Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

המחברים מכירים את המאמצים ההרואיים של מוניקה לוקאס, קת'רין שאו, ריאן טיילור, ג'ארד תומפסון, ניקול רוביצ'ד, ותקווה הילי לעזרה עם גידול דגים, איסוף נתונים, ופיתוח פרוטוקולים מוקדם. כמו כן, אנו רוצים להודות לשלושת הבודקים על הצעותיהם לכתב היד. אנו מאמינים שהמוצר הסופי יהיה באיכות טובה יותר לאחר התייחסות לערותיהם. עבודה זו ממומנת על ידי תמיכה של הקרן הלאומית למדע #1644965 ו#1455405 ל-JRG, ואת מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה DG מעניקים VLS.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת מישיגן.
1. בחירת יעדי sgRNA
הערה: פרוטוקול מסופק לעיצוב ידני של sgRNAs בשלב 1.1. זה היה מנוצל לבחירת היעד scn4aa . פרוטוקול נוסף מסופק כדי להקל על תהליך זה (שלב 1.2) בא?...

העושר פנוטילי של דג חשמלי חלש, יחד עם התפשטות האחרונות של משאבי גנומיקה, מניע צורך חזק עבור כלים גנוטים פונקציונלי במודל של דגים חשמליים חלש. מערכת זו היא אטרקטיבית במיוחד בשל האבולוציה מתכנסת של תכונות פנויואיות רבות בתוך ליננים מקבילים של דגים, אשר נשמרים בקלות במעבדה.
הפ?...

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. שני מדורות של דגי teleost, אוסטוריאים וסילאואים, התפתחו התפשלות חשמלית במקביל, וחמש שנות שילוח (ממוראים, מוררידים, וכללי אסטרוסקופוס, מאלאפטראורוס וסינודונטיס) התפתחו אלקטרוגנזה במקביל. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת1,2,3.
זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של טפסי ממורשים ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades, אשר לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז גילוי כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר4, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות לתוך האבולוציה של פיתוח1,5 ,6, מערכות ומעגלים מדעי המוח7,8,9,10, פיזיולוגיה הסלולר11,12, אקולוגיה ו energetics13 ,14,15,16,17, התנהגות18,19, ומאקרואבולוציה3,20,21 .
לאחרונה, יש התפשטות של גנומית, טראנסקריפט, ו פרוטאומית משאבים עבור דגים חשמליים1,22,23,24,25,26, 27,28. השימוש במשאבים אלה כבר הפיק תובנות חשובות בנוגע לקשר בין גנוטיפ לפנוטיפ במינים אלה1,2,3,28,29 ,30. מכשול גדול כדי לשלב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטימית של דגים חשמליים חלש הוא חוסר הנוכחי של כלים גנומיקה תפקודית31.
אחד כלי כזה הוא שפותחה לאחרונה באשכולות באופן קבוע במרווחים של Palindromic קצר לזווג עם Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) טכניקה. Crispr/Cas9 הוא כלי עריכת הגנום כי נכנס לשימוש נרחב בשני דגם32,33,34 ו אורגניזמיםשאינם מודל 35,36, 37 כאחד . CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה מעבדה המסוגלת ביולוגיה מולקולרית בסיסי יכול בקלות ליצור גנים ספציפיים המכונה RNAs מדריך קצר (sgRNAs), בעלות נמוכה באמצעות שיטה שאינה שיבוט38. Crispr יש יתרונות על אחרים הסתרה/מיקוד אסטרטגיות, כגון activator olinos39,40, תמלול שעתוק כמו הנוקלאוסים (talens), ו אבץ האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), אשר יקרים ו זמן רב להפיק. עבור כל גן מטרה
מערכת CRISPR/Cas9 פונקציות כדי ליצור הסתרה גנים על ידי התמקדות באזור ספציפי של הגנום, בבימויו של רצף sgRNA, וגרימת הפסקה כפולה תקוע. הפסקה כפולה נתקע מזוהה על ידי התא ומפעילה מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים המועדפת באמצעות הסוף הלא הומוולוגי להצטרף (NHEJ) המסלול. מסלול זה הוא מאוד מועדת לטעויות: במהלך תהליך התיקון, מולקולת ה-DNA כוללים לעתים קרובות הוספות או מחיקות (indels) באתר הפריצה כפול תקוע. Indels אלה יכולים לגרום לאובדן של הפונקציה בשל אחד (1) משמרות במסגרת הקריאה הפתוחה, (2) החדרת codon עצירה מוקדמת, או (3) משמרות במבנה העיקרי הקריטי של המוצר הגן. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים CRISPR/Cas9 עריכה כדי מוטציות נקודת היעד בגנים היעד באמצעות NHEJ ב מינים של דגים חשמליים חלש. בעוד ששיטה זו פשוטה ויעילה יותר מטכניקות אחרות, צפויה שיטה זו של מוטגנזה לגרום למגוון של התסופנותולים ב-F0, המיוחס לפסיפס גנטי41,42,43 ,44
מבחר של אורגניזמים לצורך הקלה על מחקרים עתידיים על הגנומיקה השוואתית של דג חשמלי חלש, מינים מייצגים עבור הטפסים ומורמירידים לפיתוח פרוטוקולים הדרושים כדי להיבחר. בעקבות דיונים במהלך הפגישה 2016 דג חשמלי במונטווידאו, אורוגוואי, היה קונצנזוס הקהילה לנצל מינים שכבר יכול להיות מתרבה במעבדה, כי היו משאבים גנומית זמין. והמורמיטיוס של ברימאסיוס . נבחרו כמינים המתאימים לקריטריונים הללו... בשני המינים, רמזים טבעיים כדי לגרום ולשמור על תנאי הרבייה קל לחקות בשבי. ב. gauderio, מינים בצורת מיני מדרום אמריקה, יש את היתרון של דרישות גידול נמוכות: ניתן לשמור על הדגים בצפיפות גבוהה יחסית בטנקים קטנים יחסית (4 ל). ב. gauderio גם יש מחזור דורי מהיר בתנאים שבויים. בתנאי מעבדה, B. gauderio יכול להתפתח ביצה למבוגר בתוך כ 4 חודשים.
ב. ברכסיטיוס, זן של דג מורמי ממערב אפריקה, מוליד בקלות בשבי. ב. ברכסיטיוס הוא זמין באמצעות הסחר באקווריום, נעשה שימוש נרחב במחקרים רבים, וכעת יש מספר משאבים גנומית זמין. מחזור חייהם משתרע על פני 1-3 שנים, תלוי בתנאי מעבדה. דרישות הגידול מאינטנסיביות מעט יותר עבור מין זה, הדורשות מיכלים בגודל בינוני (50 ל-100 ליטר) בשל התוקפנות שלהם במהלך הרבייה.
מעבדות לימוד מינים אחרים של דגים חשמליים צריך להיות מסוגל להתאים בקלות את הפרוטוקול הזה כל עוד המינים יכולים להיות מתרבה, ועוברי תא בודד ניתן לאסוף והתרומם לתוך בבגרות. הדיור, גידול הזחל, ו הפריה חוץ גופית (IVF) התעריפים עשויים להשתנות עם מינים אחרים; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה עבור ניסיונות רבייה של דגים חשמליים חלש אחרים.
יעד הגן האידיאלי עבור הוכחת המושג: scn4aa מורגמיל חשמלי חלש ודגים מיוחדים יוצרים שדות חשמליים (אלקטרוגנזה) על ידי הפעלת איבר מיוחד, שנקרא עוגב חשמלי. מקלעת לאיברים חשמליים (EODs) נובעת מייצור סימולטני של פוטנציאל פעולה בתאי איבר חשמלי הנקרא אלקטרוציטים. EODs מזוהים על ידי מערך של אלקטורים חשמליים בעור כדי ליצור תמונות חשמל ברזולוציה גבוהה של הסביבה של הדג45. דגים חשמליים חלש הם גם מסוגלים לזהות תכונות של הפרטים שלהם ' EOD גל טפסים18 , כמו גם את שיעורי השחרור שלהם46, המאפשר eod לתפקד בנוסף כאות תקשורת חברתית האנלוגית לשיר ציפורים או צפרדע ברירתמ47.
המרכיב העיקרי של הדור הפוטנציאלי לפעולה באלקטרוציטים של מורגמיל הן והוא בצורה מאוד לא ברור דגים חשמליים חלש הוא ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.42. טלאוסטים שאינם חשמליים מבטאים שני עותקי גנים paralogous, scn4aa ו scn4ab, קידוד עבור ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.430. בשני הצדדים האלה ומורייפטור מפני הscn4aa דגים חשמליים חלש, התפתחו במהירות ועברו החלפות חומצות אמינו רבות המשפיעות על המאפיינים הקינטית שלה48. והכי חשוב, scn4aa הפכה להיות ממדר בשני הצדדים לעוגב חשמלי2,3. הביטוי המוגבל יחסית של scn4aa לאיבר החשמלי, כמו גם התפקיד העיקרי שלה בדור של eods, הופך אותו יעד אידיאלי עבור הניסויים CRISPR/Cas9, כפי שיש לו אפקטים מינימליים מינימלית pleiotropic. בגלל הדגים החשמליים חלש להתחיל לפתוח את הזחל שלהם האיברים החשמליים 6-8 ימים הפריה פוסט (DPF), פילוח של scn4aa הוא אידיאלי מתאים לפנוטיפים מהירים לאחר העובר מיקרוהזרקה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת. זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של צורות הג ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades כי לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז התגלית כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות להתפתחות של פיתוח, מערכות ומעגלים מדעי המוח, פיזיולוגיה של הסלולר, אקולוגיה, ביולוגיה אבולוציונית והתנהגות. לאחרונה, יש התפשטות של משאבים גנומית עבור דגים חשמליים. השימוש במשאבים אלה כבר הנחה תובנות חשובות לגבי הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפים במינים אלה. מכשול גדול לשילוב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטים של דגים חשמליים חלש הוא העדר הנוכחי של כלי גנומיקה תפקודית. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מלא לביצוע CRISPR/Cas9 מוטגנזה אשר מנצל מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים בדגים חשמליים חלש. אנו מדגימים כי פרוטוקול זה הוא יעיל באותה מידה הן מיני מורגמיל ברינורוס ברכימיטיוס ואת הטופס המסוןברכימוטציות gauderio באמצעות Crispr/Cas9 כדי למקד את indels ואת הנקודה המוטציות באקסון הראשון של ערוץ הנתרן גן scn4aa. באמצעות פרוטוקול זה, עוברים משני המינים הושגו והוקלדה על מנת לאשר כי המוטציות החזוי ב הראשון של ערוץ הנתרן scn4aa היו נוכחים. הצלחת להוריד את ההצלחה פנוטיפ היה אישר עם הקלטות מראה מופחת החוצה איבר חשמלי הפחתת המוני כאשר לעומת שולטת בגודל לא מוזרק התאמה.

אתרי היעד sgrna זוהו בתוך אקסון 1 של scn4aa בשני ב. gauderio ו -b. ברכסינטיוס כפי שמתואר בסעיף 1. SgRNAs נוצרו כמתואר בסעיף 2. בעקבות בחירה מוצלחת sgRNA וסינתזה (איור 1), במחשוף מבחנה נבדק (איור 2). SgRNAs הפגינו חיתוך מחוץ לכאן נבחרו לאחר מכן עבור מיקרוזריקות תא בודד.</...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

עריכת גנים CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים, במיוחד בהקשר השוואתי, תאפשר לחוקרים לבדוק השערות לגבי האופן שבו גנים ספציפיים ושונות גנטית תורמים לשינויים פנוטיפיים. CRISPR/Cas9 היא שיטה יעילה ליצירת עוברי F-Zero מוטנטים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות CRISPR-Cas9 בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.המפתח לשימוש בגישה זו עם כמה שינויים בדגים חשמליים אחרים או מיני דגים אחרים הוא הזמינות של משאבים תעתיקים או גנומיים כדי להפוך sgRNAs. ביצוע microinjections ו לדמיין את התאים במיקום 3D בתוך מישור 2D יכול להיות קשה. השג מושבת זברה קטנה לביצים כדי לתרגל טכניקות מיקרו-ג'ינג'יות כלליות.מדגים את ההליך עם Savvas קונסטנטינו יהיה ג'ארד תומפסון, טכנאי מהמעבדה שלי. לאחר דיור מיני הדגים של עניין בתנאי הרבייה המתאימים, לזהות דגים נקבה המופיעים gravid. בB.gauderio, הנקבה תהיה גונדות נפוחות רק caudal לאוורור.ב B.brachyistius נקבות יהיו בטן נפוחה ולהופיע עמוק גוף. לאחר ניהול הרדמה, להוסיף סוכן להשריץ ארבע פעמים את נפח DPBS בצינור PCR עם ערבוב יסודי. הפתרון יהיה מעונן.השתמש פיפטה כדי למדוד את המינון המחושב ולחלק את הסוכן מדולל אל חתיכת תרמופלסטי לפני ציור הפתרון לתוך מזרק זכוכית מדויק מצויד 28-מד 19 כדי 25 מיליליטר אורך משופע מחט. להזריק את הפתרון לתוך שריר תא המטען הגבי בקצב חלק ולתת את המחט לשבת במשך שתיים עד ארבע שניות לפני ההסרה. לאחר מכן, מיד למקם דגים לתוך מים מערכת טריים להתאוששות.עבור B.gauderio אוסף זרע, לאחר 24 שעות, לבחור דג זכר גדול מהר ככל האפשר לאחר סם, לייבש את הדגים ביסודיות, במיוחד סביב הראש ומאוורר. מניחים את הצד הגחוני של הדגים המיובשים למעלה, לפנים שמאלה במחזיק המתאים, מכוסים במגבת נייר לחה MS222 ספוגה עם הראש במקביל לשולחן ככל האפשר. מיד להפעיל לחץ caudal לכיוון rostral עם אור לסחוט מיד מעל הישנים לכיוון האוורור באמצעות micropipetter עם קצה, בזהירות לאסוף את הזרע כפי שהוא סחוט מן הזכר במרווחים 50 מיקרוליטר.הוסף aliquot של זרע ישירות על 500 מיקרוליטר כרכים של פתרון מאריך זרע על קרח. מיד לאחר האיסוף, מניחים דגים במים מתוקים המטופלים על ידי מעיל רפש. עבור B.gauderio ביצה איסוף, לאחר ייבוש דג נקבה B.gauderio הרדמה, מיד מניחים את הדג על צידו עם הראש מול היד הלא דומיננטית ולהחיל לחץ caudal כדי rostral כיוון עם אור לסחוט בינוני על הישנים לכיוון האוורור.באמצעות כלי polytetrafluoroethylene, בזהירות לאסוף את הביצים כפי שהם נסחטים מן cloaca במהירות למקם את הביצים בצלחת פטרי מכוסה קטן. אם עובדים לבד לאחר סחיטה, לגעת במסת הביצה לבסיס של צלחת פטרי קטנה כפי שהם גורשו מן הנקבה. מיד לאחר איסוף הביצים, מניחים את הדגים במים מתוקים שטופלו במעיל רפש.עבור B.gauderio הפריה חוץ גופית, להוסיף 100 microliters של פתרון SES זרע מעורב היטב ישירות מעל מסת הביצית, ואחריו מיליליטר אחד של מים במערכת טרייה. מערבבים את ההשעיה gametes ביסודיות במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת אחד עד שני מיליליטר נוספים של 0.22 מיקרומטר נקבובית מים מסוננים מערכת לתאים. תייגו את המנה עם זמן ההפריה החוץ גופית והכנסו את המנה לאנקובטור של 29 מעלות צלזיוס, והגדרת טיימר של 50 דקות כדי לבדוק את התקדמות הפיתוח.במהלך תקופת ההפריה, השתמש טיפ פיפית microloader כדי לטעון בחזרה שני microliters של פתרון ההזרקה של עניין לתוך מחט microinjection ולגרש את הנוזל קרוב לקצה ככל האפשר. כאשר תא בודד נוצר בקוטב החייתי של תא אחד לפחות, להעביר את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש בזוג מטלפים עדין לשבור את קצה המחט בזווית משופעת לכיוון שבו המתחדד של המחט מתחיל להפגין קשיחות. נשא המחט צריך להישאר קטן ככל האפשר תוך שמירה על התחדדות נוקשה.זהה את הזיגוטים המתפתחים מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך למקם 10 עד 20 ביצים במים מעט ככל האפשר על קצה מגלשת מיקרוסקופ זכוכית להגדיר בחלק העליון ההפוך של צלחת פטרי. באמצעות מחיקת משימה עדינה, לחץ בעדינות על השקופית כדי להסיר את המים העודפים כדי לאפשר לביצים לדבוק בחוזקה בקצה השקופית. מים יהיו מרושעים מתחת למגלשה ולמשוך ביצים על הקצה.צריך להיות רק מספיק מים כדי לשמור על הביצים לחות תוך שמירה על לחות עומדת קטנה, כדי למנוע תנועת ביצה במהלך ההזרקה. ליישר את הביצים נגד המחוון אנכית, בניצב למחט המתקרבת, ולהשתמש micromanipulator למקם את המחט נגד chorion. לאחר מכן, מחזיק את המחט בזווית של כ 45 מעלות, להכניס את הקצה הראשון לתוך chorion ולאחר מכן, לתוך התא היחיד, הזרקת דרך החלמון אם אפשר.הסר ביצים שבורות במהלך ההזרקה עם מדפים עדין. כאשר כל הביצים הוזרקו, השתמש בבקבוק להשפריץ של 0.22 מיקרומטר נקבוביות מים מערכת מסוננים כדי לשטוף בעדינות את הביצים בשלב ההזרקה לתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ. לאחר בחירת RNAs קצרה מוצלחת וסינתזה, ניתן לבדוק את המחשוף במבחנה לבחירה עבור microinjections תא יחיד.לאחר ניקוי ושכפול PCR, בניסוי מייצג זה, מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR-Cas9 זוהו בשיבוטים בודדים של B.gauderio ו- B.brachyistius עם הפחתת משרעת חזקה של פריקת איברים חשמליים, ואילו פקדים לא מזוהים הציגו רק גנוטיפים המוזכרים. הדמיה של משרעת פריקת איברים חשמליים בין מוטציות CRISPR מאושרות לגודל הסוכן תאמה פקדים לא מושתקים הראו כי הן מוטציית SCN-4 AA B.brachyistius והן עוברי B.gauderio היו משרעת פריקת איברים חשמליים נמוכה משמעותית מאשר פקדים. בעת ביצוע זריקות מיקרו, לנוע מהר ובכוונה ככל האפשר כדי למקסם את מספר עוברים חד-תאיים מוזרקים ששורדים.אין לבזבז זמן עם ביצים קשות. לאחר שזוהו מוטנטים מוצלחים, שיטות רבייה מסורתיות יכולות ליצור קווי מוטנטים יציבים, אשר מבטלים את חששות הפסיפסים הקשורים ל- CRSPR. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לערוך מחקרים גנומיים השוואתיים עם אימות תפקודי בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...