Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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著者らは、モニカ・ルーカス、キャサリン・ショー、ライアン・テイラー、ジャレッド・トンプソン、ニコール・ロビショー、ホープ・ヒーリーの英雄的な努力を認め、魚の夫、データ収集、初期のプロトコル開発に協力してくれた。また、3人の審査員の原稿に対するご提案に感謝申し上げたいと思います。私たちは、彼らのコメントに対処した後、最終的な製品は、より良い品質であると信じています。この研究は、国立科学財団#1644965#1455405からJRGへの支援を受け、自然科学・工学研究協議会のVLSへの助成金を受けています。

ここに記載されているすべての方法は、ミシガン州立大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. sgRNAターゲットの選択
注:手順 1.1 で sgRNA を手動で設計するためのプロトコルが用意されています。これはscn4aaターゲット選択に利用された。EFISHGENOMICS Web ポータルを使用してこのプロセス (ステップ 1.2) を容...

弱い電気魚のフェノチピックな豊かさは、最近のゲノム資源の急増と共に、弱い電気魚モデルにおける機能的ゲノムツールの強い必要性を動機づけている。このシステムは実験室で容易に保たれる魚の並行系統の多数の形質形質の収束の進化のために特に魅力的である。
ここで説明するプロトコルは、電気発生と電気受信を並行して進化させた弱い電気魚の系統におけ?...

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。テレオスト魚の2つの系統、骨グロシ目とシルリフォーム、並行してエレクトロレセプションを進化させ、テレオスト(ジムノチフォルム、モルミリド、および系統アストロズコプス、マラプテルス、シノドンティス)の5つの系統並行して進化した電気発生。共通の遺伝的アーキテクチャを共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。
これはおそらく、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれるジムノチフォームとモルミリド、2種豊富なテレオストクレードの数多くの収束的な特徴によって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、通信する4を発見してから50年の間に、科学者のコミュニティは開発1、5の進化に関する大きな洞察を得ています。 ,6, システム及び回路 神経科学7,8,9,10, 細胞生理学11,12, 生態学とエネルギー13,14,15,16,17, 動作18,19, マクロエボリューション3,20,21.
最近では、電気魚1、22、23、24、25、26のゲノム、転写、およびプロテオミクス資源の増殖が起きており、 27、28.これらの資源の使用は、これらの種1、2、3、28、29における遺伝子型と表現型の関係に関する重要な洞察を既に生み出している 、30.弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的ゲノムツール31の現在の欠如である。
そのようなツールの1つは、最近開発されたクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロミックリピートとCas9エンドヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9、CRISPR)技術です。CRISPR/Cas9は、モデル32、33、34および非モデル生物35、36、37の両方で広く使用されているゲノム編集ツールである。CRISPR/Cas9技術は、基礎分子生物学が可能な実験室が、非クローニング法38を用いて低コストで、ショートガイドRNA(sgRNA)と呼ばれる遺伝子特異的プローブを容易に生成できるところまで進歩した。CRISPRは、モルフォリノス39、40、転写活性化剤様エフェクタヌクレアーゼ(TALENs)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFC)などの他のノックアウト/ノックダウン戦略よりも優れている。すべての標的遺伝子の生成に時間がかかります。
CRISPR/Cas9システムは、sgRNA配列によって指示されるゲノムの特定の領域を標的とし、二本鎖の破壊を引き起こすことによって遺伝子ノックアウトを作成するために機能する。二本鎖の破断は細胞によって検出され、非相同末端結合(NHEJ)経路を用いて優先的に内因性DNA修復機構を引き起こす。この経路は非常に誤差が起こりやすい:修復プロセス中に、DNA分子はしばしば二本鎖破壊部位に挿入または欠失(インデル)を組み込む。これらのインデルは、(1)オープンリーディングフレームのシフト、(2)早期停止コドンの挿入、または(3)遺伝子産物の重要な一次構造のシフトのいずれかによる機能の喪失をもたらす可能性がある。このプロトコルでは、CRISPR/Cas9編集を利用して、弱い電気魚種のNHEJを用いた標的遺伝子の標的点突然変異を標的とする。他の技術よりもシンプルで効率的であるが、この突然変異誘発の方法は、遺伝的モザイク41、42、43に起因するF0における一帯のフェチピックの重症度をもたらすことが期待される。,44.
生物の選択 弱い電気魚の比較ゲノムに関する将来の研究を促進するために、プロトコル開発のためのジムノチフォームとモルミリドの両方の代表的な種を選択する必要がありました。ウルグアイのモンテビデオで開催された2016年の電気魚会議での議論の後、すでに実験室で飼育でき、ゲノム資源を利用できる種を利用するコミュニティコンセンサスがありました。ジムノチフォルム・ブラキポポムス・ガウデリオとモルミリド・ブリエンミロス・ブラキシシウスは、これらの基準に適合する種として選ばれた。両方の種で、繁殖状態を誘導し、維持するための自然の手掛かりは、捕虜を模倣することが容易です。B.ガウデリオは、南米のジムノチフォーム種であり、低い夫の要件の利点を有する:魚は比較的小さな(4 L)タンクで比較的高密度に保つことができる。B.ガウデリオはまた、捕虜の条件下で速い世代のターンオーバーを持っています.実験室の条件下では、B.ガウデリオは約4ヶ月で卵から成人に発達する可能性があります。
西中央アフリカのモルミリド魚の一種であるB.ブラキシシウスは、捕虜の中で容易に繁殖する。B.ブラキシウスは、水族館の貿易を通じて容易に入手可能であり、多くの研究で広く使用されており、現在、利用可能なゲノム資源の数を持っています。彼らのライフサイクルは、実験室の条件に応じて、1-3年に及びます。夫の要件は、繁殖中の攻撃性のために適度なサイズのタンク(50-100 L)を必要とし、この種のためにやや集中的です。
他の種の電気魚を研究する実験室は、種が繁殖できる限りこのプロトコルを容易に適応させることができるはずであり、単一細胞胚を収集し、成人期に飼育することができる。住宅、幼虫の夫、および体外受精(IVF)率は、他の種と変わる可能性があります。しかし、このプロトコルは、他の弱い電気魚の繁殖の試みの出発点として使用することができます。
概念実証のための理想的な遺伝子標的:scn4aa 弱い電気モルミリドとジムノチフォーム魚は、電気器官と呼ばれる特殊な臓器を排出することによって電界(電解)を発生させる。電気器官放電(EOD)は、エレクトロサイトと呼ばれる電気器官細胞における作用電位の同時産生から生じる。EIDは、魚の周囲の高解像度の電気画像を作成するために皮膚内の電気受容体の配列によって検出される45。弱い電気魚はまた、彼らのコンコンフェリングのEOD波形18だけでなく、その排出速度46の特徴を検出することができ、EODは鳥の歌やカエルに類似した社会的コミュニケーション信号としてさらに機能することができます発声47.
モルミリドとジムノチフォームの両方の電気細胞における作用電位発生の主な構成要素は、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.42である。非電気テレオストは、2つのパラロゴス遺伝子コピーを発現し、scn4aaおよびscn4abは、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.430に対するコーディングを行う。ジムノチフォームとモルミリドの両方の弱い電気魚系統において、scn4aaは急速に進化し、その運動特性に影響を与える多数のアミノ酸置換を受けている48.最も重要なことは、scn4aaは電気器官2、3への両方の系統で区画化されている。電気器官に対するscn4aaの比較的制限された発現と、EOFの生成における重要な役割は、有害な多発性効果を最小限に抑えるため、CRISPR/Cas9ノックアウト実験の理想的なターゲットとなります。弱い電気魚は幼虫電気器官を6-8日後に放出し始めるので、scn4aaのターゲティングは胚マイクロインジェクション後の迅速なフェノタイピングに理想的に適しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。共通の遺伝的構造を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。これはおそらく、ジムノチフォームとモルミリドの数多くの収束的な特徴、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれる2種豊富なテレオストクレードによって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、コミュニケーションをとっているという発見から50年の間に、科学者のコミュニティは、開発、システム、回路神経科学の進化に関する大きな洞察を得てきました。細胞生理学、生態学、進化生物学、行動最近では、電気魚のゲノム資源が急増しています。これらの資源の使用は、これらの種における遺伝子型と表現型との関連に関する重要な洞察を既に促進している。弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的なゲノムツールの欠けている現在の欠如である。ここでは、弱い電気魚の内因性DNA修復機構を利用したCRISPR/Cas9突然変異誘発を行うための完全なプロトコルを報告する。我々は、このプロトコルが、CRISPR/Cas9を使用して、最初のエキソンにおけるインデルと点突然変異を標的とすることにより、モルミリ種ブリジノミルス・ブラキシシステウスとジムノチフォーム・ブラキポポムス・ガウデリオの両方で等しく有効であることを実証する。ナトリウムチャネル遺伝子scn4aa.このプロトコルを用いて、両方の種から胚を得て、ナトリウムチャネルscn4aaの最初のエキソンに予測された突然変異が存在することを確認するために遺伝子型化された。ノックアウト成功表現型は、未注入のサイズ一致制御と比較した場合、電気器官放電振幅の低下を示す記録で確認された。

sgRNA標的部位は、セクション1に記載されているように、B.ガウデリオおよびB.ブラキシシウスの両方でscn4aaのエキソン1内で同定された。sgRNAはセクション2の説明に従って生成されました。sgRNAの選択と合成に成功した後(図1)、インビトロ切断を試験した(図2)。その後、インビトロ切断を実証するsgRNAを単一細胞マイクロインジェ?...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノムノックアウト電気魚を製造し、後部するためのプロトコルが提示される。詳細に概説するのは、ジムノチフォームとモルミリドの両方に必要な分子生物学、繁殖、および夫の要件、およびCas9誘発インデルF0幼虫を産生するための注射技術である。

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9遺伝子は、特に比較的に、弱い電気魚の遺伝子編集を可能にし、特定の遺伝子および遺伝的差異が表皮変動にどのように寄与するかについての仮説をテストすることを可能にする。CRISPR/Cas9は、変異型F-ゼロ胚を生成するための効率的な方法です。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚のCRISPR-Cas9操作を行うことを可能にする。他の電気魚や他の魚種のいくつかの変更でこのアプローチを使用する鍵は、sgRNAを作るためにトランスクリプトームまたはゲノムリソースの可用性です。マイクロインジェクションを実行し、2D 平面内の 3D 位置にあるセルを視覚化するのは困難な場合があります。卵のための小さなゼブラフィッシュコロニーを取得し、一般的なマイクロインジェクション技術を実践します。サヴァス・コンスタンティノウとの手順を実証することは、私の研究室の技術者であるジャレッド・トンプソンです。適切な繁殖条件下で関心のある魚種を収容した後、グラビドに見える雌の魚を特定します。B.gauderioでは、女性は通気孔にちょうど尾を行く腫れた生殖腺を持つことになります。B.強発症の女性は腹が腫れ、深い体に見えます。麻酔投与後、十分な混合を伴うPCRチューブ中のDPBSの4倍の体積に産卵剤を添加する。ソリューションは曇りになります。ピペットを使用して計算された線量を測定し、希釈剤を熱可塑性樹脂の一部に分配してから、溶液を28ゲージ19〜25ミリリットルのベベリング針を装備した精密ガラス注射器に引き込みます。滑らかな速度で後尻の体幹の筋肉に溶液を注入し、針は除去する前に2〜4秒間座らせます。その後、すぐに回復のために新鮮なシステムの水に魚を置きます。B.gauderio精子コレクションの場合、24時間後、大きな雄の魚を選択し、セデーション後できるだけ早く、特に頭とベントの周りに魚を徹底的に乾燥させます。乾燥した魚の腹側を上に置き、適切なホルダーの左に前部、可能な限りテーブルと平行に頭でMS222浸した湿ったペーパータオルで覆う。すぐに口内に向かって生殖腺の上に光を絞り、先端を備えたマイクロピペッタを使用して、尾道方向に尾道方向に圧力をかけ、50マイクロリットル単位で男性から絞られる精子を慎重に収集する。氷上の精子エクステンダー溶液の500マイクロリットルの量に直接精子のアリコートを追加します。収集直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。B.gauderioの卵のコレクションの場合、麻酔付きのB.gauderio雌の魚を乾燥させた後、すぐに頭を非支配的な手に向けて横に置き、通気孔に向かってゴナドの上に軽く圧迫する内側の内側に雄大な方向に圧力をかける。ポリテトラフルオロエチレンツールを使用して、クロアカから絞った卵を慎重に収集し、すぐに小さな覆われたペトリ皿に卵を入れます。絞った後に一人で作業する場合は、卵塊を小さなペトリ皿の基部に触れ、メスから追放します。卵を採取した直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。B.gauderio in vitro受精の場合は、卵質量の上に直接よく混合された精子SES溶液の100マイクロリットルを加え、続いて1ミリリットルの淡水を加えます。0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水を細胞に加える前に、30〜60秒間十分にアテとの懸濁液を混ぜます。体外受精時間で皿にラベルを付け、皿を摂氏29度のインキュベーターに入れ、開発の進捗状況を確認するために50分のタイマーを設定します。受精期間中、マイクロローダーピペットチップを使用して、目的の注射液の2マイクロリットルをマイクロインジェクションニードルにバックロードし、できるだけ先端に近い液体を排出します。少なくとも1つの細胞の動物の棒で単一の細胞が形成された場合、解剖顕微鏡の下で皿を移し、針のテーパーが剛性を示し始めるところに向かって斜めの角度で針の先端を壊すために細かい鉗子のペアを使用する。針のボアは、硬いテーパーを維持しながら、できるだけ小さくする必要があります。顕微鏡下で現像する接合体を特定し、切りチップ付きのプラスチックトランスファーピペットを使用して、ペトリ皿の反転した上部に設定されたガラス顕微鏡スライドの端にできるだけ少ない水に10〜20個の卵を入れます。繊細な作業拭き取りを使用して、スライドを軽く押して余分な水を取り除き、卵がスライドの端にしっかりと付着できるようにします。水はスライドの下で邪悪になり、エッジに対して卵を引っ張ります。注入中の卵の動きを避けるために、少し立っている水分を維持しながら、卵を湿らせた保つためにちょうど十分な水があるはずです。卵をスライドに垂直に、接近針に垂直に合わせ、マイクロマニピュレーターを使用して針をチョリオンに対して配置します。次に、針を約45度の角度で保持し、最初に先端をコリヨンに挿入し、次に単一の細胞に挿入し、可能であれば黄身を通して注入する。注射中に細かい鉗子で壊れた卵を取り除きます。すべての卵が注入されたら、0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水の噴出ボトルを使用して、注入段階から新しい100ミリメートル直径のペトリ皿に卵を静かに洗い流します。成功した短いガイドRNA選択および合成に続いて、インビトロ切断は単一細胞のマイクロインジェクションのための選択のためにテストすることができる。PCRのクリーンアップとクローニングの後、この代表的な実験では、CRISPR-Cas9誘発突然変異が強力な電気臓器排出振幅低下を有する個々のB.gauderioおよびB.b.brachyistiusクローンで同定されたのに対し、未注入制御は参照された遺伝子型のみを示した。確認されたCRISPR変異体と薬剤サイズが未注入コントロールと一致する電気臓器排出振幅の可視化は、SCN-4 AA変異体B.brachyistusおよびB.gauderio胚の両方が制御よりも有意に低い電気臓器排出振幅を有することを実証した。マイクロ注射を行う場合は、できるだけ迅速かつ意図的に移動して、生存する単細胞注入胚の数を最大化します。難しい卵で時間を無駄にしないでください。成功した突然変異体が同定されると、従来の繁殖方法は安定した突然変異線を作り出し、CRSPR関連のモザイク化の懸念を排除することができる。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚の機能検証と比較ゲノム研究を行うことを可能にする。

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

生物学

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...