Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Gli autori riconoscono gli sforzi eroici di Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey per l'aiuto con l'allevamento dei pesci, la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo iniziale. Vorremmo anche ringraziare i tre recensori per i loro suggerimenti al manoscritto. Crediamo che il prodotto finale sia di migliore qualità dopo aver affrontato i loro commenti. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno della National Science Foundation #1644965 e #1455405 al JRG, e dalla sovvenzione della DG del Consiglio per le Scienze Naturali e la Ricerca Ingegneria a VLS.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Michigan State University.
1. Selezione dei bersagli sgRNA
 NOT:</</c0> Nel passaggio 1.1 viene fornito un protocollo per la progettazione manuale degli sgRNA. Questo è stato utilizzato per la selezione del bersaglio scn4aa. Viene fornito un protocollo aggiuntivo per facilitare questo processo (passaggio 1.2) utilizzando il portale web EFI...

La ricchezza fenotipica dei pesci debolmente elettrici, insieme a una recente proliferazione delle risorse genomiche, motiva un forte bisogno di strumenti genomici funzionali nel modello di pesce debolmente elettrico. Questo sistema è particolarmente attraente a causa della convergente evoluzione di numerosi tratti fenotipici in linee parallele di pesci, che sono facilmente conservati in laboratorio.
Il protocollo qui descritto dimostra l'efficacia della tecnica CRISPR/Cas9 nei lignaggi di pe...

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l'elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune1,2,3.
Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie, che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare4, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi intuizioni sull'evoluzione dello sviluppo1,5 ,6, sistemi e circuiti neuroscienze7,8,9,10, fisiologia cellulare11,12, ecologia ed energiche13 ,14,15,16,17, comportamento18,19e macroevoluzione3,20,21 .
Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche, trascrittomiche e proteomiche perilpesce elettrico 1,22,23,24,25,26, 27,28. L'uso di queste risorse ha già prodotto importanti intuizioni riguardanti la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie1,2,3,28,29 ,30. Un grande ostacolo all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali31.
Uno di questi strumenti è la tecnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats di recente sviluppo in coppia con la tecnica Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 è uno strumento di editing del genoma che è entrato in uso diffuso sia nel modello32,33,34 e organismi non modello35,36,37 allo stesso modo. La tecnologia CRISPR/Cas9 è progredita fino a un punto in cui un laboratorio in grado di biologia molecolare di base può facilmente generare sonde specifiche del gene chiamate RNA guida corta (sgRNA), a basso costo utilizzando un metodo non di clonazione38. CRISPR ha vantaggi rispetto ad altre strategie di knockout/knockdown, come i morfolino39,40, le nucleasi effettore simili a attivatori di trascrizione (TALENs) e le nucleasi di dito di zinco, che sono costose e che richiede molto tempo per generare per ogni gene bersaglio.
Il sistema CRISPR/Cas9 funziona per creare eliminazioni genetiche prendendo di mira una regione specifica del genoma, diretta dalla sequenza sgRNA, e causando una rottura a doppio filamento. La rottura a doppio filamento viene rilevata dalla cellula e attiva preferibilmente meccanismi endogeni di riparazione del DNA utilizzando il percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ). Questo percorso è altamente soggetto a errori: durante il processo di riparazione, la molecola di DNA spesso incorpora inserimenti o delezioni (indel) nel sito di rottura a doppio filamento. Questi indels possono comportare una perdita di funzione a causa di (1) spostamenti nel frame di lettura aperto, (2) inserimento di un codone di arresto prematuro o (3) cambiamenti nella struttura primaria critica del prodotto genetico. In questo protocollo, utilizziamo l'editing CRISPR/Cas9 per individuare mutazioni di punti bersaglio nei geni bersaglio usando il NHEJ in specie di pesci debolmente elettriche. Mentre più semplice e più efficiente di altre tecniche, questo metodo di mutagenesi si prevede di provocare una gamma di gravità fenotipica in F0, che è attribuito al mosaicismo genetico41,42,43 ,44.
Selezione degli organismi Al fine di facilitare gli studi futuri sulla genomica comparativa dei pesci debolmente elettrici, era necessario selezionare una specie rappresentativa sia per gymnotiformi che per gli omestidi per lo sviluppo del protocollo. A seguito delle discussioni durante l'incontro del pesce elettrico del 2016 a Montevideo, in Uruguay, c'era un consenso della comunità per l'utilizzo di specie che potevano già essere allevate in laboratorio e che avevano risorse genomiche disponibili. La gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio e il mormyrid Brienomyrus brachyistius sono stati selezionati come specie che si adattano a questi criteri. In entrambe le specie, i segnali naturali per indurre e mantenere le condizioni di allevamento sono facili da imitare in cattività. B. gauderio, una specie gymnotiforme del Sud America, ha il vantaggio di bassi requisiti di allevamento: i pesci possono essere mantenuti ad una densità relativamente elevata in vasche relativamente piccole (4 L). B. gauderio ha anche un rapido ricambio generazionale in condizioni dicattività. In condizioni di laboratorio, B. gauderio può svilupparsi da uovo a adulto in circa 4 mesi.
B. brachyistius, una specie di pesce mormyrid dell'Africa centro-occidentale, nidifica prontamente in cattività. B. brachyistius è prontamente disponibile attraverso il commercio dell'acquario, è stato ampiamente utilizzato in molti studi, e ora ha una serie di risorse genomiche disponibili. Il loro ciclo di vita dura 1 o 3 anni, a seconda delle condizioni di laboratorio. I requisiti dell'allevamento sono un po' più intensi per questa specie, richiedendo vasche di dimensioni moderate (50-100 L) a causa della loro aggressività durante l'allevamento.
I laboratori che studiano altre specie di pesci elettrici dovrebbero essere in grado di adattare facilmente questo protocollo fintanto che la specie può essere allevata e gli embrioni a singola cellula possono essere raccolti e allevati fino all'età adulta. L'alloggio, l'allevamento larvale e i tassi di fecondazione in vitro (IVF) probabilmente cambieranno con altre specie; tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per i tentativi di allevamento in altri pesci debolmente elettrici.
Un obiettivo gene ideale per la prova di concetto: scn4aa I pesci mormyrid e gymnotiformi poco elettrici generano campi elettrici (elettrogenesi) scaricando un organo specializzato, chiamato organo elettrico. Le scariche di organi elettrici (EOD) derivano dalla produzione simultanea di potenziali d'azione nelle cellule di organi elettrici chiamati elettrociti. Gli EOD vengono rilevati da una serie di elettrorecettori nella pelle per creare immagini elettriche ad alta risoluzione dell'ambiente circostante del pesce45. I pesci poco elettrici sono anche in grado di rilevare le caratteristiche delle forme d'onda EOD dei loro conspecifici18 così come i loro tassi di scarico46, permettendo alle EOD di funzionare in aggiunta come segnale di comunicazione sociale analogo al canto degli uccelli o alla rana vocalizzazioni47.
Una componente principale della generazione potenziale di azione negli elettrociti del pesce mormyrid e gymnotiforme debolmente elettrico è il canale di sodio NaV1.42. I teleost s'esolti non elettrici esprimono due copie geniche paralologie, scn4aa e scn4ab, codificando per il canale di sodio NaV1.430. In entrambe le linee di pesce gymnotiformi e mormyrid debolmente elettriche, scn4aa si è evoluto rapidamente e ha subito numerose sostituzioni di amminoacidi che influenzano le sue proprietà cinetiche48. Ancora più importante, scn4aa è diventato compartimentato in entrambi i lignaggi per l'organo elettrico2,3. L'espressione relativamente limitata di scn4aa all'organo elettrico, così come il suo ruolo chiave nella generazione di EOD, lo rende un bersaglio ideale per gli esperimenti di knockout CRISPR/Cas9, in quanto ha effetti pleiotropici deleteri minimi. Poiché i pesci debolmente elettrici iniziano a scaricare i loro organi elettrici larvali 6-8 giorni dopo la fecondazione (DPF), il targeting dello scn4aa è ideale per la fenotipizzazione rapida dopo la microiniezione dell'embrione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull'evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L'uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l'esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell'organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.

I siti di destinazione dello sgRNA sono stati identificati all'interno dell'esone 1 di scn4aa in B. gauderio e B. brachyistius come descritto nella Sezione 1. Gli sgRNA sono stati generati come descritto nella Sezione 2. A seguito del successo della selezione e della sintesi dello sgRNA (Figura 1), è stata testata la scissione in vitro (Figura 2). Gli sgRNA che dimostrano il taglio in vitro sono stati poi selezionati per le microiniez...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

L'editing genico CRISPR/Cas9 nei pesci debolmente elettrici, in particolare in un contesto comparativo, consentirà ai ricercatori di testare ipotesi su come geni specifici e varianza genetica contribuiscono alla variazione fenotipica. CRISPR/Cas9 è un metodo efficiente per generare embrioni F-zero mutanti. Questo protocollo consente ai ricercatori di condurre manipolazioni CRISPR-Cas9 in due specie convergently evolute di pesci debolmente elettrici.La chiave per utilizzare questo approccio con alcune modifiche in altri pesci elettrici o altre specie ittiche è la disponibilità di risorse trascrittomiche o genomiche per fare sgRNA. Eseguire le microiniezioni e visualizzare le cellule in una posizione 3D all'interno di un piano 2D può essere difficile. Ottieni una piccola colonia di zebrafish per le uova per praticare tecniche generali di microiniezione.A dimostrare la procedura con Savvas Constantinou sarà Jared Thompson, un tecnico del mio laboratorio. Dopo aver alloggiato le specie ittiche di interesse nelle condizioni di riproduzione appropriate, identificare i pesci femminili che appaiono gravidi. In B.gauderio, la femmina avrà gonadi gonfi appena caudal allo sfiato.In B.brachyistius le femmine avranno pance gonfie e appariranno corpose. Dopo la somministrazione di anestesia, aggiungere l'agente di deposizione delle uova a quattro volte il volume di DPBS in un tubo PCR con miscelazione accurata. La soluzione diventerà nuvolosa.Utilizzare una pipetta per misurare la dose calcolata e erogare l'agente diluito a un pezzo di termoplastica prima di disegnare la soluzione in una siringa di vetro di precisione dotata di un ago smussato di lunghezza da 19 a 25 millilitri calibro. Iniettare la soluzione nel muscolo del tronco dorsale a una velocità regolare e lasciare riposare l'ago per due o quattro secondi prima della rimozione. Quindi, mettere immediatamente il pesce in acqua di sistema fresca per il recupero.Per la raccolta dello sperma B.gauderio, dopo 24 ore, selezionare un grande pesce maschio e il più rapidamente possibile dopo la sedazione, asciugare accuratamente il pesce, specialmente intorno alla testa e a Vent. Posizionare il lato ventrale del pesce essiccato verso l'alto, anteriore a sinistra in un apposito supporto, coperto da un tovagliolo di carta umido imbevuto di MS222 con la testa il più parallela possibile al tavolo. Applicare immediatamente la pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura immediatamente sopra le gonadi verso lo sfiato e utilizzando un micropipetter con una punta, raccogliere attentamente lo sperma mentre viene spremuto dal maschio in incrementi di 50 microliter.Aggiungere l'aliquota dello sperma direttamente sui volumi di 500 microliter di soluzione di estensione dello sperma sul ghiaccio. Subito dopo la raccolta, mettere il pesce nell'acqua del sistema fresco trattata con trattamento con melma. Per la raccolta delle uova B.gauderio, dopo aver asciugato un pesce femmina B.gauderio anestetizzato, posizionare immediatamente il pesce su un lato con la testa rivolta verso la mano non dominante e applicare pressione nella direzione caudale-rostrale con una leggera spremitura mediale sulle gonadi verso lo sfiato.Utilizzando uno strumento di politetrafluoroetilene, raccogliere attentamente le uova mentre vengono spremute dalla cloaca e posizionare rapidamente le uova in una piccola piastra di Petri coperta. Se lavori da solo dopo aver spremitura, tocca la massa dell'uovo alla base della piccola piastra di Petri mentre vengono espulsi dalla femmina. Immediatamente dopo aver raccolto le uova, mettere il pesce in acqua del sistema fresco trattata con melma.Per la fecondazione in vitro di B.gauderio, aggiungere 100 microlitri della soluzione SES dello sperma ben miscelata direttamente sulla massa dell'uovo, seguita da un millilitro di acqua dolce del sistema. Mescolare accuratamente le sospensioni dei gameti per 30-60 secondi prima di aggiungere alle cellule un ulteriore da uno a due millilitri di acqua di sistema filtrata con pori da 0,22 micrometri. Etichettare il piatto con il tempo di fecondazione in vitro e posizionare il piatto in un incubatore Celsius di 29 gradi, impostando un timer di 50 minuti per controllare l'avanzamento dello sviluppo.Durante il periodo di concimazione, utilizzare una punta della pipetta del microloader per scaricare due microlitri della soluzione di iniezione di interesse in un ago di microiniezione ed espellere il liquido il più vicino possibile alla punta. Quando una singola cellula si è formata sul palo animale di almeno una cella, trasferire il piatto al microscopio sezionante e utilizzare un paio di pini fini per rompere la punta dell'ago con un angolo smussato verso il punto in cui il cono dell'ago inizia a dimostrare rigidità. Il foro dell'ago deve rimanere il più piccolo possibile mantenendo una cono rigida.Identificare gli zigoti in via di sviluppo al microscopio e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata per posizionare da 10 a 20 uova nella massima acqua possibile sul bordo dello scivolo del microscopio di vetro incastonato nella parte superiore rovesciata della piastra di Petri. Utilizzando una delicata salvietta per le attività, premere delicatamente lo scivolo per rimuovere l'acqua in eccesso per consentire alle uova di aderire saldamente al bordo dello scivolo. L'acqua sarà malvagia sotto lo scivolo e tirerà le uova contro il bordo.Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere le uova umidi mantenendo poca umidità in piedi per evitare il movimento delle uova durante l'iniezione. Allineare le uova contro lo scivolo verticalmente, perpendicolare all'ago in avvicinamento, e utilizzare un micromanipolatore per posizionare l'ago contro il corore. Quindi, tenendo l'ago con un angolo di circa 45 gradi, inserire la punta prima nel corore e poi, nella singola cella, iniettando attraverso il tuorlo, se possibile.Rimuovere eventuali uova rotte durante l'iniezione con forcette fini. Quando tutte le uova sono state iniettate, utilizzare una bottiglia di squirt di acqua di sistema filtrata a poro di 0,22 micrometri per sciacquare delicatamente le uova dalla fase di iniezione in una nuova piastra di Petri di 100 millimetri di diametro. A seguito di una breve guida di successo RNA selezione e sintesi, la scissione in vitro può essere testata per la selezione per microiniezioni a singola cellula.Dopo la pulizia e la clonazione della PCR, in questo esperimento rappresentativo, le mutazioni indotte da CRISPR-Cas9 sono state identificate nei singoli cloni B.gauderio e B.brachyistius con una forte riduzione dell'ampiezza della scarica di organi elettrici, mentre i controlli non iniettati mostravano solo genotipi a cui si fa riferimento. La visualizzazione dell'ampiezza di scarica dell'organo elettrico tra mutanti CRISPR confermati e dimensioni dell'agente abbinate ai controlli non iniettati ha dimostrato che sia gli embrioni mutanti SCN-4 AA B.brachyistius che B.gauderio avevano ampiezze di scarica di organi elettrici significativamente inferiori rispetto ai controlli. Quando si eseguono le micro iniezioni, muoversi il più rapidamente e deliberatamente possibile per massimizzare il numero di embrioni iniettati a una cellula che sopravvivono.Non perdere tempo con uova difficili. Una volta identificati i mutanti di successo, i metodi di riproduzione tradizionali possono creare linee mutanti stabili, che eliminano le preoccupazioni di mosaicismo associate al CRSPR. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di condurre studi genomici comparativi con convalida funzionale in due specie conver delicatamente evolute di pesci debolmente elettrici.

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