralanma sonrası karaciğer repopülasyonu çevresel toksinlerin maruz kaldıktan sonra hemen organ yetmezliği ve ölümü önler memelilerin önemli bir özelliğidir. Repopülasyon sırasında meydana gelen gen ekspresyonundaki değişikliklerin daha derin bir şekilde anlaşılması, yaralanmaların ayarlanmasında karaciğer fonksiyonlarının restorasyonunu teşvik etmek için terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bununla birlikte, özellikle yeniden çoğalan hepatositleri izole etme yöntemleri hücre belirteçlerinin eksikliği, sınırlı hücre sayıları ve bu hücrelerin kırılganlığı ile inhibe edilir. Karaciğer hasarı ayarında yeniden popülasyonu yeniden özetlemek için Fah -/- fare modeli ile birlikte ribozom afinite arınma (TRAP) teknolojisinin çevirisinin geliştirilmesi, yeniden popülasyonun gen ekspresyonunun profilini n hepatositler. TRAP ile hücre tipine özel çeviri mRNA hızlı ve verimli bir şekilde izole edilir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli ribozomal protein (RP), GFP:RPL10A'yı seçici olarak ifade eden hepatositlerden mRNA çevirisinin yakınlık temelli izolasyonu ile TRAP'yi kullanan bir yöntem geliştirdik. TRAP, gen ekspresyonu profilini değiştirebilecek floresan aktif hücre sıralaması için gereken uzun süreyi atlatır. Ayrıca, sadece repopulating hepatositler GFP:RPL10A füzyon proteinini ifade ettiği için, izole mRNA karaciğerdeki yaralı hepatositler ve diğer hücre tiplerinden kaynaklanan kontaminasyondan yoksundur. Afinite saflaştırılmış mRNA yüksek kalitededir ve gen ekspresyonunun pcr veya yüksek iş bölümü sekanslama tabanlı analizini sağlar.

Fah-/- fare, Gfp:Rpl10a füzyonu ve Fah transgenlerin yeniden doldurulmasında gen ekspresyonunu profillemek için transposon içeren plazmid8 (TRAP vektörü) içinde karaciğerlere hidrodinamik enjeksiyon (Şekil 1A). Nitisinone kaldırılması hepatositler için bir seçim basıncı oluşturur toksik bir karaciğer hasarı neden stably yaralı parankim 9 yeniden doldurmak için ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver at JoVE.com

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Ribozom afinite saflaştırmanın (TRAP) çevirisi hücre tipine özgü translating mRNA'nın hızlı ve etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. Burada, karaciğer repopülasyonu ve TRAP bir fare modelinde hidrodinamik kuyruk-ven enjeksiyonu birleştiren bir yöntem göstermek hepatositlerin ifade profilini incelemek için.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

TRAP-seq ile RNA'yı belirli hücre tiplerinden izole edebiliriz, örneğin yaralı karaciğerde yeniden oluşan hepatositler gibi bu hücrelerde meydana gelen gen ekspresyonu değişikliklerini analiz edebiliriz. Bu doku istenmeyen hücreleri kaldırmak için herhangi bir adım gerektirmez. Hücre tipine özgü RNA tüm organ lysates gelen yakınlık saflaştırma ile izole edilir.Bu teknik, belirli hücrelerin yaralanmalara nasıl tepki verebileceğini belirlememize yardımcı olur, bu da karaciğer hastalığıyla mücadele etmek için yeni stratejiler veya ilaçlar belirlemenize yardımcı olabilir. Bu karaciğer hücrelerinin karaciğer yaralanmaları farklı türde nasıl tepki belirlemek için kullanılabilir. Şu anda, ciddi akut karaciğer yaralanmaları için birkaç seçenek vardır ve bu yöntem yeni tedaviler bize ipucu yardımcı olacaktır.Bu yöntem beyin kökenli. Karaciğerde, biz hücre tipleri çeşitli dinamik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir öngörülen, hepatositler, safra kanalı hücreleri, Kupffer hücreleri, ve endotel hücreleri birkaç isim. Prosedürü gösteren Amber Wang, yüksek lisans öğrencisi ve benim mentee olacaktır.Başlamak için, nazik pipetleme ile manyetik boncuklar resuspend. Bir dakikadan fazla bir manyetik standında boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Daha sonra, manyetik standdan mikrosantrifüj tüp çıkarın ve PBS bir mililitre ekleyin, boncuk yıkamak için yukarı ve aşağı pipetleme izledi.Boncukları toplamak ve PBS'yi çıkarmak için tüpü manyetik standa bir dakikadan fazla yerleştirin. Protein L kaplı boncuklar hazırlamak için, resuspended ve yıkanmış manyetik boncuklar için biyotinylated protein L 16 mikrolitre ekleyin ve son hacmi bir mililitre yapmak için 1X PBS ekleyin, bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp kullanıyorsanız, veya 1.5 mililitre, iki mililitre mikrocentrifuge tüp kullanıyorsanız. Manyetik boncukları biyotinylated protein L ile 35 dakika oda sıcaklığında bir tüp rotator üzerinde kuluçka.Daha sonra, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve protein L kaplı boncuk toplamak için supernatant çıkarın. Manyetik standdan mikrosantrifüj tüp çıkarın ve% 3 BSA tampon ile PBS bir mililitre ekleyin, protein L kaplı boncuk yıkamak için en az beş kez nazik pipetleme izledi. Yine, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve kaplamalı boncuk toplamak için supernatant çıkarın.BSA'yı dört kez daha yıkadıktan sonra tekrarlayın. Daha sonra, GFP antikor 19C8 ve GFP antikor 19F7 her protein L-kaplı boncukiçine antikorlar 50 mikrogram ekleyin ve bir tüp rotator üzerinde dört derece santigrat bir saat kuluçka. Yakınlık matristoplamak için, bir dakikadan fazla manyetik standı üzerinde tüp yerleştirin ve supernatant çıkarın.Tüpü manyetik standdan uzaklaştırın ve bir mililitre düşük tuz tamponu ekleyin. Afiyet matrisini yıkamak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın ve düşük tuz tamponunu iki kez daha yıkayın. 200 mikrolitre düşük tuz tamponu ndaki boncukları yeniden askıya alın ve 200 mikrolitre afinite matrisi yapın.İlk olarak, ptfe cam tüplerhomojenizasyon sırasında buz üzerine yerleştirilebilir böylece doku öğütücü kurmak. PTFE cam tüpleriçine soğuk lysis tampon dört mililitre doldurun. Karaciğeri petri kabına koy.Karaciğer parçaları 200 ila 500 miligram izole etmek ve PTFE cam tüpler içine taşımak için bir bıçak kullanın. Sıvı azot içinde önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp ve flaş dondurma içine kalan karaciğer dokusu yerleştirin. Karaciğer yapısından hepatositleri ayrıştırmak için en az beş vuruş için 300 rpm'den başlayarak, motorlu homojenleştiricideki numuneleri homojenize edin.Cam tüpü her seferinde indirin. Pestisiti çözeltinin altında tutarak protein denatürasyonuna neden olabilecek havalandırmayı önleyin. Daha sonra, tam olarak en az 12 tam vuruş için karaciğer dokuları homojenize 900 rpm hızını yükseltmek.Lysate'yi, her biri bir mililitreden fazla olmayan etiketli ve önceden soğutulmuş tüplere aktarın. Nükleer lysis başlatmak için, 10 dakika boyunca 4 santigrat derece 2,000 kez g karaciğer lysate santrifüj, sonra buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüpüne %10 NP-40'lık süpernatant hacminin 1/9'u ekleyin ve tüpü yavaşça ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.Hızlı bir mini santrifüj ile mikrocentrifuge tüpler aşağı spin ve% 10 DOC örnek hacminin 1/9th ekleyin. Mikrocentrifuge tüpleri yavaşça ters çevirerek karıştırın ve hızlı bir şekilde mikrocentrifuge tüpler aşağı spin ve beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 20, 000 kez g'de nükleer lysate'yi santrifüj edin ve süpernatantı buz üzerinde yeni önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplere aktarın.Her tüp için, pre-immünoprepitasyon kontrolü olarak supernatant toplam hacminin% 1 almak. İmmünoprepreresians itkontrolleri bir gecede dört derece bir tüp rotatörüüzerine yerleştirin. Pipetleme ile afinite matrisi nazikçe askıya almaya dikkat edin, ardından her numuneye 200 mikrolitre ekleyin.Bir tüp rotator üzerinde nazik karıştırma ile bir gecede dört derece santigrat lysates inkübün. RNA'yı izole etmek için, mini santrifüjdeki lysatları içeren tüpleri hızlıca aşağı doğru döndürün ve en az bir dakika boyunca manyetik rafa koyarak boncukları toplayın. Ek mikrosantrifüj tüplerde supernatant toplayın.Her tüpe bir mililitre taze yüksek tuz tamponu ekleyin ve ardından kabarcıkları tanıtmadan en az beş kez hafif pipetleme. Bir dakikadan fazla buz üzerinde manyetik standı üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Yıkama adımlarını dört kez daha tekrarlayın.Daha sonra, manyetik standdan mikrosantrifüj tüpleri çıkarın ve ısınmak için beş dakika oda sıcaklığında yer. 100 mikrolitre likit tampondaki boncukları 0,7 mikrolitre beta-mercaptoetanol ile yeniden askıya alarak bağlı RNA'yı yakınlık matrisinden serbest bırakın. En yüksek hızda en az beş saniye boyunca tüplergirdeve hızlı bir şekilde aşağı spin.Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri en az bir dakika boyunca manyetik standa yerleştirin, sonra süpernatant'ı toplayın ve kitteki RNA temizleme protokolüne göre derhal RNA temizliğine devam edin. İzole RNA maksimum kalite elde etmek için, 60 santigrat derece ye elüsasyon tampon önerilen ön ısıtma da dahil olmak üzere DNa sindirimi ve tüm RNA elüsyon adımları da dahil olmak üzere tüm isteğe bağlı adımları gerçekleştirin.Bu çalışmada, GFP-L10A füzyonu ve Fah transgenler hidrodinamik enjeksiyon ile karaciğerlere transpozon içeren plazmid trap vektörü içinde birlikte teslim edildi. Nitisinone'nin çıkarılması toksik karaciğer hasarına neden oldu. İmmünofloresan boyama FAH ve GFP-L10A füzyon proteini ve karaciğer repopülasyon iki hafta sonra repopulating hepatositlerin birlikte ekspresyonu doğruladı.Tüm hepatositler AAV8-TBG-Cre enjeksiyonundan sonra GFP-L10A ekspresinden bu yana, quiescent numunesi en yüksek füzyon proteinverisini üretti. Tersine, ancak herhangi bir RNA GFP-L10A transgene yoktu vahşi tipi kontrollerde tespit edildi, TRAP prosedürü son derece spesifik olduğunu gösteren ve düşük bir arka plan var. GFP-L10A transdüktüllü hepatositile repopülasyon geçiren karaciğer dokusunda TRAP kullanıldığında bol miktarda yüksek kaliteli RNA elde edildi.Buna karşılık, negatif kontrol örneği için Bioanalyzer ile RNA izi saptanmadı. Gsta1 ekspresyonu, heratositlerin yeniden doldurulmasında, quiescent hepatositlere göre on kat daha fazla indüklenmiş, giriş RNA eksikliği nedeniyle vahşi tip fareden TRAP-izole RNA ile eşik döngüsü değerleri saptanmadı. Doku homojenize ederken, havalandırmayı önlemek için yavaş yavaş pestle hareket emin olun.RNA izole sonra, yüksek-throughput sekanslama veya qPCR gen ekspresyonu analiz etmek için yapılabilir. TRAP-seq ile, şimdi özellikle hepatositler repopulating Gelen RNA izole etmek ve karaciğer repopulation sırasında gen ekspresyonundaki değişimi analiz etmek için bir yöntem var. Bu bize bu süreç sırasında değiştirilmiş genleri ve karaciğer hasarının tedavisi için potansiyel terapötik hedefleri belirlemenize olanak sağlar.Siklohekamid ve DTT, çeşitli tamponlar mevcut, her ikisi de toksik. Atıklar kurumsal kurallara göre toplanmalı ve atılmalıdır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Spinal Cord Electrophysiology

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...