Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

המחברים מכירים את המאמצים ההרואיים של מוניקה לוקאס, קת'רין שאו, ריאן טיילור, ג'ארד תומפסון, ניקול רוביצ'ד, ותקווה הילי לעזרה עם גידול דגים, איסוף נתונים, ופיתוח פרוטוקולים מוקדם. כמו כן, אנו רוצים להודות לשלושת הבודקים על הצעותיהם לכתב היד. אנו מאמינים שהמוצר הסופי יהיה באיכות טובה יותר לאחר התייחסות לערותיהם. עבודה זו ממומנת על ידי תמיכה של הקרן הלאומית למדע #1644965 ו#1455405 ל-JRG, ואת מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה DG מעניקים VLS.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת מישיגן.
1. בחירת יעדי sgRNA
הערה: פרוטוקול מסופק לעיצוב ידני של sgRNAs בשלב 1.1. זה היה מנוצל לבחירת היעד scn4aa . פרוטוקול נוסף מסופק כדי להקל על תהליך זה (שלב 1.2) בא?...

העושר פנוטילי של דג חשמלי חלש, יחד עם התפשטות האחרונות של משאבי גנומיקה, מניע צורך חזק עבור כלים גנוטים פונקציונלי במודל של דגים חשמליים חלש. מערכת זו היא אטרקטיבית במיוחד בשל האבולוציה מתכנסת של תכונות פנויואיות רבות בתוך ליננים מקבילים של דגים, אשר נשמרים בקלות במעבדה.
הפ?...

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. שני מדורות של דגי teleost, אוסטוריאים וסילאואים, התפתחו התפשלות חשמלית במקביל, וחמש שנות שילוח (ממוראים, מוררידים, וכללי אסטרוסקופוס, מאלאפטראורוס וסינודונטיס) התפתחו אלקטרוגנזה במקביל. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת1,2,3.
זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של טפסי ממורשים ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades, אשר לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז גילוי כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר4, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות לתוך האבולוציה של פיתוח1,5 ,6, מערכות ומעגלים מדעי המוח7,8,9,10, פיזיולוגיה הסלולר11,12, אקולוגיה ו energetics13 ,14,15,16,17, התנהגות18,19, ומאקרואבולוציה3,20,21 .
לאחרונה, יש התפשטות של גנומית, טראנסקריפט, ו פרוטאומית משאבים עבור דגים חשמליים1,22,23,24,25,26, 27,28. השימוש במשאבים אלה כבר הפיק תובנות חשובות בנוגע לקשר בין גנוטיפ לפנוטיפ במינים אלה1,2,3,28,29 ,30. מכשול גדול כדי לשלב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטימית של דגים חשמליים חלש הוא חוסר הנוכחי של כלים גנומיקה תפקודית31.
אחד כלי כזה הוא שפותחה לאחרונה באשכולות באופן קבוע במרווחים של Palindromic קצר לזווג עם Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) טכניקה. Crispr/Cas9 הוא כלי עריכת הגנום כי נכנס לשימוש נרחב בשני דגם32,33,34 ו אורגניזמיםשאינם מודל 35,36, 37 כאחד . CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה מעבדה המסוגלת ביולוגיה מולקולרית בסיסי יכול בקלות ליצור גנים ספציפיים המכונה RNAs מדריך קצר (sgRNAs), בעלות נמוכה באמצעות שיטה שאינה שיבוט38. Crispr יש יתרונות על אחרים הסתרה/מיקוד אסטרטגיות, כגון activator olinos39,40, תמלול שעתוק כמו הנוקלאוסים (talens), ו אבץ האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), אשר יקרים ו זמן רב להפיק. עבור כל גן מטרה
מערכת CRISPR/Cas9 פונקציות כדי ליצור הסתרה גנים על ידי התמקדות באזור ספציפי של הגנום, בבימויו של רצף sgRNA, וגרימת הפסקה כפולה תקוע. הפסקה כפולה נתקע מזוהה על ידי התא ומפעילה מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים המועדפת באמצעות הסוף הלא הומוולוגי להצטרף (NHEJ) המסלול. מסלול זה הוא מאוד מועדת לטעויות: במהלך תהליך התיקון, מולקולת ה-DNA כוללים לעתים קרובות הוספות או מחיקות (indels) באתר הפריצה כפול תקוע. Indels אלה יכולים לגרום לאובדן של הפונקציה בשל אחד (1) משמרות במסגרת הקריאה הפתוחה, (2) החדרת codon עצירה מוקדמת, או (3) משמרות במבנה העיקרי הקריטי של המוצר הגן. בפרוטוקול זה, אנו מנצלים CRISPR/Cas9 עריכה כדי מוטציות נקודת היעד בגנים היעד באמצעות NHEJ ב מינים של דגים חשמליים חלש. בעוד ששיטה זו פשוטה ויעילה יותר מטכניקות אחרות, צפויה שיטה זו של מוטגנזה לגרום למגוון של התסופנותולים ב-F0, המיוחס לפסיפס גנטי41,42,43 ,44
מבחר של אורגניזמים לצורך הקלה על מחקרים עתידיים על הגנומיקה השוואתית של דג חשמלי חלש, מינים מייצגים עבור הטפסים ומורמירידים לפיתוח פרוטוקולים הדרושים כדי להיבחר. בעקבות דיונים במהלך הפגישה 2016 דג חשמלי במונטווידאו, אורוגוואי, היה קונצנזוס הקהילה לנצל מינים שכבר יכול להיות מתרבה במעבדה, כי היו משאבים גנומית זמין. והמורמיטיוס של ברימאסיוס . נבחרו כמינים המתאימים לקריטריונים הללו... בשני המינים, רמזים טבעיים כדי לגרום ולשמור על תנאי הרבייה קל לחקות בשבי. ב. gauderio, מינים בצורת מיני מדרום אמריקה, יש את היתרון של דרישות גידול נמוכות: ניתן לשמור על הדגים בצפיפות גבוהה יחסית בטנקים קטנים יחסית (4 ל). ב. gauderio גם יש מחזור דורי מהיר בתנאים שבויים. בתנאי מעבדה, B. gauderio יכול להתפתח ביצה למבוגר בתוך כ 4 חודשים.
ב. ברכסיטיוס, זן של דג מורמי ממערב אפריקה, מוליד בקלות בשבי. ב. ברכסיטיוס הוא זמין באמצעות הסחר באקווריום, נעשה שימוש נרחב במחקרים רבים, וכעת יש מספר משאבים גנומית זמין. מחזור חייהם משתרע על פני 1-3 שנים, תלוי בתנאי מעבדה. דרישות הגידול מאינטנסיביות מעט יותר עבור מין זה, הדורשות מיכלים בגודל בינוני (50 ל-100 ליטר) בשל התוקפנות שלהם במהלך הרבייה.
מעבדות לימוד מינים אחרים של דגים חשמליים צריך להיות מסוגל להתאים בקלות את הפרוטוקול הזה כל עוד המינים יכולים להיות מתרבה, ועוברי תא בודד ניתן לאסוף והתרומם לתוך בבגרות. הדיור, גידול הזחל, ו הפריה חוץ גופית (IVF) התעריפים עשויים להשתנות עם מינים אחרים; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה עבור ניסיונות רבייה של דגים חשמליים חלש אחרים.
יעד הגן האידיאלי עבור הוכחת המושג: scn4aa מורגמיל חשמלי חלש ודגים מיוחדים יוצרים שדות חשמליים (אלקטרוגנזה) על ידי הפעלת איבר מיוחד, שנקרא עוגב חשמלי. מקלעת לאיברים חשמליים (EODs) נובעת מייצור סימולטני של פוטנציאל פעולה בתאי איבר חשמלי הנקרא אלקטרוציטים. EODs מזוהים על ידי מערך של אלקטורים חשמליים בעור כדי ליצור תמונות חשמל ברזולוציה גבוהה של הסביבה של הדג45. דגים חשמליים חלש הם גם מסוגלים לזהות תכונות של הפרטים שלהם ' EOD גל טפסים18 , כמו גם את שיעורי השחרור שלהם46, המאפשר eod לתפקד בנוסף כאות תקשורת חברתית האנלוגית לשיר ציפורים או צפרדע ברירתמ47.
המרכיב העיקרי של הדור הפוטנציאלי לפעולה באלקטרוציטים של מורגמיל הן והוא בצורה מאוד לא ברור דגים חשמליים חלש הוא ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.42. טלאוסטים שאינם חשמליים מבטאים שני עותקי גנים paralogous, scn4aa ו scn4ab, קידוד עבור ערוץ הנתרן מגודרת מתח 1.430. בשני הצדדים האלה ומורייפטור מפני הscn4aa דגים חשמליים חלש, התפתחו במהירות ועברו החלפות חומצות אמינו רבות המשפיעות על המאפיינים הקינטית שלה48. והכי חשוב, scn4aa הפכה להיות ממדר בשני הצדדים לעוגב חשמלי2,3. הביטוי המוגבל יחסית של scn4aa לאיבר החשמלי, כמו גם התפקיד העיקרי שלה בדור של eods, הופך אותו יעד אידיאלי עבור הניסויים CRISPR/Cas9, כפי שיש לו אפקטים מינימליים מינימלית pleiotropic. בגלל הדגים החשמליים חלש להתחיל לפתוח את הזחל שלהם האיברים החשמליים 6-8 ימים הפריה פוסט (DPF), פילוח של scn4aa הוא אידיאלי מתאים לפנוטיפים מהירים לאחר העובר מיקרוהזרקה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת. זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של צורות הג ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades כי לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז התגלית כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות להתפתחות של פיתוח, מערכות ומעגלים מדעי המוח, פיזיולוגיה של הסלולר, אקולוגיה, ביולוגיה אבולוציונית והתנהגות. לאחרונה, יש התפשטות של משאבים גנומית עבור דגים חשמליים. השימוש במשאבים אלה כבר הנחה תובנות חשובות לגבי הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפים במינים אלה. מכשול גדול לשילוב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטים של דגים חשמליים חלש הוא העדר הנוכחי של כלי גנומיקה תפקודית. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מלא לביצוע CRISPR/Cas9 מוטגנזה אשר מנצל מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים בדגים חשמליים חלש. אנו מדגימים כי פרוטוקול זה הוא יעיל באותה מידה הן מיני מורגמיל ברינורוס ברכימיטיוס ואת הטופס המסוןברכימוטציות gauderio באמצעות Crispr/Cas9 כדי למקד את indels ואת הנקודה המוטציות באקסון הראשון של ערוץ הנתרן גן scn4aa. באמצעות פרוטוקול זה, עוברים משני המינים הושגו והוקלדה על מנת לאשר כי המוטציות החזוי ב הראשון של ערוץ הנתרן scn4aa היו נוכחים. הצלחת להוריד את ההצלחה פנוטיפ היה אישר עם הקלטות מראה מופחת החוצה איבר חשמלי הפחתת המוני כאשר לעומת שולטת בגודל לא מוזרק התאמה.

אתרי היעד sgrna זוהו בתוך אקסון 1 של scn4aa בשני ב. gauderio ו -b. ברכסינטיוס כפי שמתואר בסעיף 1. SgRNAs נוצרו כמתואר בסעיף 2. בעקבות בחירה מוצלחת sgRNA וסינתזה (איור 1), במחשוף מבחנה נבדק (איור 2). SgRNAs הפגינו חיתוך מחוץ לכאן נבחרו לאחר מכן עבור מיקרוזריקות תא בודד.</...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

עריכת גנים CRISPR/Cas9 בדגים חשמליים חלשים, במיוחד בהקשר השוואתי, תאפשר לחוקרים לבדוק השערות לגבי האופן שבו גנים ספציפיים ושונות גנטית תורמים לשינויים פנוטיפיים. CRISPR/Cas9 היא שיטה יעילה ליצירת עוברי F-Zero מוטנטים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבצע מניפולציות CRISPR-Cas9 בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.המפתח לשימוש בגישה זו עם כמה שינויים בדגים חשמליים אחרים או מיני דגים אחרים הוא הזמינות של משאבים תעתיקים או גנומיים כדי להפוך sgRNAs. ביצוע microinjections ו לדמיין את התאים במיקום 3D בתוך מישור 2D יכול להיות קשה. השג מושבת זברה קטנה לביצים כדי לתרגל טכניקות מיקרו-ג'ינג'יות כלליות.מדגים את ההליך עם Savvas קונסטנטינו יהיה ג'ארד תומפסון, טכנאי מהמעבדה שלי. לאחר דיור מיני הדגים של עניין בתנאי הרבייה המתאימים, לזהות דגים נקבה המופיעים gravid. בB.gauderio, הנקבה תהיה גונדות נפוחות רק caudal לאוורור.ב B.brachyistius נקבות יהיו בטן נפוחה ולהופיע עמוק גוף. לאחר ניהול הרדמה, להוסיף סוכן להשריץ ארבע פעמים את נפח DPBS בצינור PCR עם ערבוב יסודי. הפתרון יהיה מעונן.השתמש פיפטה כדי למדוד את המינון המחושב ולחלק את הסוכן מדולל אל חתיכת תרמופלסטי לפני ציור הפתרון לתוך מזרק זכוכית מדויק מצויד 28-מד 19 כדי 25 מיליליטר אורך משופע מחט. להזריק את הפתרון לתוך שריר תא המטען הגבי בקצב חלק ולתת את המחט לשבת במשך שתיים עד ארבע שניות לפני ההסרה. לאחר מכן, מיד למקם דגים לתוך מים מערכת טריים להתאוששות.עבור B.gauderio אוסף זרע, לאחר 24 שעות, לבחור דג זכר גדול מהר ככל האפשר לאחר סם, לייבש את הדגים ביסודיות, במיוחד סביב הראש ומאוורר. מניחים את הצד הגחוני של הדגים המיובשים למעלה, לפנים שמאלה במחזיק המתאים, מכוסים במגבת נייר לחה MS222 ספוגה עם הראש במקביל לשולחן ככל האפשר. מיד להפעיל לחץ caudal לכיוון rostral עם אור לסחוט מיד מעל הישנים לכיוון האוורור באמצעות micropipetter עם קצה, בזהירות לאסוף את הזרע כפי שהוא סחוט מן הזכר במרווחים 50 מיקרוליטר.הוסף aliquot של זרע ישירות על 500 מיקרוליטר כרכים של פתרון מאריך זרע על קרח. מיד לאחר האיסוף, מניחים דגים במים מתוקים המטופלים על ידי מעיל רפש. עבור B.gauderio ביצה איסוף, לאחר ייבוש דג נקבה B.gauderio הרדמה, מיד מניחים את הדג על צידו עם הראש מול היד הלא דומיננטית ולהחיל לחץ caudal כדי rostral כיוון עם אור לסחוט בינוני על הישנים לכיוון האוורור.באמצעות כלי polytetrafluoroethylene, בזהירות לאסוף את הביצים כפי שהם נסחטים מן cloaca במהירות למקם את הביצים בצלחת פטרי מכוסה קטן. אם עובדים לבד לאחר סחיטה, לגעת במסת הביצה לבסיס של צלחת פטרי קטנה כפי שהם גורשו מן הנקבה. מיד לאחר איסוף הביצים, מניחים את הדגים במים מתוקים שטופלו במעיל רפש.עבור B.gauderio הפריה חוץ גופית, להוסיף 100 microliters של פתרון SES זרע מעורב היטב ישירות מעל מסת הביצית, ואחריו מיליליטר אחד של מים במערכת טרייה. מערבבים את ההשעיה gametes ביסודיות במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת אחד עד שני מיליליטר נוספים של 0.22 מיקרומטר נקבובית מים מסוננים מערכת לתאים. תייגו את המנה עם זמן ההפריה החוץ גופית והכנסו את המנה לאנקובטור של 29 מעלות צלזיוס, והגדרת טיימר של 50 דקות כדי לבדוק את התקדמות הפיתוח.במהלך תקופת ההפריה, השתמש טיפ פיפית microloader כדי לטעון בחזרה שני microliters של פתרון ההזרקה של עניין לתוך מחט microinjection ולגרש את הנוזל קרוב לקצה ככל האפשר. כאשר תא בודד נוצר בקוטב החייתי של תא אחד לפחות, להעביר את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש בזוג מטלפים עדין לשבור את קצה המחט בזווית משופעת לכיוון שבו המתחדד של המחט מתחיל להפגין קשיחות. נשא המחט צריך להישאר קטן ככל האפשר תוך שמירה על התחדדות נוקשה.זהה את הזיגוטים המתפתחים מתחת למיקרוסקופ ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך למקם 10 עד 20 ביצים במים מעט ככל האפשר על קצה מגלשת מיקרוסקופ זכוכית להגדיר בחלק העליון ההפוך של צלחת פטרי. באמצעות מחיקת משימה עדינה, לחץ בעדינות על השקופית כדי להסיר את המים העודפים כדי לאפשר לביצים לדבוק בחוזקה בקצה השקופית. מים יהיו מרושעים מתחת למגלשה ולמשוך ביצים על הקצה.צריך להיות רק מספיק מים כדי לשמור על הביצים לחות תוך שמירה על לחות עומדת קטנה, כדי למנוע תנועת ביצה במהלך ההזרקה. ליישר את הביצים נגד המחוון אנכית, בניצב למחט המתקרבת, ולהשתמש micromanipulator למקם את המחט נגד chorion. לאחר מכן, מחזיק את המחט בזווית של כ 45 מעלות, להכניס את הקצה הראשון לתוך chorion ולאחר מכן, לתוך התא היחיד, הזרקת דרך החלמון אם אפשר.הסר ביצים שבורות במהלך ההזרקה עם מדפים עדין. כאשר כל הביצים הוזרקו, השתמש בבקבוק להשפריץ של 0.22 מיקרומטר נקבוביות מים מערכת מסוננים כדי לשטוף בעדינות את הביצים בשלב ההזרקה לתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ. לאחר בחירת RNAs קצרה מוצלחת וסינתזה, ניתן לבדוק את המחשוף במבחנה לבחירה עבור microinjections תא יחיד.לאחר ניקוי ושכפול PCR, בניסוי מייצג זה, מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR-Cas9 זוהו בשיבוטים בודדים של B.gauderio ו- B.brachyistius עם הפחתת משרעת חזקה של פריקת איברים חשמליים, ואילו פקדים לא מזוהים הציגו רק גנוטיפים המוזכרים. הדמיה של משרעת פריקת איברים חשמליים בין מוטציות CRISPR מאושרות לגודל הסוכן תאמה פקדים לא מושתקים הראו כי הן מוטציית SCN-4 AA B.brachyistius והן עוברי B.gauderio היו משרעת פריקת איברים חשמליים נמוכה משמעותית מאשר פקדים. בעת ביצוע זריקות מיקרו, לנוע מהר ובכוונה ככל האפשר כדי למקסם את מספר עוברים חד-תאיים מוזרקים ששורדים.אין לבזבז זמן עם ביצים קשות. לאחר שזוהו מוטנטים מוצלחים, שיטות רבייה מסורתיות יכולות ליצור קווי מוטנטים יציבים, אשר מבטלים את חששות הפסיפסים הקשורים ל- CRSPR. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לערוך מחקרים גנומיים השוואתיים עם אימות תפקודי בשני מינים מפותחים של דגים חשמליים חלשים.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

דיגיטלי Inline הולוגרפי מיקרוסקופית (DIHM) של נושאים בחולשת פיזור

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...