Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Die Autoren würdigen die heldenhaften Bemühungen von Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud und Hope Healey um Hilfe bei der Fischzucht, der Datensammlung und der frühen Protokollentwicklung. Wir möchten auch den drei Rezensenten für ihre Vorschläge zum Manuskript danken. Wir glauben, dass das Endprodukt von besserer Qualität ist, nachdem sie ihre Kommentare angesprochen haben. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der National Science Foundation #1644965 und #1455405 an JRG und die Stiftung Naturwissenschaften und Ingenieurforschung AN VLS finanziert.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt.
1. Auswahl von sgRNA-Zielen
HINWEIS: Für die manuelle Gestaltung von sgRNAs in Schritt 1.1 wird ein Protokoll bereitgestellt. Dies wurde für die scn4aa-Zielauswahl verwendet. Um diesen Prozess (Schritt 1.2) über das EFISHGENOMICS-Webportal zu erleichtern, wird ein zusätzliches Protokoll bereitgestellt. E...

Der phänoseische Reichtum schwach elektrischer Fische, zusammen mit einer kürzlichen Verbreitung von Genomressourcen, motiviert einen starken Bedarf an funktionellen Genomwerkzeugen im schwach elektrischen Fischmodell. Dieses System ist besonders attraktiv wegen der konvergenten Entwicklung zahlreicher phänotypischer Merkmale in parallelen Fischlinien, die leicht im Labor gehalten werden können.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-Technik in Linien schwach...

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Zwei Linien von Teleostfischen, Osteoglossiformen und Siluriformen, entwickelten parallel den Elektroempfang und fünf Linien von Teleosten (Gymnotiformes, Mormyriden und die Gattungen Astroscopus, Malapterurus und Synodontis) Elektrogenese parallel entwickelt. Es gibt einen auffälligen Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetischeArchitektur1,2,3.
Dies lässt sich vielleicht am besten an den zahlreichen konvergenten Merkmalen von Gymnotiformen und Mormyriden, zwei artenreichen Teleostkladen, am besten, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und als schwach elektrische Fische bezeichnet werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität verwenden, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren4, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklunggewonnen 1,5 ,6, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften7,8,9,10, Zellphysiologie11,12, Ökologie und Energetik13 ,14,15,16,17, Verhalten18,19und Makroevolution3,20,21 .
In jüngerer Zeit gab es eine Vermehrung von genomischen, transkriptomischen und proteomischen Ressourcen für elektrische Fische1,22,23,24,25,26, 27,28. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten1,2,3,28,29 ,30. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten von schwach elektrischen Fischen ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools31.
Ein solches Tool ist die kürzlich entwickelte Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats gepaart mit Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) Technik. CRISPR/Cas9 ist ein Genom-Editing-Tool, das sowohl in Modell32,33,34 als auch in Nicht-Modellorganismen35,36,37 gleichermaßen weit verbreitet ist. Die CRISPR/Cas9-Technologie hat sich so weit entwickelt, dass ein Labor, das in der Lage ist, grundlegende Molekularbiologie zu verwenden, problemlos genspezifische Sonden, sogenannte Kurzguide-RNAs (sgRNAs), zu niedrigen Kosten mit einer Nicht-Klonmethode38erzeugen kann. CRISPR hat Vorteile gegenüber anderen Knockout/Knockdown-Strategien, wie Morpholinos39,40, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleases (TALENs) und Zinkfingernukleasen (ZFNs), die teuer und zeitaufwändig für jedes Zielgen zu generieren.
Das CRISPR/Cas9-System funktioniert, um Genknockouts zu erzeugen, indem es auf eine bestimmte Region des Genoms abzielt, die durch die sgRNA-Sequenz gesteuert wird, und einen doppelsträngigen Bruch verursacht. Der doppelsträngige Bruch wird von der Zelle nachgewiesen und löst endogene DNA-Reparaturmechanismen vorzugsweise über den nicht-homologen Endjoining (NHEJ) aus. Dieser Weg ist sehr fehleranfällig: Während des Reparaturprozesses wird das DNA-Molekül oft Insertionen oder Deletionen (Indels) an der doppelsträngigen Bruchstelle enthalten. Diese Indels können zu einem Funktionsverlust führen, entweder durch (1) Verschiebungen im offenen Leserahmen, (2) das Einfügen eines vorzeitigen Stop-Codons oder (3) Verschiebungen in der kritischen Primärstruktur des Genprodukts. In diesem Protokoll verwenden wir CRISPR/Cas9-Bearbeitung, um Punktmutationen in Zielgenen mit dem NHEJ in schwach elektrischen Fischarten zu zielen. Obwohl einfacher und effizienter als andere Techniken, wird diese Methode der Mutagenese voraussichtlich zu einer Reihe von phänotypischen Schweregraden in F0führen, die dem genetischenMosaik41,42,43 zugeschrieben wird. 44.
Auswahl von Organismen Um zukünftige Studien zur vergleichenden Genomik schwach elektrischer Fische zu erleichtern, musste eine repräsentative Art für Gymnotiformen und Mormyriden für die Protokollentwicklung ausgewählt werden. Nach Diskussionen während des Electric Fish Meeting 2016 in Montevideo, Uruguay, gab es einen Konsens in der Gemeinschaft, Arten zu nutzen, die bereits im Labor gezüchtet werden konnten und über genomische Ressourcen verfügten. Die Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio und die mormyrid Brienomyrus brachyistius wurden als Arten ausgewählt, die diesen Kriterien entsprechen. Bei beiden Arten sind natürliche Hinweise zur Induzieren und Aufrechterhaltung der Brutbedingungen in Gefangenschaft leicht nachzuahmen. B. gauderio, eine Gymnotiforme-Art aus Südamerika, hat den Vorteil eines geringen Haltungsbedarfs: Fische können in relativ kleinen (4 L) Tanks mit relativ hoher Dichte gehalten werden. B. gauderio hat auch einen schnellen Generationenumsatz unter captiveBedingungen. Unter Laborbedingungen kann sich B. gauderio in ca. 4 Monaten vom Ei zum Erwachsenen entwickeln.
B. brachyistius, eine Art von mormyrid Fischen aus West-Zentralafrika, brütet leicht in Gefangenschaft. B. brachyistius ist leicht über den Aquarienhandel verfügbar, wurde in vielen Studien weit verbreitet und verfügt nun über eine Reihe von genomischen Ressourcen zur Verfügung. Ihr Lebenszyklus erstreckt sich je nach Laborbedingungen über 1 bis 3 Jahre. Die Anforderungen an die Haltung sind für diese Art etwas intensiver und erfordern aufgrund ihrer Aggression während der Zucht mäßig große Tanks (50-100 L).
Laboratorien, die andere Arten von elektroelektrischen Fischen untersuchen, sollten in der Lage sein, dieses Protokoll leicht anzupassen, solange die Art gezüchtet werden kann, und einzellige Embryonen können gesammelt und ins Erwachsenenalter gebracht werden. Die Wohnungs-, Larvenhaltungs- und In-vitro-Fertilisationsraten (IVF) werden sich wahrscheinlich mit anderen Arten ändern; Dieses Protokoll kann jedoch als Ausgangspunkt für Zuchtversuche in anderen schwach elektrischen Fischen verwendet werden.
Ein ideales Genziel für den Proof of Concept: scn4aa Schwach elektrische mormyrid und gymnotiform Fische erzeugen elektrische Felder (Elektrogenese) durch das Entladen eines spezialisierten Organs, genannt das elektrische Organ. Elektrische Organentladungen (EODs) ergeben sich aus der gleichzeitigen Produktion von Aktionspotentialen in den elektrischen Organzellen, den sogenannten Elektrozyten. EODs werden von einer Reihe von Elektrorezeptoren in der Haut detektiert, um hochauflösende elektrische Bilder der Umgebung des Fisches zu erstellen45. Schwach elektrische Fische sind auch in der Lage, Merkmale der EOD-Wellenformen18 ihrer konspezifischen EOD sowie deren Entladungsraten46zu erkennen, so dass EODs zusätzlich als soziales Kommunikationssignal analog zu Vogelgezwitscher oder Frosch fungieren können. Vokalisationen47.
Ein Hauptbestandteil der Wirkungspotentialerzeugung in den Elektrozyten von mormyrid und gymnotiform schwach elektrischen Fischen istder spannungsgebundene Natriumkanal NaV1.42 . Nicht-elektrische Teleosts exprimieren zwei paralogische Genkopien, Scn4aa und Scn4ab, die für den spannungsgebundenen Natriumkanal NaV1.430kodieren. In gymnotiform und mormyrid schwach elektrische Fischlinien, Scn4aa hat sich schnell entwickelt und untergezogen zahlreiche Aminosäuresubstitutionen, die seine kinetischen Eigenschaften beeinflussen48. Am wichtigsten ist, scn4aa hat sich in beiden Linien zum elektrischen Organ2,3. Die relativ eingeschränkte Expression von Scn4aa auf das elektrische Organ sowie seine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von EODs machen es zu einem idealen Ziel für CRISPR/Cas9-Knockout-Experimente, da es minimale schädliche pleiotrope Effekte hat. Da schwach elektrische Fische 6-8 Tage nach der Befruchtung (DPF) beginnen, ihre larvenelektrischen Organe zu entladen, eignet sich die Gezielte ungegheiten von Scn4aa ideal für die schnelle Phänotypisierung nach der Embryo-Mikroinjektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Es gibt einen bemerkenswerten Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetische Architektur teilen. Dies wird vielleicht am besten durch die zahlreichen konvergenten Merkmale von Gymnotiformen und Mormyriden veranschaulicht, zwei artenreichen Teleostklades, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und schwach elektrischer Fisch genannt werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität nutzen, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklung, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften gewonnen, Zellphysiologie, Ökologie, Evolutionsbiologie und Verhalten. In jüngerer Zeit hat es eine Vermehrung genomischer Ressourcen für elektrische Fische gegeben. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten ermöglicht. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten schwach elektrischer Fische ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Mutagenese, das endogene DNA-Reparaturmechanismen in schwach elektrischen Fischen nutzt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll sowohl bei der mormyriden Art Brienomyrus brachyistius als auch bei der Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio gleichermaßen wirksam ist, indem wir CRISPR/Cas9 verwenden, um Indels und Punktmutationen im ersten Exon des Natriumkanalgen scn4aa. Mit diesem Protokoll wurden Embryonen beider Arten gewonnen und genotypisiert, um zu bestätigen, dass die vorhergesagten Mutationen im ersten Exon des Natriumkanals Scn4aa vorhanden waren. Der Knock-out-Erfolg-Phänotyp wurde mit Aufnahmen bestätigt, die reduzierte elektrische Organentladungsamplituden im Vergleich zu nicht injizierten größenangepassten Kontrollen zeigten.

Die sgRNA-Zielstandorte wurden innerhalb von Exon 1 von Scn4aa sowohl in B. gauderio als auch in B. brachyistius identifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Die sgRNAs wurden wie in Abschnitt 2 beschrieben generiert. Nach erfolgreicher sgRNA-Auswahl und -Synthese (Abbildung 1) wurde die In-vitro-Spaltung getestet (Abbildung 2). Die sgRNAs, die In-vitro-Schneiden demonstrieren, wurden dann für einzellige Mikroinjektionen ausgewählt...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Die CRISPR/Cas9-Genbearbeitung bei schwach elektrischen Fischen, insbesondere in einem vergleichenden Kontext, wird es den Forschern ermöglichen, Hypothesen darüber zu testen, wie spezifische Gene und genetische Varianz zur phänotypischen Variation beitragen. CRISPR/Cas9 ist eine effiziente Methode zur Erzeugung mutierter F-Null-Embryonen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, CRISPR-Cas9-Manipulationen in zwei konveretierten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.Der Schlüssel zur Verwendung dieses Ansatzes mit einigen Modifikationen in anderen elektrischen Fischen oder anderen Fischarten ist die Verfügbarkeit von transkriptomischen oder genomischen Ressourcen, um sgRNAs herzustellen. Die Durchführung der Mikroinjektionen und die Visualisierung der Zellen an einer 3D-Position innerhalb einer 2D-Ebene kann schwierig sein. Erhalten Sie eine kleine Zebrafischkolonie für Eier, um allgemeine Mikroinjektionstechniken zu praktizieren.Das Verfahren mit Savvas Constantinou demonstriert Jared Thompson, ein Techniker aus meinem Labor. Nachdem Sie die von Interesse befindlichen Fischarten unter den entsprechenden Brutbedingungen untergebracht haben, identifizieren Sie weibliche Fische, die gravid erscheinen. In B.gauderio wird das Weibchen geschwollene Gonaden nur kaudal zum Schlot haben.In B.brachyistius werden Weibchen geschwollene Bäuche haben und tiefkörperlich erscheinen. Nach der Anästhesie-Verabreichung, fügen Sie Laichmittel auf das Vierfache des Volumens von DPBS in einem PCR-Rohr mit gründlicher Mischung. Die Lösung wird trüb.Verwenden Sie eine Pipette, um die berechnete Dosis zu messen und das verdünnte Mittel auf ein Stück Thermoplast zu verteilen, bevor Sie die Lösung in eine Präzisionsglasspritze mit einer abgeschrägten Nadel mit einer Länge von 28 bis 25 Millilitern ziehen. Injizieren Sie die Lösung in den dorsalen Rumpfmuskel mit einer glatten Rate und lassen Sie die Nadel für zwei bis vier Sekunden vor der Entfernung sitzen. Dann sofort Fisch in frisches Systemwasser zur Erholung geben.Für B.gauderio Spermien-Sammlung, nach 24 Stunden, wählen Sie einen großen männlichen Fisch und so schnell wie möglich nach der Sedierung, trocknen Sie den Fisch gründlich, vor allem um den Kopf und Vent. Legen Sie die getrocknete Fisch-Ventralseite nach oben, vordernach links in einem geeigneten Halter, bedeckt mit einem MS222 getränkten feuchten Papiertuch mit dem Kopf so parallel wie möglich zum Tisch. Sofort Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich sofort über die Gonaden in Richtung des Entlüftungsschachts quetscht und mit einem Mikropipetter mit einer Spitze vorsichtig das Sperma sammelt, da es vom Männchen in 50-Mikroliter-Schritten gepresst wird.Fügen Sie Aliquot von Spermien direkt auf 500-Mikroliter-Volumen von Spermien-Extender-Lösung auf Eis. Unmittelbar nach der Sammlung Fisch in Schleimmantelschutz produktbehandeltes Frischsystemwasser geben. Für die B.gauderio-Ei-Sammlung, nach dem Trocknen eines anästhesierten B.gauderio weiblichen Fisches, legen Sie den Fisch sofort auf seine Seite mit dem Kopf zur nicht dominanten Hand und üben Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich medial über die Gonaden in Richtung entlüftung drückt.Mit einem Polytetrafluorethylen-Werkzeug die Eier vorsichtig sammeln, wie sie aus der Kloake gepresst werden, und legen Sie die Eier schnell in eine kleine bedeckte Petrischale. Wenn Sie nach dem Quetschen allein arbeiten, berühren Sie die Eimasse an die Basis der kleinen Petrischale, während sie vom Weibchen vertrieben werden. Unmittelbar nach dem Sammeln der Eier, legen Sie die Fische in Schleim Mantel Schutz Produkt behandelt frischesystem Wasser.Für die B.gauderio In-vitro-Fertilisation 100 Mikroliter der gut gemischten Spermien-SES-Lösung direkt über die Eimasse geben, gefolgt von einem Milliliter frischer Systemwasser. Mischen Sie die Gametes Suspension gründlich für 30 bis 60 Sekunden, bevor Sie den Zellen ein bis zwei Milliliter 0,22-Mikrometer Porengefiltertes Systemwasser hinzufügen. Beschriften Sie die Schale mit der In-vitro-Fertilisationszeit und legen Sie das Gericht in einen 29-Grad-Grad-Celsius-Inkubator, indem Sie einen 50-Minuten-Timer einstellen, um den Fortschritt der Entwicklung zu überprüfen.Verwenden Sie während der Düngungszeit eine Mikrolader-Pipettenspitze, um zwei Mikroliter der von Interesse sindden Injektionslösung in eine Mikroinjektionsnadel zu laden und die Flüssigkeit so nah wie möglich an der Spitze zu vertreiben. Wenn sich eine einzelne Zelle am Tierpol von mindestens einer Zelle gebildet hat, übertragen Sie die Schale unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie ein Paar feine Zangen, um die Nadelspitze in einem abgeschrägten Winkel zu brechen, wohin die Verjüngung der Nadel beginnt, Steifigkeit zu zeigen. Die Bohrung der Nadel sollte so klein wie möglich bleiben, während eine starre Verjüngung beibehalten wird.Identifizieren Sie die sich entwickelnden Zygoten unter dem Mikroskop und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um 10 bis 20 Eier in so wenig Wasser wie möglich auf den Rand des Glasmikroskopschlittens zu legen, das in der umgekehrten Oberseite der Petrischale gesetzt ist. Drücken Sie mit einem empfindlichen Aufgabenwischen vorsichtig die Rutsche, um das überschüssige Wasser zu entfernen, damit die Eier fest am Rand der Rutsche haften können. Wasser wird unter der Rutsche böse sein und Eier gegen den Rand ziehen.Es sollte gerade genug Wasser vorhanden sein, um die Eier feucht zu halten und dabei wenig stehende Feuchtigkeit zu erhalten, um die Eibewegung während der Injektion zu vermeiden. Richten Sie die Eier vertikal, senkrecht zur nahenden Nadel, und positionieren Sie die Nadel mit einem Mikromanipulator gegen den Chorion. Dann, halten Sie die Nadel in einem etwa 45-Grad-Winkel, legen Sie die Spitze zuerst in die Chorion und dann, in die Einzelzelle, injektionen durch das Eigelb, wenn möglich.Entfernen Sie alle gebrochenen Eier während der Injektion mit feinen Zangen. Wenn alle Eier injiziert wurden, verwenden Sie eine Spritzflasche mit 0,22 Mikrometer Porengefiltertem Systemwasser, um die Eier vorsichtig von der Injektionsstufe in eine neue Petrischale mit 100 MillimeterDurchmesser zu spülen. Nach einer erfolgreichen kurzen Tonrnasauswahl und -synthese kann die In-vitro-Spaltung auf die Auswahl für einzellige Mikroinjektionen getestet werden.Nach der PCR-Reinigung und dem Klonen wurden in diesem repräsentativen Experiment CRISPR-Cas9-induzierte Mutationen in einzelnen B.gauderio- und B.brachyistius-Klonen mit starker elektrischer Organentladungsamplitudenreduktion identifiziert, während nicht injizierte Kontrollen nur auf Genotypen referenzierten. Die Visualisierung der elektrischen Organentladungsamplitude zwischen bestätigten CRISPR-Mutationen und der nicht injizierten Steuerung abgestimmten Wirkstoffgröße zeigte, dass sowohl SCN-4 AA-Mutanten B.brachyistius als auch B.gauderio-Embryonen deutlich niedrigere elektrische Organentladungsamplituden als Kontrollen hatten. Bewegen Sie sich bei der Durchführung der Mikroinjektionen so schnell und bewusst wie möglich, um die Anzahl der einzellig injizierten Embryonen zu maximieren, die überleben.Verschwenden Sie keine Zeit mit schwierigen Eiern. Sobald erfolgreiche Mutanten identifiziert wurden, können traditionelle Züchtungsmethoden stabile mutierte Linien erzeugen, die CRSPR-assoziierte Mosaikismus-Bedenken beseitigen. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, vergleichende genomische Studien mit funktioneller Validierung in zwei konverediziert entwickelten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.

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