Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

ويعترف المؤلفون بالجهود البطولية التي بذلتها مونيكا لوكاس ، وكاثرين شو ، وريان تايلور ، وجاريد تومسون ، ونيكول روبيهرود ، وهوب هيلي للمساعدة في تربيه الأسماك ، وجمع البيانات ، وتطوير البروتوكولات المبكرة. ونود أيضا ان نشكر المستعرضين الثلاثة علي اقتراحاتهم المقدمة إلى المخطوطة. ونحن نعتقد ان المنتج النهائي لتكون ذات نوعيه أفضل بعد معالجه تعليقاتهم. وقد تم تمويل هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم #1644965 و#1455405 إلى JRG ، ومنحه المدير الخاص لمجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية إلى VLS.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه ولاية ميشيغان.
1. تحديد أهداف sgRNA
ملاحظه: يتم توفير بروتوكول للتصميم اليدوي من sgRNAs في الخطوة 1.1. وقد استخدم هذا لاختيار الهدف scn4aa . ويتم توفير ب...

ان الثراء الظاهري للأسماك الكهربائية الضعيفة ، إلى جانب الانتشار الأخير لموارد الجينوم ، يحفز الحاجة القوية للأدوات الجينية الوظيفية في نموذج السمك الكهربائي الضعيف. هذا النظام جذاب بشكل خاص بسبب التطور المتقارب للعديد من الصفات الظاهرية في السلالات المتوازية من الأسماك ، والتي يتم الا...

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة1،2،3.
ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clades ، والتي تنتج والكشف عن الحقول الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية بشكل ضعيف. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء لاستشعار محيطها والتواصل4، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية1،5 ،6، نظم ودوائر علم الأعصاب7،8،9،10، فسيولوجيا الخلوية11،12، الإيكولوجيا و تصغر13 ،14،15،16،17، السلوك18،19، و ماكروايفوليوشن3،20،21 .
في الاونه الاخيره ، كان هناك انتشار الجينوم ، الناسخ ، والموارد البروتينية للأسماك الكهربائية1،22،23،24،25،26، 27و28. وقد أسفر استخدام هذه الموارد بالفعل عن رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع1و2و3و28و29 ،30. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية31.
واحده من هذه الاداات هي التي تم تطويرها مؤخرا متفاوت المسافات المتقاربة بانتظام المتناظرة القصيرة التكرارات المقترنة مع كاس 9 نوكليوداز (CRISPR/كاس 9 ، CRISPR) تقنيه. Crispr/كاس 9 هو أداه تحرير الجينوم التي دخلت استخداما واسع النطاق في كل من نموذج32،33،34 وغير الكائنات النموذجية35،36،37 علي حد سواء. وقد تقدمت تكنولوجيا CRISPR/كاس 9 إلى نقطه حيث يمكن للمختبر قادر علي البيولوجيا الجزيئية الاساسيه بسهوله توليد تحقيقات الجينات الخاصة تسمي الإرشاد القصير RNAs (sgRNAs) ، بتكلفه منخفضه باستخدام طريقه عدم الاستنساخ38. Crispr لديه مزايا علي غيرها من الضربات القاضية/الضربة القاضية استراتيجيات, مثل مورفولينوس39,40, النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens), والزنك الاصبع نوكليسيس (zfns), التي هي مكلفه و تستغرق وقتا طويلا لتوليد كل الجينات المستهدفة.
وظائف نظام CRISPR/كاس 9 لخلق الضربات القاضية الجينات من خلال استهداف منطقه معينه من الجينوم ، من إخراج تسلسل sgRNA ، وتسبب كسر التي تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم الكشف عن الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل من قبل الخلية ويحفز أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية بتفضيل باستخدام المسار غير المتماثلة نهاية الانضمام (NHEJ). هذا المسار هو عرضه للخطا للغاية: خلال عمليه الإصلاح ، وجزيء الحمض النووي وغالبا ما تدمج الادراج أو الحذف (indels) في موقع كسر التي تقطعت بها السبل مزدوجة. هذه العوامل يمكن ان يؤدي إلى فقدان وظيفة بسبب اما (1) التحولات في اطار القراءة المفتوحة ، (2) ادراج codon توقف سابق لأوانه ، أو (3) التحولات في البنية الاساسيه الحرجة من المنتج الجيني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم CRISPR/كاس 9 التحرير إلى الطفرات نقطه الهدف في الجينات المستهدفة باستخدام NHEJ في أنواع الأسماك الكهربائية ضعيفه. في حين ابسط وأكثر كفاءه من التقنيات الأخرى ، ومن المتوقع ان يؤدي هذا الأسلوب من الطفرات في مجموعه من السلالات الظاهرية في F0، والذي يعزي إلى الجينات الوراثية41،42،43 ،44.
اختيار الكائنات الحية ولأغراض تيسير الدراسات المقبلة بشان الجينوم المقارن للأسماك الكهربائية الضعيفة ، هناك حاجه إلى اختيار نوع تمثيلي لكل من النماذج الرياضية والmormyrids لتطوير البروتوكول. وفي أعقاب المناقشات التي جرت خلال اجتماع 2016 الأسماك الكهربائية في مونتيفيديو ، اوروغواي ، كان هناك توافق في الآراء بين المجتمعات المحلية لاستخدام الأنواع التي يمكن تربيتها بالفعل في المختبر والتي تتوفر لديها موارد جينيه. وقد تم اختيار الأنواع التي تناسب هذه المعايير والتي تم تحديدها بالشكل المثالي لهذا النوع من الكائنات. في كلا النوعين ، من السهل تقليد العظة الطبيعية للحث علي ظروف التكاثر والحفاظ عليها في الأسر. B. gauderio، الأنواع عاريه الشكل من أمريكا الجنوبية ، لديه ميزه انخفاض متطلبات التربية: يمكن الاحتفاظ بالأسماك في كثافة عاليه نسبيا في الدبابات الصغيرة نسبيا (4 لتر). B. gauderio لديها أيضا دوران الأجيال بسرعة في ظل ظروف الأسير. تحت الظروف المختبرية ، b. gauderio يمكن ان تتطور من البيض إلى الكبار في حوالي 4 أشهر.
B. بالضغط الذاتي ، وهو نوع من الأسماك القنوميه من غرب وسط افريقيا ، والسلالات بسهوله في الأسر. B. بسهوله المتاحة من خلال التجارة حوض السمك ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من الدراسات ، والآن لديها عدد من الموارد الجينوم المتاحة. تمتد دوره حياتهم من 1 − 3 سنوات ، اعتمادا علي الظروف المختبرية. وتعد متطلبات التربية أكثر كثافة إلى حد ما بالنسبة لهذه الأنواع ، التي تتطلب دبابات متوسطه الحجم (50 − 100 لتر) بسبب عدوانها اثناء التكاثر.
وينبغي ان تكون المختبرات التي تدرس أنواعا أخرى من الأسماك الكهربائية قادره علي تكييف هذا البروتوكول بسهوله ما دام النوع يمكن ان يولد ، ويمكن جمع أجنه الخلايا الوحيدة وتربيتها في مرحله البلوغ. ومن المرجح ان تتغير معدلات الإسكان وتربيه اليرقات والإخصاب في الأنابيب مع الأنواع الأخرى ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطه انطلاق لمحاولات تربيه في الأسماك الكهربائية الأخرى ضعيفه.
هدف الجينات المثالي لإثبات المفهوم: scn4aa [مورلي] كهربائيه [مورميريد] و [غنوتيفورم] سمكه يلدون [الكتريك فيلد] ([الكتروجينيسيس]) ب يقيل جهاز يختص, يدعي الجهاز كهربائيه. تصريف الأعضاء الكهربائية (EODs) نتيجة لإنتاج في وقت واحد من إمكانات العمل في خلايا الجهاز الكهربائي يسمي الكتروسيتس. يتم الكشف عن EODs بواسطة مجموعه من المستقبلات الكهربية في الجلد لإنشاء صور كهربائيه عاليه الدقة لمحيط الأسماك45. الأسماك الكهربائية ضعيفه هي أيضا قادره علي الكشف عن ملامح الموجات التخلص من الذخائر المتفجرة الخاصة بهم18 وكذلك معدلات التفريغ الخاصة بهم46، مما يسمح eods للعمل بالاضافه إلى ذلك كاشاره الاتصالات الاجتماعية مماثله للطيور أو الضفدع النطق47.
المكون الرئيسي للعمل توليد المحتملة في الكهرباء من كلا القنوميه وعاريه السمك الكهربائية ضعيف هو الجهد بوابات قناه الصوديوم التنقل 1.42. لاكهربائية تيليوستس التعبير عن نسختين بارالوجوس الجينات ، scn4aa و scn4ab، والترميز لقناه الصوديوم الجهد بوابات التنقل 1.430. في كل من عاريه الشكل و القنوميه الأسماك الكهربائية ضعيفه السلالات, scn4aa تطورت بسرعة وخضع العديد من البدائل الأحماض الامينيه التي تؤثر علي خصائصه الحركية48. الأهم من ذلك ، أصبح scn4aa مجزاه في كلا السلالتين إلى الجهاز الكهربائي2،3. التعبير المقيد نسبيا من scn4aa إلى الجهاز الكهربائي ، فضلا عن دورها الرئيسي في توليد المواد المستنفدة للأوزون ، يجعلها هدفا مثاليا لتجارب الضربة القاضية crispr/كاس 9 ، كما ان لديها الحد الأدنى من الآثار الوخيمة الضارة. لان الأسماك الكهربائية الضعيفة تبدا التفريغ أجهزتهم الكهربائية اليرقات 6 − 8 أيام بعد الإخصاب (DPF) ، واستهداف scn4aa هو مناسبه بشكل مثالي للنمط الظاهري السريع بعد الحقن المجهري الجنين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. هناك درجه مذهله من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المشتقة بشكل مستقل ، والتي تشترك في الهندسة الوراثية المشتركة. ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست التوثيق التي تنتج والكشف عن المجالات الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية ضئيله. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء للشعور محيطها والتواصل ، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية والنظم والدوائر علم الأعصاب ، فسيولوجيا الخلوية ، والإيكولوجيا ، والبيولوجيا التطورية ، والسلوك. وفي الاونه الاخيره ، كان هناك تكاثر في الموارد الجينية للأسماك الكهربائية. وقد يسر استخدام هذه الموارد بالفعل رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية. نحن الإبلاغ هنا بروتوكول كامل لأداء CRISPR/كاس 9 الطفرات التي تستخدم أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية في الأسماك الكهربائية ضعيف. ونحن نثبت ان هذا البروتوكول هو نفس القدر من الفعالية في كل من الأنواع القنوميه بالضغط البري والضرب بالضغط العضلي الخاص gauderio باستخدام crispr/كاس 9 لاستهداف indels ونقطه الطفرات في اكسون الأول من قناه الصوديوم الجينات scn4aa. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول علي الاجنه من كلا النوعين والتنميط الجيني للتاكد من ان الطفرات المتوقعة في أول اكسون من قناه الصوديوم scn4aa كانت موجودة. تم تاكيد النمط الظاهري نجاح ضربه الخروج مع التسجيلات التي تظهر انخفاض الجهاز الكهربائية التفريغ السعه بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة حجم غير المحقونة.

تم تحديد المواقع المستهدفة sgrna ضمن اكسون 1 من scn4aa في كل من b. gauderio و b. بالضغط الموضعي كما هو موضح في القسم 1. تم إنشاء sgRNAs كما هو موضح في القسم 2. بعد نجاح sgRNA الاختيار والتوليف (الشكل 1) ، تم اختبار الانقسام في المختبر (الشكل 2). وبعد ذلك تم اختيار ال sgR...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنتاج والخلفية CRISPR/كاس 9 الجينوم الأسماك الكهربائية ضربه قاضيه. المبينة بالتفصيل هي البيولوجيا الجزيئية المطلوبة ، وتربيه ، ومتطلبات تربيه لكل من عاريه القدمين والفطريات ، وتقنيات الحقن لإنتاج كاس 9 المستحثة اليرقات F0 .

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

سوف CRISPR / Cas9 تحرير الجينات في الأسماك الكهربائية ضعيفة ، لا سيما في سياق مقارن ، وتمكين الباحثين لاختبار الفرضيات حول كيفية الجينات المحددة والتباين الجينية تسهم في الاختلاف الظاهري. CRISPR/Cas9 هي طريقة فعالة لتوليد الأجنة المتحولة F-صفر. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإجراء تلاعبات CRISPR-Cas9 في نوعين متطورين بشكل متقارب من الأسماك الكهربائية الضعيفة.ومفتاح استخدام هذا النهج مع إدخال بعض التعديلات على الأسماك الكهربائية الأخرى أو الأنواع الأخرى من الأسماك هو توافر الموارد المستنسخة أو الجينومية لصنع الـ sgRNAs. يمكن أن يكون من الصعب إجراء الحقن المجهري وتصور الخلايا في موقع ثلاثي الأبعاد داخل مستوى 2D. الحصول على مستعمرة صغيرة حمار وحشي للبيض لممارسة تقنيات الحقن المجهرية العامة.إثبات الإجراء مع سافاس كونستانتينو سيكون جاريد طومسون، وهو فني من مختبري. بعد إسكان أنواع الأسماك ذات الأهمية في ظل ظروف التربية المناسبة، وتحديد الأسماك الإناث التي تظهر gravid. في (بي غوديريو)، سيكون لدى الأنثى تورم الغدد التناسلية فقط في فتحة التهوية.في B.brachyistius الإناث سوف يكون البطون منتفخة وتبدو عميقة الجسم. بعد التخدير، إضافة عامل تفريخ إلى أربعة أضعاف حجم DPBS في أنبوب PCR مع خلط شامل. الحل سوف تصبح غائمة.استخدام ماصة لقياس الجرعة المحسوبة والاستغناء عن وكيل المخفف unto قطعة من البلاستيك الحراري قبل سحب الحل في حقنة الزجاج الدقة مجهزة 28 قياس 19 إلى 25 ملليلتر طول إبرة مشطوفة. حقن الحل في العضلات الجذع الظهرية بمعدل سلس والسماح للإبرة الجلوس لمدة 2-4 ثوان قبل الإزالة. ثم، على الفور وضع الأسماك في المياه النظام العذبة للانتعاش.لجمع الحيوانات المنوية B.gauderio، بعد 24 ساعة، حدد سمكة كبيرة الذكور وبأسرع وقت ممكن بعد التخدير، وتجفيف الأسماك جيدا، وخاصة حول الرأس وتنفيس. وضع الجانب البطني الأسماك المجففة حتى, أمام اليسار في حامل المناسبة, مغطاة في منشفة ورقية رطبة غارقة MS222 مع الرأس بالتوازي مع الجدول قدر الإمكان. تطبيق الضغط فورا في السد إلى اتجاه المرسخ مع الضغط على الفور الضوء على الرناد نحو تنفيس واستخدام micropipetter مع طرف، وجمع بعناية الحيوانات المنوية كما هو تقلص من الذكور في زيادات 50 ميكرولتر.إضافة aliquot من الحيوانات المنوية مباشرة على 500 microliter كميات من الحيوانات المنوية الموسع الحل على الجليد. مباشرة بعد جمع، ووضع الأسماك في حماية اللورة معطف المياه المعالجة المنتج نظام طازج. لجمع البيض B.gauderio، بعد تجفيف سمكة أنثى B.gauderio تخدير، على الفور وضع الأسماك على جانبها مع الرأس التي تواجه اليد غير دومينانت وتطبيق الضغط في السد إلى الاتجاه الرسترالي مع ضوء الضغط medially على السناد نحو تنفيس.باستخدام أداة البوليتيترافلورو الإيثيلين، وجمع بعناية البيض كما يتم ضغطها من كلواكا ووضع البيض بسرعة في طبق بيتري مغطاة صغيرة. إذا كان العمل وحده بعد الضغط، لمس كتلة البيض إلى قاعدة طبق بيتري الصغيرة كما يتم طردهم من الأنثى. مباشرة بعد جمع البيض، ووضع الأسماك في حماية من اللوين معطف المنتج المعالجة المياه النظام الطازج.بالنسبة لـ B.gauderio في الإخصاب في المختبر، أضف 100 ميكرولترات من محلول SES المختلط بشكل جيد للحيوانات المنوية مباشرة فوق كتلة البويضة، تليها ملليلتر واحد من مياه النظام العذب. اخلطي تعليق الأماشعة جيدًا لمدة 30 إلى 60 ثانية قبل إضافة ملليلتر إضافي من 0.22 ميكرومتر مصفّح من مياه النظام إلى الخلايا. ضع الطبق مع وقت الإخصاب في المختبر ووضع الطبق في حاضنة درجة مئوية 29 ، ووضع مؤقت لمدة 50 دقيقة للتحقق من تقدم التطوير.خلال فترة الإخصاب، استخدم طرف ماصة microloader لتحميل حمولة 2 microliters من محلول الحقن من الفائدة في إبرة الحقن المجهري وطرد السائل أقرب إلى طرف ممكن. عندما تكون خلية واحدة في القطب الحيواني من خلية واحدة على الأقل، نقل الطبق تحت مجهر تشريح واستخدام زوج من ملقط غرامة لكسر طرف إبرة في زاوية مشطوفة نحو حيث يبدأ تفتق الإبرة لإثبات صلابة. وينبغي أن تتحمل من الإبرة تبقى صغيرة قدر الإمكان مع الحفاظ على تفتق جامدة.تحديد zygotes النامية تحت المجهر واستخدام ماصة نقل البلاستيك مع قطع تلميح لوضع 10 إلى 20 بيضة في أقل قدر ممكن من الماء على حافة شريحة المجهر الزجاجي المنصوص عليها في الجزء العلوي المقلوب من طبق بيتري. باستخدام مسح مهمة حساسة، اضغط بلطف على الشريحة لإزالة المياه الزائدة للسماح للبيض بالتمسك بقوة بحافة الشريحة. وسوف يكون الماء الأشرار تحت الشريحة وسحب البيض ضد الحافة.يجب أن يكون هناك ما يكفي من الماء فقط للحفاظ على البيض رطبة مع الحفاظ على القليل من الرطوبة الدائمة لتجنب حركة البيض أثناء الحقن. محاذاة البيض ضد الشريحة عموديا، عمودي على إبرة تقترب، واستخدام micromanipulator لوضع الإبرة ضد المشيمية. ثم، عقد الإبرة في زاوية 45 درجة تقريبا، وإدراج طرف الأولى في chorion ومن ثم، في خلية واحدة، وحقن من خلال صفار إذا كان ذلك ممكنا.إزالة أي البيض المكسور أثناء الحقن مع ملقط غرامة. عندما تم حقن كل من البيض، واستخدام زجاجة بخ من 0.22 ميكرومتر المسام تصفية المياه النظام لطرد بلطف البيض من مرحلة الحقن في طبق بيتري جديد قطره 100 ملليمتر. بعد اختيار RNAs دليل قصير ناجح والتوليف، يمكن اختبار الانقسام في المختبر لاختيار لصغر الخلايا واحدة.بعد PCR تنظيف والاستنساخ، في هذه التجربة التمثيلية، تم تحديد الطفرات المستحثة CRISPR-Cas9 في استنساخ B.gauderio و B.brachyistius الفردية مع انخفاض سعة التفريغ الكهربائي للأعضاء القوي، في حين أن الضوابط غير المحددة المعروضة فقط الأنماط الجينية المشار إليها. التصور من سعة تصريف الأعضاء الكهربائية بين المسوخ كريسبر وأكد وحجم وكيل مطابقة الضوابط غير مفككة أظهرت أن كلا SCN-4 AA متحولة B.brachyistius وأجنة B.gauderio كان أقل بكثير من نطاقات تصريف الجهاز الكهربائي من الضوابط. عند إجراء الحقن الدقيقة، تحرك بأسرع وتعمد قدر الإمكان لزيادة عدد الأجنة المحقونة أحادية الخلية التي تبقى على قيد الحياة.لا تضيع الوقت مع البيض الصعب. وبمجرد تحديد المسوخ الناجحة، يمكن لطرق التربية التقليدية أن تخلق خطوطاً متحولة مستقرة، مما يقضي على المخاوف المتعلقة بالفسيفساء المرتبطة بالفسيفساء. وسيتيح هذا البروتوكول للباحثين إجراء دراسات جينية مقارنة مع التحقق الوظيفي في نوعين من الأسماك الكهربائية المتطورة بشكل متقارب.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

بناء طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر باستخدام تقنية كريسبر / كاس 9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...