Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Gli autori riconoscono gli sforzi eroici di Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey per l'aiuto con l'allevamento dei pesci, la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo iniziale. Vorremmo anche ringraziare i tre recensori per i loro suggerimenti al manoscritto. Crediamo che il prodotto finale sia di migliore qualità dopo aver affrontato i loro commenti. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno della National Science Foundation #1644965 e #1455405 al JRG, e dalla sovvenzione della DG del Consiglio per le Scienze Naturali e la Ricerca Ingegneria a VLS.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Michigan State University.
1. Selezione dei bersagli sgRNA
 NOT:</</c0> Nel passaggio 1.1 viene fornito un protocollo per la progettazione manuale degli sgRNA. Questo è stato utilizzato per la selezione del bersaglio scn4aa. Viene fornito un protocollo aggiuntivo per facilitare questo processo (passaggio 1.2) utilizzando il portale web EFI...

La ricchezza fenotipica dei pesci debolmente elettrici, insieme a una recente proliferazione delle risorse genomiche, motiva un forte bisogno di strumenti genomici funzionali nel modello di pesce debolmente elettrico. Questo sistema è particolarmente attraente a causa della convergente evoluzione di numerosi tratti fenotipici in linee parallele di pesci, che sono facilmente conservati in laboratorio.
Il protocollo qui descritto dimostra l'efficacia della tecnica CRISPR/Cas9 nei lignaggi di pe...

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l'elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune1,2,3.
Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie, che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare4, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi intuizioni sull'evoluzione dello sviluppo1,5 ,6, sistemi e circuiti neuroscienze7,8,9,10, fisiologia cellulare11,12, ecologia ed energiche13 ,14,15,16,17, comportamento18,19e macroevoluzione3,20,21 .
Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche, trascrittomiche e proteomiche perilpesce elettrico 1,22,23,24,25,26, 27,28. L'uso di queste risorse ha già prodotto importanti intuizioni riguardanti la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie1,2,3,28,29 ,30. Un grande ostacolo all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali31.
Uno di questi strumenti è la tecnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats di recente sviluppo in coppia con la tecnica Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 è uno strumento di editing del genoma che è entrato in uso diffuso sia nel modello32,33,34 e organismi non modello35,36,37 allo stesso modo. La tecnologia CRISPR/Cas9 è progredita fino a un punto in cui un laboratorio in grado di biologia molecolare di base può facilmente generare sonde specifiche del gene chiamate RNA guida corta (sgRNA), a basso costo utilizzando un metodo non di clonazione38. CRISPR ha vantaggi rispetto ad altre strategie di knockout/knockdown, come i morfolino39,40, le nucleasi effettore simili a attivatori di trascrizione (TALENs) e le nucleasi di dito di zinco, che sono costose e che richiede molto tempo per generare per ogni gene bersaglio.
Il sistema CRISPR/Cas9 funziona per creare eliminazioni genetiche prendendo di mira una regione specifica del genoma, diretta dalla sequenza sgRNA, e causando una rottura a doppio filamento. La rottura a doppio filamento viene rilevata dalla cellula e attiva preferibilmente meccanismi endogeni di riparazione del DNA utilizzando il percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ). Questo percorso è altamente soggetto a errori: durante il processo di riparazione, la molecola di DNA spesso incorpora inserimenti o delezioni (indel) nel sito di rottura a doppio filamento. Questi indels possono comportare una perdita di funzione a causa di (1) spostamenti nel frame di lettura aperto, (2) inserimento di un codone di arresto prematuro o (3) cambiamenti nella struttura primaria critica del prodotto genetico. In questo protocollo, utilizziamo l'editing CRISPR/Cas9 per individuare mutazioni di punti bersaglio nei geni bersaglio usando il NHEJ in specie di pesci debolmente elettriche. Mentre più semplice e più efficiente di altre tecniche, questo metodo di mutagenesi si prevede di provocare una gamma di gravità fenotipica in F0, che è attribuito al mosaicismo genetico41,42,43 ,44.
Selezione degli organismi Al fine di facilitare gli studi futuri sulla genomica comparativa dei pesci debolmente elettrici, era necessario selezionare una specie rappresentativa sia per gymnotiformi che per gli omestidi per lo sviluppo del protocollo. A seguito delle discussioni durante l'incontro del pesce elettrico del 2016 a Montevideo, in Uruguay, c'era un consenso della comunità per l'utilizzo di specie che potevano già essere allevate in laboratorio e che avevano risorse genomiche disponibili. La gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio e il mormyrid Brienomyrus brachyistius sono stati selezionati come specie che si adattano a questi criteri. In entrambe le specie, i segnali naturali per indurre e mantenere le condizioni di allevamento sono facili da imitare in cattività. B. gauderio, una specie gymnotiforme del Sud America, ha il vantaggio di bassi requisiti di allevamento: i pesci possono essere mantenuti ad una densità relativamente elevata in vasche relativamente piccole (4 L). B. gauderio ha anche un rapido ricambio generazionale in condizioni dicattività. In condizioni di laboratorio, B. gauderio può svilupparsi da uovo a adulto in circa 4 mesi.
B. brachyistius, una specie di pesce mormyrid dell'Africa centro-occidentale, nidifica prontamente in cattività. B. brachyistius è prontamente disponibile attraverso il commercio dell'acquario, è stato ampiamente utilizzato in molti studi, e ora ha una serie di risorse genomiche disponibili. Il loro ciclo di vita dura 1 o 3 anni, a seconda delle condizioni di laboratorio. I requisiti dell'allevamento sono un po' più intensi per questa specie, richiedendo vasche di dimensioni moderate (50-100 L) a causa della loro aggressività durante l'allevamento.
I laboratori che studiano altre specie di pesci elettrici dovrebbero essere in grado di adattare facilmente questo protocollo fintanto che la specie può essere allevata e gli embrioni a singola cellula possono essere raccolti e allevati fino all'età adulta. L'alloggio, l'allevamento larvale e i tassi di fecondazione in vitro (IVF) probabilmente cambieranno con altre specie; tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per i tentativi di allevamento in altri pesci debolmente elettrici.
Un obiettivo gene ideale per la prova di concetto: scn4aa I pesci mormyrid e gymnotiformi poco elettrici generano campi elettrici (elettrogenesi) scaricando un organo specializzato, chiamato organo elettrico. Le scariche di organi elettrici (EOD) derivano dalla produzione simultanea di potenziali d'azione nelle cellule di organi elettrici chiamati elettrociti. Gli EOD vengono rilevati da una serie di elettrorecettori nella pelle per creare immagini elettriche ad alta risoluzione dell'ambiente circostante del pesce45. I pesci poco elettrici sono anche in grado di rilevare le caratteristiche delle forme d'onda EOD dei loro conspecifici18 così come i loro tassi di scarico46, permettendo alle EOD di funzionare in aggiunta come segnale di comunicazione sociale analogo al canto degli uccelli o alla rana vocalizzazioni47.
Una componente principale della generazione potenziale di azione negli elettrociti del pesce mormyrid e gymnotiforme debolmente elettrico è il canale di sodio NaV1.42. I teleost s'esolti non elettrici esprimono due copie geniche paralologie, scn4aa e scn4ab, codificando per il canale di sodio NaV1.430. In entrambe le linee di pesce gymnotiformi e mormyrid debolmente elettriche, scn4aa si è evoluto rapidamente e ha subito numerose sostituzioni di amminoacidi che influenzano le sue proprietà cinetiche48. Ancora più importante, scn4aa è diventato compartimentato in entrambi i lignaggi per l'organo elettrico2,3. L'espressione relativamente limitata di scn4aa all'organo elettrico, così come il suo ruolo chiave nella generazione di EOD, lo rende un bersaglio ideale per gli esperimenti di knockout CRISPR/Cas9, in quanto ha effetti pleiotropici deleteri minimi. Poiché i pesci debolmente elettrici iniziano a scaricare i loro organi elettrici larvali 6-8 giorni dopo la fecondazione (DPF), il targeting dello scn4aa è ideale per la fenotipizzazione rapida dopo la microiniezione dell'embrione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull'evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L'uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l'esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell'organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.

I siti di destinazione dello sgRNA sono stati identificati all'interno dell'esone 1 di scn4aa in B. gauderio e B. brachyistius come descritto nella Sezione 1. Gli sgRNA sono stati generati come descritto nella Sezione 2. A seguito del successo della selezione e della sintesi dello sgRNA (Figura 1), è stata testata la scissione in vitro (Figura 2). Gli sgRNA che dimostrano il taglio in vitro sono stati poi selezionati per le microiniez...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

L'editing genico CRISPR/Cas9 nei pesci debolmente elettrici, in particolare in un contesto comparativo, consentirà ai ricercatori di testare ipotesi su come geni specifici e varianza genetica contribuiscono alla variazione fenotipica. CRISPR/Cas9 è un metodo efficiente per generare embrioni F-zero mutanti. Questo protocollo consente ai ricercatori di condurre manipolazioni CRISPR-Cas9 in due specie convergently evolute di pesci debolmente elettrici.La chiave per utilizzare questo approccio con alcune modifiche in altri pesci elettrici o altre specie ittiche è la disponibilità di risorse trascrittomiche o genomiche per fare sgRNA. Eseguire le microiniezioni e visualizzare le cellule in una posizione 3D all'interno di un piano 2D può essere difficile. Ottieni una piccola colonia di zebrafish per le uova per praticare tecniche generali di microiniezione.A dimostrare la procedura con Savvas Constantinou sarà Jared Thompson, un tecnico del mio laboratorio. Dopo aver alloggiato le specie ittiche di interesse nelle condizioni di riproduzione appropriate, identificare i pesci femminili che appaiono gravidi. In B.gauderio, la femmina avrà gonadi gonfi appena caudal allo sfiato.In B.brachyistius le femmine avranno pance gonfie e appariranno corpose. Dopo la somministrazione di anestesia, aggiungere l'agente di deposizione delle uova a quattro volte il volume di DPBS in un tubo PCR con miscelazione accurata. La soluzione diventerà nuvolosa.Utilizzare una pipetta per misurare la dose calcolata e erogare l'agente diluito a un pezzo di termoplastica prima di disegnare la soluzione in una siringa di vetro di precisione dotata di un ago smussato di lunghezza da 19 a 25 millilitri calibro. Iniettare la soluzione nel muscolo del tronco dorsale a una velocità regolare e lasciare riposare l'ago per due o quattro secondi prima della rimozione. Quindi, mettere immediatamente il pesce in acqua di sistema fresca per il recupero.Per la raccolta dello sperma B.gauderio, dopo 24 ore, selezionare un grande pesce maschio e il più rapidamente possibile dopo la sedazione, asciugare accuratamente il pesce, specialmente intorno alla testa e a Vent. Posizionare il lato ventrale del pesce essiccato verso l'alto, anteriore a sinistra in un apposito supporto, coperto da un tovagliolo di carta umido imbevuto di MS222 con la testa il più parallela possibile al tavolo. Applicare immediatamente la pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura immediatamente sopra le gonadi verso lo sfiato e utilizzando un micropipetter con una punta, raccogliere attentamente lo sperma mentre viene spremuto dal maschio in incrementi di 50 microliter.Aggiungere l'aliquota dello sperma direttamente sui volumi di 500 microliter di soluzione di estensione dello sperma sul ghiaccio. Subito dopo la raccolta, mettere il pesce nell'acqua del sistema fresco trattata con trattamento con melma. Per la raccolta delle uova B.gauderio, dopo aver asciugato un pesce femmina B.gauderio anestetizzato, posizionare immediatamente il pesce su un lato con la testa rivolta verso la mano non dominante e applicare pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura mediale sulle gonadi verso lo sfiato.Utilizzando uno strumento di politetrafluoroetilene, raccogliere attentamente le uova mentre vengono spremute dalla cloaca e posizionare rapidamente le uova in una piccola piastra di Petri coperta. Se lavori da solo dopo aver spremitura, tocca la massa dell'uovo alla base della piccola piastra di Petri mentre vengono espulsi dalla femmina. Immediatamente dopo aver raccolto le uova, mettere il pesce in acqua del sistema fresco trattata con melma.Per la fecondazione in vitro di B.gauderio, aggiungere 100 microlitri della soluzione SES dello sperma ben miscelata direttamente sulla massa dell'uovo, seguita da un millilitro di acqua dolce del sistema. Mescolare accuratamente le sospensioni dei gameti per 30-60 secondi prima di aggiungere alle cellule un ulteriore da uno a due millilitri di acqua di sistema filtrata con pori da 0,22 micrometri. Etichettare il piatto con il tempo di fecondazione in vitro e posizionare il piatto in un incubatore Celsius di 29 gradi, impostando un timer di 50 minuti per controllare l'avanzamento dello sviluppo.Durante il periodo di concimazione, utilizzare una punta della pipetta del microloader per scaricare due microlitri della soluzione di iniezione di interesse in un ago di microiniezione ed espellere il liquido il più vicino possibile alla punta. Quando una singola cellula si è formata sul palo animale di almeno una cella, trasferire il piatto al microscopio sezionante e utilizzare un paio di pini fini per rompere la punta dell'ago con un angolo smussato verso il punto in cui il cono dell'ago inizia a dimostrare rigidità. Il foro dell'ago deve rimanere il più piccolo possibile mantenendo una cono rigida.Identificare gli zigoti in via di sviluppo al microscopio e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata per posizionare da 10 a 20 uova nella massima acqua possibile sul bordo dello scivolo del microscopio di vetro incastonato nella parte superiore rovesciata della piastra di Petri. Utilizzando una delicata salvietta per le attività, premere delicatamente lo scivolo per rimuovere l'acqua in eccesso per consentire alle uova di aderire saldamente al bordo dello scivolo. L'acqua sarà malvagia sotto lo scivolo e tirerà le uova contro il bordo.Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere le uova umidi mantenendo poca umidità in piedi per evitare il movimento delle uova durante l'iniezione. Allineare le uova contro lo scivolo verticalmente, perpendicolare all'ago in avvicinamento, e utilizzare un micromanipolatore per posizionare l'ago contro il corore. Quindi, tenendo l'ago con un angolo di circa 45 gradi, inserire la punta prima nel corore e poi, nella singola cella, iniettando attraverso il tuorlo, se possibile.Rimuovere eventuali uova rotte durante l'iniezione con forcette fini. Quando tutte le uova sono state iniettate, utilizzare una bottiglia di squirt di acqua di sistema filtrata a poro di 0,22 micrometri per sciacquare delicatamente le uova dalla fase di iniezione in una nuova piastra di Petri di 100 millimetri di diametro. A seguito di una breve guida di successo RNA selezione e sintesi, la scissione in vitro può essere testata per la selezione per microiniezioni a singola cellula.Dopo la pulizia e la clonazione della PCR, in questo esperimento rappresentativo, le mutazioni indotte da CRISPR-Cas9 sono state identificate nei singoli cloni B.gauderio e B.brachyistius con una forte riduzione dell'ampiezza della scarica di organi elettrici, mentre i controlli non iniettati mostravano solo genotipi a cui si fa riferimento. La visualizzazione dell'ampiezza di scarica dell'organo elettrico tra mutanti CRISPR confermati e dimensioni dell'agente abbinate ai controlli non iniettati ha dimostrato che sia gli embrioni mutanti SCN-4 AA B.brachyistius che B.gauderio avevano ampiezze di scarica di organi elettrici significativamente inferiori rispetto ai controlli. Quando si eseguono le micro iniezioni, muoversi il più rapidamente e deliberatamente possibile per massimizzare il numero di embrioni iniettati a una cellula che sopravvivono.Non perdere tempo con uova difficili. Una volta identificati i mutanti di successo, i metodi di riproduzione tradizionali possono creare linee mutanti stabili, che eliminano le preoccupazioni di mosaicismo associate al CRSPR. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di condurre studi genomici comparativi con convalida funzionale in due specie conver delicatamente evolute di pesci debolmente elettrici.

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Ricerca

Biologia

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β endoteliale mediato a transizione mesenchimale (EndMT) e la valutazione funzionale degli effettori EndMT utilizzando crispr/cas9 gene editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...