Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

लेखकों मोनिका लुकास, कैथरीन शॉ, रयान टेलर, जारेड थॉम्पसन, निकोल Robichaud, और आशा है कि Healey मछली पालन, डेटा संग्रह, और जल्दी प्रोटोकॉल विकास के साथ मदद के लिए वीर प्रयासों को स्वीकार करते हैं. हम पांडुलिपि के लिए अपने सुझावों के लिए तीन समीक्षकों को भी धन्यवाद देना चाहूंगा। हमें विश्वास है कि अंतिम उत्पाद उनकी टिप्पणी को संबोधित करने के बाद बेहतर गुणवत्ता का हो. इस काम के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन #1644965 और जेआरजी के लिए #1455405 से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद वीएलएस के लिए डीजी अनुदान.

यहाँ वर्णित सभी तरीकों मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. SgRNA लक्ष्य का चयन
नोट: एक प्रोटोकॉल चरण 1.1 में sgRNAs के मै?...

कमजोर बिजली मछली की phenotypic समृद्धि, जीनोमिक्स संसाधनों के हाल ही में प्रसार के साथ, कमजोर बिजली मछली मॉडल में कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों के लिए एक मजबूत जरूरत को प्रेरित करती है. यह प्रणाली विशेष रूप से म?...

कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। टेलीओस्ट मछली के दो वंश, ऑस्टियोग्लोसिफॉर्मीज और siluriformes, समानांतर में विद्युत ग्रहण विकसित, और teleosts के पांच वंश (जिमनोटीफॉर्मीज, mormyrids, और वंश एस्ट्रोस्कॉपस, Malpterurus, और Synodontis) समानांतर में विकसित इलेक्ट्रोजेनेसिस. इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न फीनोटाइप में अभिसरण की एक उल्लेखनीय डिग्री है , जो एक सामान्य आनुवंशिक वास्तुकला1,2,3का हिस्सा है .
यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids, दो प्रजातियों अमीर teleost clades, जो उत्पादन और कमजोर बिजली के क्षेत्रों का पता लगाने और कमजोर बिजली मछली कहा जाता है के कई अभिसरण सुविधाओं द्वारा उदाहरण है. इस खोज के बाद से 50 वर्षों में कि कमजोर बिजली मछली बिजली का उपयोग करने के लिए अपने आसपास भावना औरसंवाद 4, वैज्ञानिकों के एक बढ़ते समुदाय के विकास में जबरदस्त अंतर्दृष्टि प्राप्त की है1,5 ,6, सिस्टम और सर्किट तंत्रिका विज्ञान7,8,9,10, सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान11,12, पारिस्थितिकी और ऊर्जावान13 ,14,15,16,17, व्यवहार18,19, और मैक्रोइवोल्शन3, 20,21 .
हाल ही में, बिजली की मछली1, 22 ,23,24,25,26के लिए जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक संसाधनों का प्रसार हुआ है, 27,28. इन संसाधनों के उपयोग ने पहले ही इन प्रजातियों 1,2 ,3, 28,29में जीनोटाइप और फीनोटाइप के बीच संबंध के संबंध के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि का उत्पादन किया है ,30. कमजोर विद्युत ीय मछली के लक्षणाकृत आंकड़ों के साथ जीनोमिक्स डेटा को एकीकृत करने में एक प्रमुख बाधा कार्यात्मक जीनोमिक्सउपकरण31की वर्तमान कमी है .
ऐसा ही एक उपकरण है हाल ही में विकसित क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) तकनीक के साथ बनती है. CRISPR/Cas9 एक जीनोम संपादन उपकरण है कि दोनों मॉडल32,33,34 और गैर मॉडल जीव35,36,37 एक जैसे में व्यापक उपयोग में प्रवेश किया है. CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी एक बिंदु पर प्रगति की है जहां एक प्रयोगशाला बुनियादी आणविक जीव विज्ञान में सक्षम आसानी से जीन विशेष जांच उत्पन्न कर सकते हैं लघु गाइड RNAs (sgRNAs) कहा जाता है, एक कम कीमत पर एक गैर-क्लोनिंग विधि का उपयोग कर38. CRISPR अन्य नॉकआउट / knockdown रणनीतियों पर लाभ है, जैसे morpholinos39,40, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह effector nucleases (TALENs), और जस्ता उंगली nucleases ($FNs), जो महंगे हैं और समय लेने वाली हर लक्ष्य जीन के लिए उत्पन्न करने के लिए.
CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम के एक विशिष्ट क्षेत्र को लक्षित करके जीन नॉकआउट बनाने के लिए कार्य करता है, sgRNA अनुक्रम द्वारा निर्देशित है, और एक डबल फैला ब्रेक के कारण. डबल-स्ट्रेंड ब्रेक सेल द्वारा पता लगाया जाता है और अंतर्जात डीएनए मरम्मत तंत्र को वरीयता से गैर-समजात अंत में शामिल होने (NHEJ) मार्ग का उपयोग कर के लिए ट्रिगर करता है। यह मार्ग अत्यधिक त्रुटि-प्रवण है: मरम्मत प्रक्रिया के दौरान, डीएनए अणु अक्सर डबल-स्लेड ब्रेक साइट पर सम्मिलन या विलोपन (इनडेल) को शामिल करेगा। इन indels या तो (1) खुले पढ़ने के फ्रेम में बदलाव के कारण समारोह की हानि में परिणाम कर सकते हैं, (2) एक समय से पहले रोक codon की प्रविष्टि, या (3) जीन उत्पाद की महत्वपूर्ण प्राथमिक संरचना में बदलाव. इस प्रोटोकॉल में, हम कमजोर विद्युत मछली प्रजातियों में एनएचईजे का उपयोग करके लक्ष्य जीनों में बिंदु उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए CRISPR/Cas9 संपादन का उपयोग करते हैं। जबकि सरल और अन्य तकनीकों की तुलना में अधिक कुशल, mutagenesis की इस विधि F0में phenotypic severities की एक श्रृंखला में परिणाम की उम्मीद है, जो आनुवंशिक मोज़ेकवाद के लिए जिम्मेदार ठहराया है41,42,43 ,44.
जीवों का चयन कमजोर बिजली मछली के तुलनात्मक जीनोमिक्स पर भविष्य के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के प्रयोजनों के लिए, दोनों gymnotiforms और प्रोटोकॉल विकास के लिए mormyrids के लिए एक प्रतिनिधि प्रजातियों का चयन करने की जरूरत है. मोंटेवीडियो, उरुग्वे में 2016 इलेक्ट्रिक मछली बैठक के दौरान चर्चा के बाद, वहाँ पहले से ही प्रयोगशाला में पैदा किया जा सकता है कि प्रजातियों का उपयोग करने के लिए समुदाय आम सहमति थी और कहा कि जीनोमिक संसाधनों उपलब्ध था। जिम्नोटीफॉर्म ब्रैकीहाइपोपोमस गौडरियो और मोरियड ब्रिनोमिरस ब्रैकीइस्टियस को इन मानदंडों के अनुरूप प्रजातियों के रूप में चुना गया था। दोनों प्रजातियों में, प्रेरित करने के लिए और प्रजनन की स्थिति को बनाए रखने के लिए प्राकृतिक संकेतों कैद में नकल करने के लिए आसान कर रहे हैं. बी gauderio,दक्षिण अमेरिका से एक gymnotiform प्रजातियों, कम पशुपालन आवश्यकताओं का लाभ है: मछली अपेक्षाकृत छोटे (4 एल) टैंक में अपेक्षाकृत उच्च घनत्व पर रखा जा सकता है. बी गौड़ीओ भी बंदी परिस्थितियों में तेजी से पीढ़ी के कारोबारहै . प्रयोगशाला शर्तों के तहत, बी gauderio अंडे से वयस्क के बारे में 4 महीने में विकसित कर सकते हैं.
बी ब्रैकीइस्टियस, पश्चिम-मध्य अफ्रीका से mormyrid मछली की एक प्रजाति, कैद में आसानी से नस्लों. बी ब्रैकीस्टियस मछलीघर व्यापार के माध्यम से आसानी से उपलब्ध है, व्यापक रूप से कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, और अब जीनोमिक संसाधनों की एक संख्या उपलब्ध है. प्रयोगशाला की स्थितियों के आधार पर उनका जीवन चक्र 1 से 3 वर्ष तक फैला हुआ है। पशुपालन आवश्यकताओं इस प्रजाति के लिए कुछ अधिक गहन हैं, प्रजनन के दौरान उनकी आक्रामकता के कारण मध्यम आकार के टैंक (50 डिग्री 100 एल) की आवश्यकता होती है।
बिजली की मछली की अन्य प्रजातियों का अध्ययन प्रयोगशालाओं को आसानी से प्रजातियों नस्ल किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में सक्षम होना चाहिए, और एकल सेल भ्रूण एकत्र किया जा सकता है और वयस्कता में पाला. आवास, लार्वा पालन, और इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) दरों की संभावना अन्य प्रजातियों के साथ बदल जाएगा; हालांकि, इस प्रोटोकॉल अन्य कमजोर बिजली मछली में प्रजनन के प्रयास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
अवधारणा के सबूत के लिए एक आदर्श जीन लक्ष्य: scn4aa कमजोर बिजली mormyrid और gymnotiform मछली एक विशेष अंग का निर्वहन करके बिजली के क्षेत्रों (इलेक्ट्रोजेनेसिस) उत्पन्न, बिजली के अंग कहा जाता है. विद्युत अंग निर्वहन (EODs) विद्युत अंग कोशिकाओं में कार्रवाई क्षमता के एक साथ उत्पादन से परिणाम इलेक्ट्रोसाइट्स कहा जाता है. EODs त्वचा में electroceptors की एक सरणी द्वारा पता चला रहे हैं मछली के आसपास के उच्च संकल्प विद्युत छवियों को बनाने के लिए45. कमजोर बिजली की मछली भी उनके conspecifics 'ईओडी waveforms18 के रूप में अच्छी तरह से उनके निर्वहन दर46की सुविधाओं का पता लगाने में सक्षम हैं, EODs birdsong या मेंढक के अनुरूप एक सामाजिक संचार संकेत के रूप में अतिरिक्त कार्य करने के लिए अनुमति देता है स्वर47|
मोरमिरिड और जिमनोटीफॉर्म दोनों के इलेक्ट्रोसाइट्स में क्रिया क्षमता उत्पादन का एक मुख्य घटक कमजोर विद्युत मछली है वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल NaV1.42. गैर-विद्युत teleosts दो paralogous जीन प्रतियां, scn4aa और scn4abव्यक्त करते हैं, वोल्टेज gated सोडियम चैनल NaV1.430के लिए कोडिंग . दोनों gymnotiform और mormyrid कमजोर बिजली मछली वंश में, scn4aa तेजी से विकसित किया गया है और कई एमिनो एसिड प्रतिस्थापन है कि इसकी गतिज गुण48को प्रभावित आया. सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि scn4aa दोनों वंशों में विद्युत अंग2,3 के लिए कम्पार्टमेंटल हो गयाहै. बिजली के अंग के लिए scn4aa की अपेक्षाकृत प्रतिबंधित अभिव्यक्ति, साथ ही EODs की पीढ़ी में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका, यह CRISPR/Cas9 नॉकआउट प्रयोगों के लिए एक आदर्श लक्ष्य बनाता है, क्योंकि यह कम से कम हानिकारक pleiotropic प्रभाव है. क्योंकि कमजोर बिजली की मछली उनके लार्वा बिजली के अंगों का निर्वहन शुरू 6 "8 दिन के बाद निषेचन (DPF), scn4aa का लक्ष्य ीकरण आदर्श भ्रूण microinctions के बाद तेजी से phenotyping के लिए उपयुक्त है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न phenotypes, जो एक आम आनुवंशिक वास्तुकला का हिस्सा में अभिसरण के एक हड़ताली डिग्री है. यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids के कई अभिसरण सुविधाओं द्वारा उदाहरण है, दो प्रजातियों अमीर teleost clades कि उत्पादन और कमजोर बिजली के क्षेत्रों का पता लगाने और कमजोर बिजली मछली कहा जाता है. खोज के बाद से 50 वर्षों में है कि कमजोर बिजली मछली बिजली का उपयोग करने के लिए अपने परिवेश भावना और संवाद, वैज्ञानिकों की एक बढ़ती समुदाय के विकास में जबरदस्त अंतर्दृष्टि प्राप्त की है, सिस्टम और सर्किट तंत्रिका विज्ञान, सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान, पारिस्थितिकी, विकासवादी जीव विज्ञान, और व्यवहार. हाल ही में, वहाँ बिजली की मछली के लिए जीनोमिक संसाधनों का प्रसार किया गया है. इन संसाधनों का उपयोग पहले से ही इन प्रजातियों में जीनोटाइप और phenotype के बीच संबंध के साथ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की सुविधा है. कमजोर बिजली मछली के phenotypic डेटा के साथ जीनोमिक्स डेटा को एकीकृत करने के लिए एक प्रमुख बाधा कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण ों की एक वर्तमान कमी है. हम यहाँ CRISPR/Cas9 mutagenesis कि कमजोर बिजली की मछली में अंतर्जात डीएनए मरम्मत तंत्र का इस्तेमाल प्रदर्शन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल रिपोर्ट. हम प्रदर्शित करते हैं कि इस प्रोटोकॉल दोनों mormyrid प्रजातियों Brienomyrus ब्रैकीइस्टियस और gymnotiform Brachyhypopomus gauderio में समान रूप से प्रभावी है CRISPR/Cas9 का उपयोग करके indels और बिंदु उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए के पहले exon सोडियम चैनल जीन scn4aa| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, दोनों प्रजातियों के भ्रूण प्राप्त किए गए थे और यह पुष्टि करने के लिए जीनोटाइप किए गए थे कि सोडियम चैनल scn4aa के पहले एक्सऑन में अनुमानित उत्परिवर्तन मौजूद थे। नॉक आउट सफलता phenotype कम बिजली अंग निर्वहन आयाम दिखा रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की थी जब इंजेक्शन आकार मिलान नियंत्रण की तुलना में.

SgRNA लक्ष्य साइटों दोनों बी gauderio और बी brachyistius में scn4aa के exon 1 के भीतर की पहचान की गई के रूप में धारा 1 में वर्णित. sgRNAs धारा 2 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किए गए थे। सफल sgRNA चयन और संश्लेषण के बाद (चित्...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

यहाँ, एक प्रोटोकॉल का उत्पादन और CRISPR/Cas9 जीनोम नॉकआउट बिजली मछली के पीछे प्रस्तुत किया है. विस्तार से उल्लिखित दोनों एक gymnotiform और एक mormyrid के लिए आवश्यक आणविक जीव विज्ञान, प्रजनन, और पशुपालन आवश्यकताओं, और इंजेक्शन तकनीक Cas9 प्रेरित indel एफ0 लार्वा का उत्पादन कर रहे हैं.

स्पार्क को सिलिंग: कमजोर इलेक्ट्रिक मछली में CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9 जीन संपादन कमजोर इलेक्ट्रिक मछली में, विशेष रूप से एक तुलनात्मक संदर्भ में, शोधकर्ताओं को कैसे विशिष्ट जीन और आनुवंशिक विचरण phenotypic भिन्नता में योगदान के बारे में परिकल्पना का परीक्षण करने में सक्षम होगा । CRISPR/Cas9 उत्परिवर्ती एफ-शून्य भ्रूण पैदा करने के लिए एक कुशल तरीका है । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कमजोर बिजली की मछली की दो अभिसरण विकसित प्रजातियों में CRISPR-Cas9 जोड़तोड़ का संचालन करने की अनुमति देता है ।अन्य इलेक्ट्रिक मछली या अन्य मछली प्रजातियों में कुछ संशोधनों के साथ इस दृष्टिकोण का उपयोग करने की कुंजी एसजीआरएनए बनाने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक या जीनोमिक संसाधनों की उपलब्धता है। माइक्रोइंजेक्शन का प्रदर्शन करना और 2डी प्लेन के भीतर 3डी स्थान में कोशिकाओं की कल्पना करना मुश्किल हो सकता है। सामान्य माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों का अभ्यास करने के लिए अंडे के लिए एक छोटी जेब्राफिश कॉलोनी प्राप्त करें।Savvas कांस्टेंटिनो के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन जारेड थॉम्पसन, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा। उचित प्रजनन स्थितियों के तहत ब्याज की मछली प्रजातियों के आवास के बाद, मादा मछली की पहचान करें जो गुरुत्वाकर्षण दिखाई देती है। बी. गौडरियो में, मादा को सूजन गोनाड सिर्फ वेंट के लिए कौडल होगा।बी ब्रैकिस्टियस में महिलाओं में सूजन पेट होंगे और गहरे शरीर में दिखाई देंगे। संज्ञाहरण प्रशासन के बाद, पूरी तरह से मिश्रण के साथ एक पीसीआर ट्यूब में डीपीबीएस की मात्रा चार गुना करने के लिए स्पॉनिंग एजेंट जोड़ें। समाधान बादल बन जाएंगे।गणना की गई खुराक को मापने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और 28-गेज 19-मिलीलीटर लंबाई वाली सुई से लैस सटीक ग्लास सिरिंज में समाधान खींचने से पहले पतला एजेंट को थर्मोप्लास्टिक के एक टुकड़े में वितरित करें। समाधान को एक चिकनी दर पर पृष्ठीय ट्रंक मांसपेशी में इंजेक्ट करें और सुई को हटाने से पहले दो से चार सेकंड तक बैठने दें। फिर, तुरंत मछली को वसूली के लिए ताजा प्रणाली के पानी में रखें।बी. गौडरियो शुक्राणु संग्रह के लिए, 24 घंटे के बाद, एक बड़े पुरुष मछली का चयन करें और जितनी जल्दी हो सके, मछली को अच्छी तरह से सुखा लें, विशेष रूप से सिर और वेंट के आसपास। सूखे मछली वेंट्रल साइड को ऊपर रखें, उपयुक्त धारक में बाईं ओर पूर्वकाल, एक MS222 लथपथ नम कागज तौलिया में सिर के साथ कवर किया जाता है जितना संभव हो मेज के साथ समानांतर। तुरंत कौडल में दबाव लागू करने के लिए प्रकाश के साथ रोस्ट्रल दिशा में वेंट की ओर तुरंत निचोड़ता है और एक टिप के साथ एक माइक्रोपाइपेटर का उपयोग कर, ध्यान से शुक्राणु इकट्ठा के रूप में यह ५० माइक्रोलीटर वेतन वृद्धि में पुरुष से निचोड़ा है ।बर्फ पर शुक्राणु विस्तारक समाधान के 500 -माइक्रोलीटर मात्रा पर सीधे शुक्राणु का aliquot जोड़ें। संग्रह के तुरंत बाद, मछली को कीचड़ कोट संरक्षण उत्पाद-इलाज ताजा प्रणाली के पानी में रखें। बी. गौडरियो अंडे संग्रह के लिए, एक एनेस्थेटाइज्ड बी. गौडरियो मादा मछली सुखाने के बाद, तुरंत मछली को अपनी तरफ रखने के लिए, गैर-डोमिनेंट हाथ का सामना कर रहे सिर के साथ मछली को अपनी तरफ रखें और वेंट की ओर जानेड्स पर मध्यस्थता करने वाले प्रकाश के साथ रॉक्रल दिशा में दबाव लागू करें।पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन उपकरण का उपयोग करके, सावधानी से अंडे एकत्र करें क्योंकि वे क्लोका से निचोड़ा जाता है और जल्दी से अंडे को एक छोटे से कवर पेट्री डिश में रखें। यदि निचोड़ने के बाद अकेले काम कर रहे हैं, तो अंडे के द्रव्यमान को छोटे पेट्री डिश के आधार पर स्पर्श करें क्योंकि उन्हें मादा से निष्कासित कर दिया जाता है। अंडे इकट्ठा करने के तुरंत बाद, मछली को कीचड़ कोट संरक्षण उत्पाद-उपचारित ताजा प्रणाली के पानी में रखें।बी. गौडरियो इन विट्रो निषेचन के लिए, अंडे के द्रव्यमान पर सीधे मिश्रित शुक्राणु एसईएस समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद ताजा सिस्टम पानी का एक मिलीलीटर। कोशिकाओं को 0.22-माइक्रोमीटर पोर फ़िल्टर सिस्टम पानी के अतिरिक्त एक से दो मिलीलीटर जोड़ने से पहले 30 से 60 सेकंड के लिए गेमेस सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिलाएं। इन विट्रो निषेचन समय के साथ पकवान लेबल और एक 29 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान जगह है, एक ५० मिनट के टाइमर की स्थापना के विकास की प्रगति की जांच करें ।निषेचन अवधि के दौरान, एक माइक्रोलोडर पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए ब्याज के इंजेक्शन समाधान के दो माइक्रोलीटर को माइक्रोइंजेक्शन सुई में बैकलोड करें और तरल को यथासंभव टिप के करीब निष्कासित करें। जब कम से कम एक कोशिका के पशु ध्रुव पर एक कोशिका का गठन किया गया है, तो एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पकवान को स्थानांतरित करें और सुई के टेपर को कठोरता प्रदर्शित करने के लिए शुरू होने वाले एक बेवल कोण पर सुई टिप को तोड़ने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। एक कठोर टेपर को बनाए रखते हुए सुई का बोर जितना संभव हो उतना छोटा रहना चाहिए।माइक्रोस्कोप के नीचे विकासशील जाइगोट्स की पहचान करें और पेट्री डिश के उल्टे शीर्ष में सेट ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के किनारे पर जितना संभव हो सके 10 से 20 अंडे को कम पानी में रखने के लिए एक कट टिप के साथ प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करना, धीरे से स्लाइड के किनारे करने के लिए अंडे का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए अतिरिक्त पानी को दूर करने के लिए स्लाइड दबाएं । पानी स्लाइड के तहत दुष्ट हो जाएगा और किनारे के खिलाफ अंडे खींच।इंजेक्शन के दौरान अंडे के आंदोलन से बचने के लिए थोड़ा खड़ी नमी बनाए रखते हुए अंडे को नम रखने के लिए पर्याप्त पानी होना चाहिए। स्लाइड के खिलाफ अंडे को लंबवत, आ रही सुई के लंबवत, और कोरियोन के खिलाफ सुई की स्थिति के लिए एक माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करें। फिर, एक मोटे तौर पर ४५ डिग्री कोण पर सुई पकड़े, कोरियेशन में पहले टिप डालें और फिर, एकल सेल में, यदि संभव हो तो जर्दी के माध्यम से इंजेक्शन ।ठीक संदंश के साथ इंजेक्शन के दौरान किसी भी टूटे हुए अंडे निकालें। जब सभी अंडों को इंजेक्शन दिया गया है, तो इंजेक्शन चरण से अंडे को एक नए 100 मिलीमीटर व्यास पेट्री डिश में धीरे से फ्लश करने के लिए 0.22-माइक्रोमीटर पोर फ़िल्टर सिस्टम पानी की एक धार की बोतल का उपयोग करें। एक सफल लघु गाइड आरएनए चयन और संश्लेषण के बाद, इन विट्रो क्लीवेज को एकल सेल माइक्रोइंजेक्शन के लिए चयन के लिए परीक्षण किया जा सकता है।पीसीआर साफ और क्लोनिंग के बाद, इस प्रतिनिधि प्रयोग में, CRISPR-Cas9 प्रेरित म्यूटेशन की पहचान व्यक्तिगत बी. गौडरियो और बी. ब्रैकिस्टियस क्लोन में मजबूत इलेक्ट्रिक ऑर्गन डिस्चार्ज आयाम में कमी के साथ की गई थी, जबकि यूनिजेनेक्टेड नियंत्रण केवल संदर्भित जीनोटाइप प्रदर्शित करते थे। पुष्टि CRISPR म्यूटेंट और एजेंट आकार के बीच इलेक्ट्रिक अंग निर्वहन आयाम के दृश्य से मिलान किया गया यूनिंजेक्टेड नियंत्रणों ने यह दर्शा दिया कि एससीएन-4 एए उत्परिवर्ती बी ब्रैकिस्टियस और बी. गौडरियो भ्रूण दोनों में नियंत्रण की तुलना में इलेक्ट्रिक अंग निर्वहन आयाम काफी कम था। सूक्ष्म इंजेक्शन का प्रदर्शन करते समय, जीवित रहने वाले एकल-कोशिका इंजेक्शन भ्रूण की संख्या को अधिकतम करने के लिए जितनी जल्दी और जानबूझकर संभव हो जाएं।मुश्किल अंडे के साथ समय बर्बाद न करें। एक बार सफल म्यूटेंट की पहचान हो जाने के बाद, पारंपरिक प्रजनन विधियां स्थिर उत्परिवर्ती रेखाएं बना सकती हैं, जो सीआरएसपीआर से जुड़ी मोज़ेकिज्म चिंताओं को खत्म करती हैं। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कमजोर विद्युत मछली की दो अभिसरण विकसित प्रजातियों में कार्यात्मक सत्यापन के साथ तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययन करने की अनुमति देगा ।

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium की मध्यस्थता वायरस प्रेरित कपास जीन का मुंह बंद परख

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

साथ जीनोम संपादन CompoZr कस्टम जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

कमजोर बिखरने विषय के डिजिटल इनलाइन होलोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (DIHM)

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9 के माध्यम से स्तनधारी सेल लाइनों में जीनोमिक विलोपन का सृजन

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

में जीनोम एडिटिंग<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; का प्रयोग ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए क्यूलेक्स मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

नासोनिया विट्रिपेनिस में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

टीजीएफ-β-मध्यस्थता एंडोथेलियल से मेसेंचिमल ट्रांजिशन (एंडएमटी) और CRISPR/Cas9 जीन संपादन का उपयोग करके एंडएमटी प्रभावकर्ताओं का कार्यात्मक मूल्यांकन

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रवासी टिड्डियों के होमोजीगस उत्परिवर्ती का निर्माण

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...