Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

ويعترف المؤلفون بالجهود البطولية التي بذلتها مونيكا لوكاس ، وكاثرين شو ، وريان تايلور ، وجاريد تومسون ، ونيكول روبيهرود ، وهوب هيلي للمساعدة في تربيه الأسماك ، وجمع البيانات ، وتطوير البروتوكولات المبكرة. ونود أيضا ان نشكر المستعرضين الثلاثة علي اقتراحاتهم المقدمة إلى المخطوطة. ونحن نعتقد ان المنتج النهائي لتكون ذات نوعيه أفضل بعد معالجه تعليقاتهم. وقد تم تمويل هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم #1644965 و#1455405 إلى JRG ، ومنحه المدير الخاص لمجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية إلى VLS.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه ولاية ميشيغان.
1. تحديد أهداف sgRNA
ملاحظه: يتم توفير بروتوكول للتصميم اليدوي من sgRNAs في الخطوة 1.1. وقد استخدم هذا لاختيار الهدف scn4aa . ويتم توفير ب...

ان الثراء الظاهري للأسماك الكهربائية الضعيفة ، إلى جانب الانتشار الأخير لموارد الجينوم ، يحفز الحاجة القوية للأدوات الجينية الوظيفية في نموذج السمك الكهربائي الضعيف. هذا النظام جذاب بشكل خاص بسبب التطور المتقارب للعديد من الصفات الظاهرية في السلالات المتوازية من الأسماك ، والتي يتم الا...

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة1،2،3.
ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clades ، والتي تنتج والكشف عن الحقول الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية بشكل ضعيف. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء لاستشعار محيطها والتواصل4، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية1،5 ،6، نظم ودوائر علم الأعصاب7،8،9،10، فسيولوجيا الخلوية11،12، الإيكولوجيا و تصغر13 ،14،15،16،17، السلوك18،19، و ماكروايفوليوشن3،20،21 .
في الاونه الاخيره ، كان هناك انتشار الجينوم ، الناسخ ، والموارد البروتينية للأسماك الكهربائية1،22،23،24،25،26، 27و28. وقد أسفر استخدام هذه الموارد بالفعل عن رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع1و2و3و28و29 ،30. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية31.
واحده من هذه الاداات هي التي تم تطويرها مؤخرا متفاوت المسافات المتقاربة بانتظام المتناظرة القصيرة التكرارات المقترنة مع كاس 9 نوكليوداز (CRISPR/كاس 9 ، CRISPR) تقنيه. Crispr/كاس 9 هو أداه تحرير الجينوم التي دخلت استخداما واسع النطاق في كل من نموذج32،33،34 وغير الكائنات النموذجية35،36،37 علي حد سواء. وقد تقدمت تكنولوجيا CRISPR/كاس 9 إلى نقطه حيث يمكن للمختبر قادر علي البيولوجيا الجزيئية الاساسيه بسهوله توليد تحقيقات الجينات الخاصة تسمي الإرشاد القصير RNAs (sgRNAs) ، بتكلفه منخفضه باستخدام طريقه عدم الاستنساخ38. Crispr لديه مزايا علي غيرها من الضربات القاضية/الضربة القاضية استراتيجيات, مثل مورفولينوس39,40, النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens), والزنك الاصبع نوكليسيس (zfns), التي هي مكلفه و تستغرق وقتا طويلا لتوليد كل الجينات المستهدفة.
وظائف نظام CRISPR/كاس 9 لخلق الضربات القاضية الجينات من خلال استهداف منطقه معينه من الجينوم ، من إخراج تسلسل sgRNA ، وتسبب كسر التي تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم الكشف عن الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل من قبل الخلية ويحفز أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية بتفضيل باستخدام المسار غير المتماثلة نهاية الانضمام (NHEJ). هذا المسار هو عرضه للخطا للغاية: خلال عمليه الإصلاح ، وجزيء الحمض النووي وغالبا ما تدمج الادراج أو الحذف (indels) في موقع كسر التي تقطعت بها السبل مزدوجة. هذه العوامل يمكن ان يؤدي إلى فقدان وظيفة بسبب اما (1) التحولات في اطار القراءة المفتوحة ، (2) ادراج codon توقف سابق لأوانه ، أو (3) التحولات في البنية الاساسيه الحرجة من المنتج الجيني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم CRISPR/كاس 9 التحرير إلى الطفرات نقطه الهدف في الجينات المستهدفة باستخدام NHEJ في أنواع الأسماك الكهربائية ضعيفه. في حين ابسط وأكثر كفاءه من التقنيات الأخرى ، ومن المتوقع ان يؤدي هذا الأسلوب من الطفرات في مجموعه من السلالات الظاهرية في F0، والذي يعزي إلى الجينات الوراثية41،42،43 ،44.
اختيار الكائنات الحية ولأغراض تيسير الدراسات المقبلة بشان الجينوم المقارن للأسماك الكهربائية الضعيفة ، هناك حاجه إلى اختيار نوع تمثيلي لكل من النماذج الرياضية والmormyrids لتطوير البروتوكول. وفي أعقاب المناقشات التي جرت خلال اجتماع 2016 الأسماك الكهربائية في مونتيفيديو ، اوروغواي ، كان هناك توافق في الآراء بين المجتمعات المحلية لاستخدام الأنواع التي يمكن تربيتها بالفعل في المختبر والتي تتوفر لديها موارد جينيه. وقد تم اختيار الأنواع التي تناسب هذه المعايير والتي تم تحديدها بالشكل المثالي لهذا النوع من الكائنات. في كلا النوعين ، من السهل تقليد العظة الطبيعية للحث علي ظروف التكاثر والحفاظ عليها في الأسر. B. gauderio، الأنواع عاريه الشكل من أمريكا الجنوبية ، لديه ميزه انخفاض متطلبات التربية: يمكن الاحتفاظ بالأسماك في كثافة عاليه نسبيا في الدبابات الصغيرة نسبيا (4 لتر). B. gauderio لديها أيضا دوران الأجيال بسرعة في ظل ظروف الأسير. تحت الظروف المختبرية ، b. gauderio يمكن ان تتطور من البيض إلى الكبار في حوالي 4 أشهر.
B. بالضغط الذاتي ، وهو نوع من الأسماك القنوميه من غرب وسط افريقيا ، والسلالات بسهوله في الأسر. B. بسهوله المتاحة من خلال التجارة حوض السمك ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من الدراسات ، والآن لديها عدد من الموارد الجينوم المتاحة. تمتد دوره حياتهم من 1 − 3 سنوات ، اعتمادا علي الظروف المختبرية. وتعد متطلبات التربية أكثر كثافة إلى حد ما بالنسبة لهذه الأنواع ، التي تتطلب دبابات متوسطه الحجم (50 − 100 لتر) بسبب عدوانها اثناء التكاثر.
وينبغي ان تكون المختبرات التي تدرس أنواعا أخرى من الأسماك الكهربائية قادره علي تكييف هذا البروتوكول بسهوله ما دام النوع يمكن ان يولد ، ويمكن جمع أجنه الخلايا الوحيدة وتربيتها في مرحله البلوغ. ومن المرجح ان تتغير معدلات الإسكان وتربيه اليرقات والإخصاب في الأنابيب مع الأنواع الأخرى ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطه انطلاق لمحاولات تربيه في الأسماك الكهربائية الأخرى ضعيفه.
هدف الجينات المثالي لإثبات المفهوم: scn4aa [مورلي] كهربائيه [مورميريد] و [غنوتيفورم] سمكه يلدون [الكتريك فيلد] ([الكتروجينيسيس]) ب يقيل جهاز يختص, يدعي الجهاز كهربائيه. تصريف الأعضاء الكهربائية (EODs) نتيجة لإنتاج في وقت واحد من إمكانات العمل في خلايا الجهاز الكهربائي يسمي الكتروسيتس. يتم الكشف عن EODs بواسطة مجموعه من المستقبلات الكهربية في الجلد لإنشاء صور كهربائيه عاليه الدقة لمحيط الأسماك45. الأسماك الكهربائية ضعيفه هي أيضا قادره علي الكشف عن ملامح الموجات التخلص من الذخائر المتفجرة الخاصة بهم18 وكذلك معدلات التفريغ الخاصة بهم46، مما يسمح eods للعمل بالاضافه إلى ذلك كاشاره الاتصالات الاجتماعية مماثله للطيور أو الضفدع النطق47.
المكون الرئيسي للعمل توليد المحتملة في الكهرباء من كلا القنوميه وعاريه السمك الكهربائية ضعيف هو الجهد بوابات قناه الصوديوم التنقل 1.42. لاكهربائية تيليوستس التعبير عن نسختين بارالوجوس الجينات ، scn4aa و scn4ab، والترميز لقناه الصوديوم الجهد بوابات التنقل 1.430. في كل من عاريه الشكل و القنوميه الأسماك الكهربائية ضعيفه السلالات, scn4aa تطورت بسرعة وخضع العديد من البدائل الأحماض الامينيه التي تؤثر علي خصائصه الحركية48. الأهم من ذلك ، أصبح scn4aa مجزاه في كلا السلالتين إلى الجهاز الكهربائي2،3. التعبير المقيد نسبيا من scn4aa إلى الجهاز الكهربائي ، فضلا عن دورها الرئيسي في توليد المواد المستنفدة للأوزون ، يجعلها هدفا مثاليا لتجارب الضربة القاضية crispr/كاس 9 ، كما ان لديها الحد الأدنى من الآثار الوخيمة الضارة. لان الأسماك الكهربائية الضعيفة تبدا التفريغ أجهزتهم الكهربائية اليرقات 6 − 8 أيام بعد الإخصاب (DPF) ، واستهداف scn4aa هو مناسبه بشكل مثالي للنمط الظاهري السريع بعد الحقن المجهري الجنين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. هناك درجه مذهله من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المشتقة بشكل مستقل ، والتي تشترك في الهندسة الوراثية المشتركة. ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست التوثيق التي تنتج والكشف عن المجالات الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية ضئيله. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء للشعور محيطها والتواصل ، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية والنظم والدوائر علم الأعصاب ، فسيولوجيا الخلوية ، والإيكولوجيا ، والبيولوجيا التطورية ، والسلوك. وفي الاونه الاخيره ، كان هناك تكاثر في الموارد الجينية للأسماك الكهربائية. وقد يسر استخدام هذه الموارد بالفعل رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية. نحن الإبلاغ هنا بروتوكول كامل لأداء CRISPR/كاس 9 الطفرات التي تستخدم أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية في الأسماك الكهربائية ضعيف. ونحن نثبت ان هذا البروتوكول هو نفس القدر من الفعالية في كل من الأنواع القنوميه بالضغط البري والضرب بالضغط العضلي الخاص gauderio باستخدام crispr/كاس 9 لاستهداف indels ونقطه الطفرات في اكسون الأول من قناه الصوديوم الجينات scn4aa. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول علي الاجنه من كلا النوعين والتنميط الجيني للتاكد من ان الطفرات المتوقعة في أول اكسون من قناه الصوديوم scn4aa كانت موجودة. تم تاكيد النمط الظاهري نجاح ضربه الخروج مع التسجيلات التي تظهر انخفاض الجهاز الكهربائية التفريغ السعه بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة حجم غير المحقونة.

تم تحديد المواقع المستهدفة sgrna ضمن اكسون 1 من scn4aa في كل من b. gauderio و b. بالضغط الموضعي كما هو موضح في القسم 1. تم إنشاء sgRNAs كما هو موضح في القسم 2. بعد نجاح sgRNA الاختيار والتوليف (الشكل 1) ، تم اختبار الانقسام في المختبر (الشكل 2). وبعد ذلك تم اختيار ال sgR...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنتاج والخلفية CRISPR/كاس 9 الجينوم الأسماك الكهربائية ضربه قاضيه. المبينة بالتفصيل هي البيولوجيا الجزيئية المطلوبة ، وتربيه ، ومتطلبات تربيه لكل من عاريه القدمين والفطريات ، وتقنيات الحقن لإنتاج كاس 9 المستحثة اليرقات F0 .

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

سوف CRISPR / Cas9 تحرير الجينات في الأسماك الكهربائية ضعيفة ، لا سيما في سياق مقارن ، وتمكين الباحثين لاختبار الفرضيات حول كيفية الجينات المحددة والتباين الجينية تسهم في الاختلاف الظاهري. CRISPR/Cas9 هي طريقة فعالة لتوليد الأجنة المتحولة F-صفر. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإجراء تلاعبات CRISPR-Cas9 في نوعين متطورين بشكل متقارب من الأسماك الكهربائية الضعيفة.ومفتاح استخدام هذا النهج مع إدخال بعض التعديلات على الأسماك الكهربائية الأخرى أو الأنواع الأخرى من الأسماك هو توافر الموارد المستنسخة أو الجينومية لصنع الـ sgRNAs. يمكن أن يكون من الصعب إجراء الحقن المجهري وتصور الخلايا في موقع ثلاثي الأبعاد داخل مستوى 2D. الحصول على مستعمرة صغيرة حمار وحشي للبيض لممارسة تقنيات الحقن المجهرية العامة.إثبات الإجراء مع سافاس كونستانتينو سيكون جاريد طومسون، وهو فني من مختبري. بعد إسكان أنواع الأسماك ذات الأهمية في ظل ظروف التربية المناسبة، وتحديد الأسماك الإناث التي تظهر gravid. في (بي غوديريو)، سيكون لدى الأنثى تورم الغدد التناسلية فقط في فتحة التهوية.في B.brachyistius الإناث سوف يكون البطون منتفخة وتبدو عميقة الجسم. بعد التخدير، إضافة عامل تفريخ إلى أربعة أضعاف حجم DPBS في أنبوب PCR مع خلط شامل. الحل سوف تصبح غائمة.استخدام ماصة لقياس الجرعة المحسوبة والاستغناء عن وكيل المخفف unto قطعة من البلاستيك الحراري قبل سحب الحل في حقنة الزجاج الدقة مجهزة 28 قياس 19 إلى 25 ملليلتر طول إبرة مشطوفة. حقن الحل في العضلات الجذع الظهرية بمعدل سلس والسماح للإبرة الجلوس لمدة 2-4 ثوان قبل الإزالة. ثم، على الفور وضع الأسماك في المياه النظام العذبة للانتعاش.لجمع الحيوانات المنوية B.gauderio، بعد 24 ساعة، حدد سمكة كبيرة الذكور وبأسرع وقت ممكن بعد التخدير، وتجفيف الأسماك جيدا، وخاصة حول الرأس وتنفيس. وضع الجانب البطني الأسماك المجففة حتى, أمام اليسار في حامل المناسبة, مغطاة في منشفة ورقية رطبة غارقة MS222 مع الرأس بالتوازي مع الجدول قدر الإمكان. تطبيق الضغط فورا في السد إلى اتجاه المرسخ مع الضغط على الفور الضوء على الرناد نحو تنفيس واستخدام micropipetter مع طرف، وجمع بعناية الحيوانات المنوية كما هو تقلص من الذكور في زيادات 50 ميكرولتر.إضافة aliquot من الحيوانات المنوية مباشرة على 500 microliter كميات من الحيوانات المنوية الموسع الحل على الجليد. مباشرة بعد جمع، ووضع الأسماك في حماية اللورة معطف المياه المعالجة المنتج نظام طازج. لجمع البيض B.gauderio، بعد تجفيف سمكة أنثى B.gauderio تخدير، على الفور وضع الأسماك على جانبها مع الرأس التي تواجه اليد غير دومينانت وتطبيق الضغط في السد إلى الاتجاه الرسترالي مع ضوء الضغط medially على السناد نحو تنفيس.باستخدام أداة البوليتيترافلورو الإيثيلين، وجمع بعناية البيض كما يتم ضغطها من كلواكا ووضع البيض بسرعة في طبق بيتري مغطاة صغيرة. إذا كان العمل وحده بعد الضغط، لمس كتلة البيض إلى قاعدة طبق بيتري الصغيرة كما يتم طردهم من الأنثى. مباشرة بعد جمع البيض، ووضع الأسماك في حماية من اللوين معطف المنتج المعالجة المياه النظام الطازج.بالنسبة لـ B.gauderio في الإخصاب في المختبر، أضف 100 ميكرولترات من محلول SES المختلط بشكل جيد للحيوانات المنوية مباشرة فوق كتلة البويضة، تليها ملليلتر واحد من مياه النظام العذب. اخلطي تعليق الأماشعة جيدًا لمدة 30 إلى 60 ثانية قبل إضافة ملليلتر إضافي من 0.22 ميكرومتر مصفّح من مياه النظام إلى الخلايا. ضع الطبق مع وقت الإخصاب في المختبر ووضع الطبق في حاضنة درجة مئوية 29 ، ووضع مؤقت لمدة 50 دقيقة للتحقق من تقدم التطوير.خلال فترة الإخصاب، استخدم طرف ماصة microloader لتحميل حمولة 2 microliters من محلول الحقن من الفائدة في إبرة الحقن المجهري وطرد السائل أقرب إلى طرف ممكن. عندما تكون خلية واحدة في القطب الحيواني من خلية واحدة على الأقل، نقل الطبق تحت مجهر تشريح واستخدام زوج من ملقط غرامة لكسر طرف إبرة في زاوية مشطوفة نحو حيث يبدأ تفتق الإبرة لإثبات صلابة. وينبغي أن تتحمل من الإبرة تبقى صغيرة قدر الإمكان مع الحفاظ على تفتق جامدة.تحديد zygotes النامية تحت المجهر واستخدام ماصة نقل البلاستيك مع قطع تلميح لوضع 10 إلى 20 بيضة في أقل قدر ممكن من الماء على حافة شريحة المجهر الزجاجي المنصوص عليها في الجزء العلوي المقلوب من طبق بيتري. باستخدام مسح مهمة حساسة، اضغط بلطف على الشريحة لإزالة المياه الزائدة للسماح للبيض بالتمسك بقوة بحافة الشريحة. وسوف يكون الماء الأشرار تحت الشريحة وسحب البيض ضد الحافة.يجب أن يكون هناك ما يكفي من الماء فقط للحفاظ على البيض رطبة مع الحفاظ على القليل من الرطوبة الدائمة لتجنب حركة البيض أثناء الحقن. محاذاة البيض ضد الشريحة عموديا، عمودي على إبرة تقترب، واستخدام micromanipulator لوضع الإبرة ضد المشيمية. ثم، عقد الإبرة في زاوية 45 درجة تقريبا، وإدراج طرف الأولى في chorion ومن ثم، في خلية واحدة، وحقن من خلال صفار إذا كان ذلك ممكنا.إزالة أي البيض المكسور أثناء الحقن مع ملقط غرامة. عندما تم حقن كل من البيض، واستخدام زجاجة بخ من 0.22 ميكرومتر المسام تصفية المياه النظام لطرد بلطف البيض من مرحلة الحقن في طبق بيتري جديد قطره 100 ملليمتر. بعد اختيار RNAs دليل قصير ناجح والتوليف، يمكن اختبار الانقسام في المختبر لاختيار لصغر الخلايا واحدة.بعد PCR تنظيف والاستنساخ، في هذه التجربة التمثيلية، تم تحديد الطفرات المستحثة CRISPR-Cas9 في استنساخ B.gauderio و B.brachyistius الفردية مع انخفاض سعة التفريغ الكهربائي للأعضاء القوي، في حين أن الضوابط غير المحددة المعروضة فقط الأنماط الجينية المشار إليها. التصور من سعة تصريف الأعضاء الكهربائية بين المسوخ كريسبر وأكد وحجم وكيل مطابقة الضوابط غير مفككة أظهرت أن كلا SCN-4 AA متحولة B.brachyistius وأجنة B.gauderio كان أقل بكثير من نطاقات تصريف الجهاز الكهربائي من الضوابط. عند إجراء الحقن الدقيقة، تحرك بأسرع وتعمد قدر الإمكان لزيادة عدد الأجنة المحقونة أحادية الخلية التي تبقى على قيد الحياة.لا تضيع الوقت مع البيض الصعب. وبمجرد تحديد المسوخ الناجحة، يمكن لطرق التربية التقليدية أن تخلق خطوطاً متحولة مستقرة، مما يقضي على المخاوف المتعلقة بالفسيفساء المرتبطة بالفسيفساء. وسيتيح هذا البروتوكول للباحثين إجراء دراسات جينية مقارنة مع التحقق الوظيفي في نوعين من الأسماك الكهربائية المتطورة بشكل متقارب.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

تحديد الربط البديل والبولي أدينيل في بيانات RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...