Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Die Autoren würdigen die heldenhaften Bemühungen von Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud und Hope Healey um Hilfe bei der Fischzucht, der Datensammlung und der frühen Protokollentwicklung. Wir möchten auch den drei Rezensenten für ihre Vorschläge zum Manuskript danken. Wir glauben, dass das Endprodukt von besserer Qualität ist, nachdem sie ihre Kommentare angesprochen haben. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der National Science Foundation #1644965 und #1455405 an JRG und die Stiftung Naturwissenschaften und Ingenieurforschung AN VLS finanziert.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt.
1. Auswahl von sgRNA-Zielen
HINWEIS: Für die manuelle Gestaltung von sgRNAs in Schritt 1.1 wird ein Protokoll bereitgestellt. Dies wurde für die scn4aa-Zielauswahl verwendet. Um diesen Prozess (Schritt 1.2) über das EFISHGENOMICS-Webportal zu erleichtern, wird ein zusätzliches Protokoll bereitgestellt. E...

Der phänoseische Reichtum schwach elektrischer Fische, zusammen mit einer kürzlichen Verbreitung von Genomressourcen, motiviert einen starken Bedarf an funktionellen Genomwerkzeugen im schwach elektrischen Fischmodell. Dieses System ist besonders attraktiv wegen der konvergenten Entwicklung zahlreicher phänotypischer Merkmale in parallelen Fischlinien, die leicht im Labor gehalten werden können.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-Technik in Linien schwach...

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Zwei Linien von Teleostfischen, Osteoglossiformen und Siluriformen, entwickelten parallel den Elektroempfang und fünf Linien von Teleosten (Gymnotiformes, Mormyriden und die Gattungen Astroscopus, Malapterurus und Synodontis) Elektrogenese parallel entwickelt. Es gibt einen auffälligen Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetischeArchitektur1,2,3.
Dies lässt sich vielleicht am besten an den zahlreichen konvergenten Merkmalen von Gymnotiformen und Mormyriden, zwei artenreichen Teleostkladen, am besten, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und als schwach elektrische Fische bezeichnet werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität verwenden, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren4, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklunggewonnen 1,5 ,6, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften7,8,9,10, Zellphysiologie11,12, Ökologie und Energetik13 ,14,15,16,17, Verhalten18,19und Makroevolution3,20,21 .
In jüngerer Zeit gab es eine Vermehrung von genomischen, transkriptomischen und proteomischen Ressourcen für elektrische Fische1,22,23,24,25,26, 27,28. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten1,2,3,28,29 ,30. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten von schwach elektrischen Fischen ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools31.
Ein solches Tool ist die kürzlich entwickelte Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats gepaart mit Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) Technik. CRISPR/Cas9 ist ein Genom-Editing-Tool, das sowohl in Modell32,33,34 als auch in Nicht-Modellorganismen35,36,37 gleichermaßen weit verbreitet ist. Die CRISPR/Cas9-Technologie hat sich so weit entwickelt, dass ein Labor, das in der Lage ist, grundlegende Molekularbiologie zu verwenden, problemlos genspezifische Sonden, sogenannte Kurzguide-RNAs (sgRNAs), zu niedrigen Kosten mit einer Nicht-Klonmethode38erzeugen kann. CRISPR hat Vorteile gegenüber anderen Knockout/Knockdown-Strategien, wie Morpholinos39,40, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleases (TALENs) und Zinkfingernukleasen (ZFNs), die teuer und zeitaufwändig für jedes Zielgen zu generieren.
Das CRISPR/Cas9-System funktioniert, um Genknockouts zu erzeugen, indem es auf eine bestimmte Region des Genoms abzielt, die durch die sgRNA-Sequenz gesteuert wird, und einen doppelsträngigen Bruch verursacht. Der doppelsträngige Bruch wird von der Zelle nachgewiesen und löst endogene DNA-Reparaturmechanismen vorzugsweise über den nicht-homologen Endjoining (NHEJ) aus. Dieser Weg ist sehr fehleranfällig: Während des Reparaturprozesses wird das DNA-Molekül oft Insertionen oder Deletionen (Indels) an der doppelsträngigen Bruchstelle enthalten. Diese Indels können zu einem Funktionsverlust führen, entweder durch (1) Verschiebungen im offenen Leserahmen, (2) das Einfügen eines vorzeitigen Stop-Codons oder (3) Verschiebungen in der kritischen Primärstruktur des Genprodukts. In diesem Protokoll verwenden wir CRISPR/Cas9-Bearbeitung, um Punktmutationen in Zielgenen mit dem NHEJ in schwach elektrischen Fischarten zu zielen. Obwohl einfacher und effizienter als andere Techniken, wird diese Methode der Mutagenese voraussichtlich zu einer Reihe von phänotypischen Schweregraden in F0führen, die dem genetischenMosaik41,42,43 zugeschrieben wird. 44.
Auswahl von Organismen Um zukünftige Studien zur vergleichenden Genomik schwach elektrischer Fische zu erleichtern, musste eine repräsentative Art für Gymnotiformen und Mormyriden für die Protokollentwicklung ausgewählt werden. Nach Diskussionen während des Electric Fish Meeting 2016 in Montevideo, Uruguay, gab es einen Konsens in der Gemeinschaft, Arten zu nutzen, die bereits im Labor gezüchtet werden konnten und über genomische Ressourcen verfügten. Die Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio und die mormyrid Brienomyrus brachyistius wurden als Arten ausgewählt, die diesen Kriterien entsprechen. Bei beiden Arten sind natürliche Hinweise zur Induzieren und Aufrechterhaltung der Brutbedingungen in Gefangenschaft leicht nachzuahmen. B. gauderio, eine Gymnotiforme-Art aus Südamerika, hat den Vorteil eines geringen Haltungsbedarfs: Fische können in relativ kleinen (4 L) Tanks mit relativ hoher Dichte gehalten werden. B. gauderio hat auch einen schnellen Generationenumsatz unter captiveBedingungen. Unter Laborbedingungen kann sich B. gauderio in ca. 4 Monaten vom Ei zum Erwachsenen entwickeln.
B. brachyistius, eine Art von mormyrid Fischen aus West-Zentralafrika, brütet leicht in Gefangenschaft. B. brachyistius ist leicht über den Aquarienhandel verfügbar, wurde in vielen Studien weit verbreitet und verfügt nun über eine Reihe von genomischen Ressourcen zur Verfügung. Ihr Lebenszyklus erstreckt sich je nach Laborbedingungen über 1 bis 3 Jahre. Die Anforderungen an die Haltung sind für diese Art etwas intensiver und erfordern aufgrund ihrer Aggression während der Zucht mäßig große Tanks (50-100 L).
Laboratorien, die andere Arten von elektroelektrischen Fischen untersuchen, sollten in der Lage sein, dieses Protokoll leicht anzupassen, solange die Art gezüchtet werden kann, und einzellige Embryonen können gesammelt und ins Erwachsenenalter gebracht werden. Die Wohnungs-, Larvenhaltungs- und In-vitro-Fertilisationsraten (IVF) werden sich wahrscheinlich mit anderen Arten ändern; Dieses Protokoll kann jedoch als Ausgangspunkt für Zuchtversuche in anderen schwach elektrischen Fischen verwendet werden.
Ein ideales Genziel für den Proof of Concept: scn4aa Schwach elektrische mormyrid und gymnotiform Fische erzeugen elektrische Felder (Elektrogenese) durch das Entladen eines spezialisierten Organs, genannt das elektrische Organ. Elektrische Organentladungen (EODs) ergeben sich aus der gleichzeitigen Produktion von Aktionspotentialen in den elektrischen Organzellen, den sogenannten Elektrozyten. EODs werden von einer Reihe von Elektrorezeptoren in der Haut detektiert, um hochauflösende elektrische Bilder der Umgebung des Fisches zu erstellen45. Schwach elektrische Fische sind auch in der Lage, Merkmale der EOD-Wellenformen18 ihrer konspezifischen EOD sowie deren Entladungsraten46zu erkennen, so dass EODs zusätzlich als soziales Kommunikationssignal analog zu Vogelgezwitscher oder Frosch fungieren können. Vokalisationen47.
Ein Hauptbestandteil der Wirkungspotentialerzeugung in den Elektrozyten von mormyrid und gymnotiform schwach elektrischen Fischen istder spannungsgebundene Natriumkanal NaV1.42 . Nicht-elektrische Teleosts exprimieren zwei paralogische Genkopien, Scn4aa und Scn4ab, die für den spannungsgebundenen Natriumkanal NaV1.430kodieren. In gymnotiform und mormyrid schwach elektrische Fischlinien, Scn4aa hat sich schnell entwickelt und untergezogen zahlreiche Aminosäuresubstitutionen, die seine kinetischen Eigenschaften beeinflussen48. Am wichtigsten ist, scn4aa hat sich in beiden Linien zum elektrischen Organ2,3. Die relativ eingeschränkte Expression von Scn4aa auf das elektrische Organ sowie seine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von EODs machen es zu einem idealen Ziel für CRISPR/Cas9-Knockout-Experimente, da es minimale schädliche pleiotrope Effekte hat. Da schwach elektrische Fische 6-8 Tage nach der Befruchtung (DPF) beginnen, ihre larvenelektrischen Organe zu entladen, eignet sich die Gezielte ungegheiten von Scn4aa ideal für die schnelle Phänotypisierung nach der Embryo-Mikroinjektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Es gibt einen bemerkenswerten Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetische Architektur teilen. Dies wird vielleicht am besten durch die zahlreichen konvergenten Merkmale von Gymnotiformen und Mormyriden veranschaulicht, zwei artenreichen Teleostklades, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und schwach elektrischer Fisch genannt werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität nutzen, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklung, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften gewonnen, Zellphysiologie, Ökologie, Evolutionsbiologie und Verhalten. In jüngerer Zeit hat es eine Vermehrung genomischer Ressourcen für elektrische Fische gegeben. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten ermöglicht. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten schwach elektrischer Fische ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Mutagenese, das endogene DNA-Reparaturmechanismen in schwach elektrischen Fischen nutzt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll sowohl bei der mormyriden Art Brienomyrus brachyistius als auch bei der Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio gleichermaßen wirksam ist, indem wir CRISPR/Cas9 verwenden, um Indels und Punktmutationen im ersten Exon des Natriumkanalgen scn4aa. Mit diesem Protokoll wurden Embryonen beider Arten gewonnen und genotypisiert, um zu bestätigen, dass die vorhergesagten Mutationen im ersten Exon des Natriumkanals Scn4aa vorhanden waren. Der Knock-out-Erfolg-Phänotyp wurde mit Aufnahmen bestätigt, die reduzierte elektrische Organentladungsamplituden im Vergleich zu nicht injizierten größenangepassten Kontrollen zeigten.

Die sgRNA-Zielstandorte wurden innerhalb von Exon 1 von Scn4aa sowohl in B. gauderio als auch in B. brachyistius identifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Die sgRNAs wurden wie in Abschnitt 2 beschrieben generiert. Nach erfolgreicher sgRNA-Auswahl und -Synthese (Abbildung 1) wurde die In-vitro-Spaltung getestet (Abbildung 2). Die sgRNAs, die In-vitro-Schneiden demonstrieren, wurden dann für einzellige Mikroinjektionen ausgewählt...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Die CRISPR/Cas9-Genbearbeitung bei schwach elektrischen Fischen, insbesondere in einem vergleichenden Kontext, wird es den Forschern ermöglichen, Hypothesen darüber zu testen, wie spezifische Gene und genetische Varianz zur phänotypischen Variation beitragen. CRISPR/Cas9 ist eine effiziente Methode zur Erzeugung mutierter F-Null-Embryonen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, CRISPR-Cas9-Manipulationen in zwei konveretierten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.Der Schlüssel zur Verwendung dieses Ansatzes mit einigen Modifikationen in anderen elektrischen Fischen oder anderen Fischarten ist die Verfügbarkeit von transkriptomischen oder genomischen Ressourcen, um sgRNAs herzustellen. Die Durchführung der Mikroinjektionen und die Visualisierung der Zellen an einer 3D-Position innerhalb einer 2D-Ebene kann schwierig sein. Erhalten Sie eine kleine Zebrafischkolonie für Eier, um allgemeine Mikroinjektionstechniken zu praktizieren.Das Verfahren mit Savvas Constantinou demonstriert Jared Thompson, ein Techniker aus meinem Labor. Nachdem Sie die von Interesse befindlichen Fischarten unter den entsprechenden Brutbedingungen untergebracht haben, identifizieren Sie weibliche Fische, die gravid erscheinen. In B.gauderio wird das Weibchen geschwollene Gonaden nur kaudal zum Schlot haben.In B.brachyistius werden Weibchen geschwollene Bäuche haben und tiefkörperlich erscheinen. Nach der Anästhesie-Verabreichung, fügen Sie Laichmittel auf das Vierfache des Volumens von DPBS in einem PCR-Rohr mit gründlicher Mischung. Die Lösung wird trüb.Verwenden Sie eine Pipette, um die berechnete Dosis zu messen und das verdünnte Mittel auf ein Stück Thermoplast zu verteilen, bevor Sie die Lösung in eine Präzisionsglasspritze mit einer abgeschrägten Nadel mit einer Länge von 28 bis 25 Millilitern ziehen. Injizieren Sie die Lösung in den dorsalen Rumpfmuskel mit einer glatten Rate und lassen Sie die Nadel für zwei bis vier Sekunden vor der Entfernung sitzen. Dann sofort Fisch in frisches Systemwasser zur Erholung geben.Für B.gauderio Spermien-Sammlung, nach 24 Stunden, wählen Sie einen großen männlichen Fisch und so schnell wie möglich nach der Sedierung, trocknen Sie den Fisch gründlich, vor allem um den Kopf und Vent. Legen Sie die getrocknete Fisch-Ventralseite nach oben, vordernach links in einem geeigneten Halter, bedeckt mit einem MS222 getränkten feuchten Papiertuch mit dem Kopf so parallel wie möglich zum Tisch. Sofort Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich sofort über die Gonaden in Richtung des Entlüftungsschachts quetscht und mit einem Mikropipetter mit einer Spitze vorsichtig das Sperma sammelt, da es vom Männchen in 50-Mikroliter-Schritten gepresst wird.Fügen Sie Aliquot von Spermien direkt auf 500-Mikroliter-Volumen von Spermien-Extender-Lösung auf Eis. Unmittelbar nach der Sammlung Fisch in Schleimmantelschutz produktbehandeltes Frischsystemwasser geben. Für die B.gauderio-Ei-Sammlung, nach dem Trocknen eines anästhesierten B.gauderio weiblichen Fisches, legen Sie den Fisch sofort auf seine Seite mit dem Kopf zur nicht dominanten Hand und üben Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich medial über die Gonaden in Richtung entlüftung drückt.Mit einem Polytetrafluorethylen-Werkzeug die Eier vorsichtig sammeln, wie sie aus der Kloake gepresst werden, und legen Sie die Eier schnell in eine kleine bedeckte Petrischale. Wenn Sie nach dem Quetschen allein arbeiten, berühren Sie die Eimasse an die Basis der kleinen Petrischale, während sie vom Weibchen vertrieben werden. Unmittelbar nach dem Sammeln der Eier, legen Sie die Fische in Schleim Mantel Schutz Produkt behandelt frischesystem Wasser.Für die B.gauderio In-vitro-Fertilisation 100 Mikroliter der gut gemischten Spermien-SES-Lösung direkt über die Eimasse geben, gefolgt von einem Milliliter frischer Systemwasser. Mischen Sie die Gametes Suspension gründlich für 30 bis 60 Sekunden, bevor Sie den Zellen ein bis zwei Milliliter 0,22-Mikrometer Porengefiltertes Systemwasser hinzufügen. Beschriften Sie die Schale mit der In-vitro-Fertilisationszeit und legen Sie das Gericht in einen 29-Grad-Grad-Celsius-Inkubator, indem Sie einen 50-Minuten-Timer einstellen, um den Fortschritt der Entwicklung zu überprüfen.Verwenden Sie während der Düngungszeit eine Mikrolader-Pipettenspitze, um zwei Mikroliter der von Interesse sindden Injektionslösung in eine Mikroinjektionsnadel zu laden und die Flüssigkeit so nah wie möglich an der Spitze zu vertreiben. Wenn sich eine einzelne Zelle am Tierpol von mindestens einer Zelle gebildet hat, übertragen Sie die Schale unter einem Sezierendes Mikroskop und verwenden Sie ein Paar feine Zangen, um die Nadelspitze in einem abgeschrägten Winkel zu brechen, wohin die Verjüngung der Nadel beginnt, Steifigkeit zu zeigen. Die Bohrung der Nadel sollte so klein wie möglich bleiben, während eine starre Verjüngung beibehalten wird.Identifizieren Sie die sich entwickelnden Zygoten unter dem Mikroskop und verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um 10 bis 20 Eier in so wenig Wasser wie möglich auf den Rand des Glasmikroskopschlittens zu legen, das in der umgekehrten Oberseite der Petrischale gesetzt ist. Drücken Sie mit einem empfindlichen Aufgabenwischen vorsichtig die Rutsche, um das überschüssige Wasser zu entfernen, damit die Eier fest am Rand der Rutsche haften können. Wasser wird unter der Rutsche böse sein und Eier gegen den Rand ziehen.Es sollte gerade genug Wasser vorhanden sein, um die Eier feucht zu halten und dabei wenig stehende Feuchtigkeit zu erhalten, um die Eibewegung während der Injektion zu vermeiden. Richten Sie die Eier vertikal, senkrecht zur nahenden Nadel, und positionieren Sie die Nadel mit einem Mikromanipulator gegen den Chorion. Dann, halten Sie die Nadel in einem etwa 45-Grad-Winkel, legen Sie die Spitze zuerst in die Chorion und dann, in die Einzelzelle, injektionen durch das Eigelb, wenn möglich.Entfernen Sie alle gebrochenen Eier während der Injektion mit feinen Zangen. Wenn alle Eier injiziert wurden, verwenden Sie eine Spritzflasche mit 0,22 Mikrometer Porengefiltertem Systemwasser, um die Eier vorsichtig von der Injektionsstufe in eine neue Petrischale mit 100 MillimeterDurchmesser zu spülen. Nach einer erfolgreichen kurzen Tonrnasauswahl und -synthese kann die In-vitro-Spaltung auf die Auswahl für einzellige Mikroinjektionen getestet werden.Nach der PCR-Reinigung und dem Klonen wurden in diesem repräsentativen Experiment CRISPR-Cas9-induzierte Mutationen in einzelnen B.gauderio- und B.brachyistius-Klonen mit starker elektrischer Organentladungsamplitudenreduktion identifiziert, während nicht injizierte Kontrollen nur auf Genotypen referenzierten. Die Visualisierung der elektrischen Organentladungsamplitude zwischen bestätigten CRISPR-Mutationen und der nicht injizierten Steuerung abgestimmten Wirkstoffgröße zeigte, dass sowohl SCN-4 AA-Mutanten B.brachyistius als auch B.gauderio-Embryonen deutlich niedrigere elektrische Organentladungsamplituden als Kontrollen hatten. Bewegen Sie sich bei der Durchführung der Mikroinjektionen so schnell und bewusst wie möglich, um die Anzahl der einzellig injizierten Embryonen zu maximieren, die überleben.Verschwenden Sie keine Zeit mit schwierigen Eiern. Sobald erfolgreiche Mutanten identifiziert wurden, können traditionelle Züchtungsmethoden stabile mutierte Linien erzeugen, die CRSPR-assoziierte Mosaikismus-Bedenken beseitigen. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, vergleichende genomische Studien mit funktioneller Validierung in zwei konverediziert entwickelten Arten von schwach elektrischen Fischen durchzuführen.

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Forschung

Biologie

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...