Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Les auteurs reconnaissent les efforts héroïques de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud et Hope Healey pour obtenir de l'aide pour l'élevage des poissons, la collecte de données et le développement précoce du protocole. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs pour leurs suggestions au manuscrit. Nous croyons que le produit final est de meilleure qualité après avoir répondu à leurs commentaires. Ces travaux ont été financés par le soutien de la National Science Foundation #1644965 et #1455405 à JRG, et la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie DG à VLS.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Michigan.
1. Sélection des cibles sgRNA
REMARQUE: Un protocole est prévu pour la conception manuelle des sgRNAs à l'étape 1.1. Ceci a été utilisé pour la sélection de la cible scn4aa. Un protocole supplémentaire est fourni pour faciliter ce processus (étape 1.2) à l'aide du...

La richesse phénotypique des poissons faiblement électriques, ainsi qu'une prolifération récente des ressources génomiques, motivent un fort besoin d'outils génomiques fonctionnels dans le modèle de poisson faiblement électrique. Ce système est particulièrement attrayant en raison de l'évolution convergente de nombreux traits phénotypiques dans les lignées parallèles de poissons, qui sont facilement conservés en laboratoire.
Le protocole décrit ici démontre l'efficacité de la...

L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Deux lignées de poissons teleost, ostéoglossiformes et siluriformes, électroréception évoluée en parallèle, et cinq lignées de teleosts (gymnotiformes, mormyrides, et les genres Astroscopus, Malapterurus, et Synodontis) l'électrogenèse évoluée en parallèle. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune1,2,3.
C'est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléost, riches en espèces, qui produisent et détectent des champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Dans les 50 ans depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l'électricité pour sentir leur environnement et de communiquer4, une communauté croissante de scientifiques a acquis des connaissances énormes dans l'évolution du développement1,5 ,6, systèmes et circuitsneurosciences 7,8,9,10, physiologie cellulaire11,12, écologie et énergie13 ,14,15,16,17, comportement18,19, et macroévolution3,20,21 .
Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques, transcriptomiques et protéomiques pour les poissons électriques1,22,23,24,25,26, 27,28. L'utilisation de ces ressources a déjà produit des informations importantes sur le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces1,2,3,28,29 ,30. Un obstacle majeur à l'intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d'outils de génomique fonctionnelle31.
L'un de ces outils est la technique récemment développée clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats jumelée à la technique de l'endoucase Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 est un outil d'édition du génome qui est entré dans une utilisation généralisée dans les deux modèles32,33,34 et les organismes non-modèles35,36,37 de même. La technologie CRISPR/Cas9 a progressé à un point tel qu'un laboratoire capable de biologie moléculaire de base peut facilement générer des sondes spécifiques aux gènes appelées ARN à guide court (sgARN), à faible coût en utilisant une méthode de non-clonage38. CRISPR a des avantages par rapport à d'autres stratégies knock/knockdown, telles que les morpholinos39,40, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs), et les nucléases de doigts de zinc (ZNNs), qui sont coûteuses et temps à générer pour chaque gène cible.
Le système CRISPR/Cas9 fonctionne pour créer des kogènes en ciblant une région spécifique du génome, dirigée par la séquence sgRNA, et en provoquant une rupture à double brin. La rupture à double brin est détectée par la cellule et déclenche des mécanismes de réparation de l'ADN endogène de préférence en utilisant la voie de jointure non-homologue (NHEJ). Cette voie est très sujette aux erreurs : pendant le processus de réparation, la molécule d'ADN incorporera souvent des insertions ou des suppressions (indels) sur le site de rupture à double brin. Ces indels peuvent entraîner une perte de fonction due soit à (1) des changements dans le cadre de lecture ouverte, (2) l'insertion d'un codon d'arrêt prématuré, ou (3) des changements dans la structure primaire critique du produit génique. Dans ce protocole, nous utilisons l'édition CRISPR/Cas9 pour cibler les mutations ponctuelles dans les gènes cibles à l'aide du NHEJ chez les espèces de poissons faiblement électriques. Bien que plus simple et plus efficace que d'autres techniques, cette méthode de mutagénèse devrait se traduire par une gamme de séquilosités phénotypiques en F0, qui est attribuée au mosaïsme génétique41,42,43 ,44.
Sélection d'organismes Afin de faciliter les études futures sur la génomique comparative des poissons faiblement électriques, une espèce représentative des gymnotiformes et des mormyrides pour le développement du protocole devait être sélectionnée. À la suite des discussions qui ont eu lieu lors de la réunion 2016 sur les poissons électriques à Montevideo, en Uruguay, il y a eu consensus communautaire pour utiliser des espèces qui pouvaient déjà être élevées en laboratoire et qui disposaient de ressources génomiques. Le gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio et le mormyrid Brienomyrus brachyistius ont été sélectionnés comme espèces qui correspondent à ces critères. Chez les deux espèces, les indices naturels pour induire et maintenir les conditions de reproduction sont faciles à imiter en captivité. B. gauderio, une espèce de gymnotiforme d'Amérique du Sud, a l'avantage de faibles exigences d'élevage : les poissons peuvent être maintenus à densité relativement élevée dans des réservoirs relativement petits (4 L). B. gauderio a également un chiffre d'affaires générationnel rapide dans des conditionscaptives. Dans des conditions de laboratoire, B. gauderio peut se développer de l'œuf à l'adulte en environ 4 mois.
B. brachyistius, une espèce de poisson mormyride d'Afrique centrale de l'Ouest, se reproduit facilement en captivité. B. brachyistius est facilement disponible dans le commerce de l'aquarium, a été largement utilisé dans de nombreuses études, et dispose maintenant d'un certain nombre de ressources génomiques disponibles. Leur cycle de vie s'étend sur 1 à 3 ans, selon les conditions de laboratoire. Les exigences en matière d'élevage sont un peu plus intenses pour cette espèce, ce qui nécessite des réservoirs de taille moyenne (50 à 100 L) en raison de leur agressivité pendant la reproduction.
Les laboratoires qui étudient d'autres espèces de poissons électriques devraient être en mesure d'adapter facilement ce protocole tant que l'espèce peut être élevée, et que les embryons à cellule unique peuvent être recueillis et élevés à l'âge adulte. Les taux de logement, d'élevage larvaire et de fécondation in vitro (FIV) changeront probablement avec d'autres espèces; cependant, ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour les tentatives de reproduction chez d'autres poissons faiblement électriques.
Une cible génétique idéale pour la preuve de concept: scn4aa Les poissons mormyrides et gymnotiformes faiblement électriques génèrent des champs électriques (électrogenèse) en déchargeant un organe spécialisé, appelé l'orgue électrique. Les décharges d'organes électriques (EOD) résultent de la production simultanée de potentiels d'action dans les cellules d'organes électriques appelées électrocytes. Les EOD sont détectés par un éventail d'électrorécepteurs dans la peau pour créer des images électriques à haute résolution de l'environnement du poisson45. Les poissons faiblement électriques sont également capables de détecter les caractéristiques des formes d'onde EOD18 de leurs conspécifiques ainsi que leurs taux de décharge46, permettant aux EOD de fonctionner en plus comme un signal de communication sociale analogue au chant des oiseaux ou à la grenouille vocalisations47.
Un composant principal de la génération potentielle d'action dans les électrocytes des poissons faiblement électriques mormyrid et gymnotiform est le canal de sodium tension-fermé NaV1.42. Les teleosts non-électriques expriment deux copies de gène paralogous, scn4aa et scn4ab,codage pour le canal de sodium à la tension NaV1.430. Dans les lignées de poissons à la fois gymnotiformes et mormyrides faiblement électriques, scn4aa a évolué rapidement et a subi de nombreuses substitutions d'acides aminés qui affectent ses propriétés cinétiques48. Plus important encore, scn4aa est devenu compartimenté dans les deux lignées à l'orgue électrique2,3. L'expression relativement limitée de scn4aa à l'orgue électrique, ainsi que son rôle clé dans la génération d'EODs, en fait une cible idéale pour les expériences PAR KO CRISPR/Cas9, car il a des effets pléiotropes délétères minimes. Étant donné que les poissons faiblement électriques commencent à décharger leurs organes électriques larvaires 6 à 8 jours après la fécondation (DPF), le ciblage du scn4aa est idéal pour le phénotypage rapide après la microinjection d'embryons.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune. C'est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléostriche d'espèces qui produisent et détectent les champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Au cours des 50 années qui se sont écoulés depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l'électricité pour sentir leur environnement et communiquer, une communauté croissante de scientifiques a acquis d'énormes connaissances sur l'évolution du développement, des systèmes et des circuits de neurosciences, physiologie cellulaire, l'écologie, la biologie évolutive et le comportement. Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques pour le poisson électrique. L'utilisation de ces ressources a déjà facilité d'importantes connaissances en ce qui concerne le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces. Un obstacle majeur à l'intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d'outils de génomique fonctionnelle. Nous rapportons ici un protocole complet pour effectuer la mutagénèse DE CRISPR/Cas9 qui utilise des mécanismes endogènes de réparation d'ADN dans les poissons faiblement électriques. Nous démontrons que ce protocole est également efficace dans les deux espèces mormyrides Brienomyrus brachyistius et le brachyhypopomus gauderio gymnotiforme en utilisant CRISPR/Cas9 pour cibler des indels et des mutations ponctuelles dans le premier exon de la gène du canal de sodium scn4aa. À l'aide de ce protocole, des embryons des deux espèces ont été obtenus et génotypes pour confirmer que les mutations prédites dans le premier exon du canal de sodium scn4aa étaient présentes. Le phénotype de succès knock-out a été confirmé avec des enregistrements montrant des amplitudes réduites de décharge électrique d'organe comparées aux contrôles non injectés de taille-assortis.

Les sites cibles de sgRNA ont été identifiés dans l'exon 1 de scn4aa dans B. gauderio et B. brachyistius comme décrit dans la section 1. Les sgRNAs ont été générés comme décrit à la section 2. Après une sélection et une synthèse réussies de l'ARSS (Figure 1), le clivage in vitro a été testé (Figure 2). Les sgRNAs démontrant la coupe in vitro ont ensuite été sélectionnés pour des microinjections à cellule unique....

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Ici, un protocole est présenté pour produire et élever des poissons électriques KNOCKOUT génome CRISPR/Cas9. Les exigences requises en matière de biologie moléculaire, de reproduction et d'élevage pour un gymnotiforme et un mormyride, ainsi que les techniques d'injection pour produire des larves d'indel F0 induites par Cas9 sont décrites en détail.

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

L’édition des gènes CRISPR/Cas9 chez les poissons faiblement électriques, en particulier dans un contexte comparatif, permettra aux chercheurs de tester des hypothèses sur la façon dont des gènes spécifiques et la variance génétique contribuent à la variation phénotypique. CRISPR/Cas9 est une méthode efficace pour générer des embryons mutants F-zéro. Ce protocole permet aux chercheurs d’effectuer des manipulations CRISPR-Cas9 chez deux espèces convergentement évoluées de poissons faiblement électriques.La clé de l’utilisation de cette approche avec quelques modifications chez d’autres poissons électriques ou d’autres espèces de poissons est la disponibilité de ressources transcriptomiques ou génomiques pour fabriquer des SGARN. Il peut être difficile d’effectuer les microinjections et de visualiser les cellules dans un emplacement 3D à l’intérieur d’un plan 2D. Obtenez une petite colonie de poissons zèbres pour que les œufs pratiquent des techniques générales de microinjection.Jared Thompson, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec Savvas Constantinou. Après avoir abrité les espèces de poissons d’intérêt dans les conditions de reproduction appropriées, identifier les poissons femelles qui semblent gravid. Dans B.gauderio, la femelle aura des 9ades gonflées juste caudales à l’évent.Chez B.brachyistius, les femelles auront le ventre gonflé et semblent corsées. Après l’administration d’anesthésie, ajouter l’agent de frai à quatre fois le volume de DPBS dans un tube PCR avec un mélange complet. La solution deviendra trouble.Utilisez une pipette pour mesurer la dose calculée et distribuer l’agent dilué à un morceau de thermoplastique avant de dessiner la solution dans une seringue en verre de précision équipée d’une aiguille biseauté de 28 calibres de 19 à 25 millilitres. Injecter la solution dans le muscle du tronc dorsal à un rythme lisse et laisser reposer l’aiguille pendant deux à quatre secondes avant l’enlèvement. Ensuite, placez immédiatement le poisson dans l’eau du système frais pour la récupération.Pour la collecte de sperme B.gauderio, après 24 heures, sélectionnez un gros poisson mâle et aussi rapidement que possible après la sédation, séchez soigneusement le poisson, en particulier autour de la tête et de l’évent. Placez le côté ventral de poisson séché vers le haut, antérieur vers la gauche dans le support approprié, couvert d’une serviette en papier humide trempée MS222 avec la tête aussi parallèle que possible à la table. Appliquez immédiatement une pression dans la direction caudale à rostrale avec une légère compression immédiatement sur les 9ades vers l’évent et à l’aide d’un micropipetter avec une pointe, recueillir soigneusement le sperme car il est pressé du mâle par incréments de 50 microlitres.Ajouter aliquot de sperme directement sur des volumes de 500 microlitres de solution d’extension de sperme sur la glace. Immédiatement après la collecte, placer le poisson dans de l’eau du système frais traitée par le produit de protection contre la boue. Pour la collecte d’oeufs B.gauderio, après séchage d’un poisson femelle anesthésié B.gauderio, placez immédiatement le poisson sur le côté avec la tête face à la main non dominante et appliquez une pression dans la direction caudale à rostrale avec une légère compression médiocre sur les 9ds vers l’évent.À l’aide d’un outil en polytétrafluoroéthylène, recueillir soigneusement les œufs lorsqu’ils sont pressés du cloaque et placer rapidement les œufs dans une petite boîte de Pétri couverte. Si vous travaillez seul après avoir compressionné, touchez la masse d’œufs à la base de la petite boîte de Pétri lorsqu’ils sont expulsés de la femelle. Immédiatement après la collecte des œufs, placez le poisson dans de l’eau du système frais traitée par le produit de protection contre la boue.Pour la fécondation in vitro B.gauderio, ajouter 100 microlitres de la solution ses sperme bien mélangé directement sur la masse d’ovule, suivie d’un millilitre d’eau du système frais. Mélanger soigneusement la suspension des gamètes pendant 30 à 60 secondes avant d’ajouter un à deux millilitres supplémentaires d’eau de système filtrée par pore de 0,22 micromètre aux cellules. Étiquetez le plat avec le temps de fécondation in vitro et placez le plat dans un incubateur de 29 degrés Celsius, en fixant une minuterie de 50 minutes pour vérifier l’état d’avancement du développement.Pendant la période de fertilisation, utilisez une pointe de pipette microchargeur pour recharger deux microlitres de la solution d’injection d’intérêt dans une aiguille de microinjection et expulser le liquide le plus près possible de la pointe. Lorsqu’une seule cellule s’est formée au pôle animal d’au moins une cellule, transférez le plat sous un microscope disséquant et utilisez une paire de forceps fins pour briser la pointe de l’aiguille à un angle biseauté vers l’endroit où le cône de l’aiguille commence à démontrer la rigidité. L’alésage de l’aiguille doit rester aussi petit que possible tout en maintenant un cône rigide.Identifiez les zygotes en développement au microscope et utilisez une pipette de transfert en plastique avec une pointe coupée pour placer 10 à 20 œufs dans le moins d’eau possible sur le bord de la lame de microscope en verre fixée dans le dessus inversé de la boîte de Pétri. À l’aide d’un chiffon de tâche délicat, appuyez doucement sur la lame pour enlever l’excès d’eau pour permettre aux œufs d’adhérer fermement au bord de la lame. L’eau sera méchante sous la lame et tirera des oeufs contre le bord.Il devrait y avoir juste assez d’eau pour garder les oeufs humides tout en maintenant peu d’humidité debout pour éviter le mouvement d’oeuf pendant l’injection. Alignez les œufs contre la glissière verticalement, perpendiculairement à l’aiguille qui approche, et utilisez un micromanipulateur pour positionner l’aiguille contre la chorion. Ensuite, en tenant l’aiguille à un angle d’environ 45 degrés, insérez d’abord la pointe dans la chorion, puis, dans la cellule unique, en injectant par le jaune si possible.Retirer les œufs cassés pendant l’injection avec des forceps fins. Lorsque tous les œufs ont été injectés, utilisez une bouteille de gicler de 0,22 micromètre d’eau filtrée du système pour rincer doucement les œufs du stade d’injection dans une nouvelle boîte petri de 100 millimètres de diamètre. À la suite d’un court guide réussi de sélection et de synthèse des ARN, le clivage in vitro peut être testé pour la sélection des microinjections à cellules simples.Après le nettoyage et le clonage de PCR, dans cette expérience représentative, des mutations induites crispr-cas9 ont été identifiées dans les clones individuels de B.gauderio et de B.brachyistius avec la réduction forte d’amplitude électrique de décharge d’organe, alors que les contrôles non injectés ont montré seulement les génotypes référencés. La visualisation de l’amplitude de décharge d’organe électrique entre les mutants confirmés de CRISPR et la taille d’agent a assorti des contrôles non injectés a démontré que les embryons mutants de B.brachyistius et de B.gauderio de SCN-4 AA ont eu des amplitudes significativement inférieures de décharge d’organe électrique que des contrôles. Lors de l’exécution des micro-injections, déplacez-vous aussi rapidement et délibérément que possible pour maximiser le nombre d’embryons injectés à une cellule qui survivent.Ne perdez pas de temps avec des œufs difficiles. Une fois que les mutants réussis ont été identifiés, les méthodes de reproduction traditionnelles peuvent créer des lignées mutantes stables, qui éliminent les préoccupations de mosaicism associées au CRSPR. Ce protocole permettra aux chercheurs de mener des études génomiques comparatives avec validation fonctionnelle chez deux espèces convergentement évoluées de poissons faiblement électriques.

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Recherche

Biologie

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Génération de suppressions génomiques dans des lignées cellulaires de mammifères via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Génome Édition dans<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Injections de nymphes et d’adultes pour l’arNi et l’édition de gènes CRISPR chez Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

Transition endothéliale à mésenchymateuse médiée par TGF-β (EndMT) et évaluation fonctionnelle des effecteurs EndMT à l’aide de l’édition du gène CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...