Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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著者らは、モニカ・ルーカス、キャサリン・ショー、ライアン・テイラー、ジャレッド・トンプソン、ニコール・ロビショー、ホープ・ヒーリーの英雄的な努力を認め、魚の夫、データ収集、初期のプロトコル開発に協力してくれた。また、3人の審査員の原稿に対するご提案に感謝申し上げたいと思います。私たちは、彼らのコメントに対処した後、最終的な製品は、より良い品質であると信じています。この研究は、国立科学財団#1644965#1455405からJRGへの支援を受け、自然科学・工学研究協議会のVLSへの助成金を受けています。

ここに記載されているすべての方法は、ミシガン州立大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. sgRNAターゲットの選択
注:手順 1.1 で sgRNA を手動で設計するためのプロトコルが用意されています。これはscn4aaターゲット選択に利用された。EFISHGENOMICS Web ポータルを使用してこのプロセス (ステップ 1.2) を容...

弱い電気魚のフェノチピックな豊かさは、最近のゲノム資源の急増と共に、弱い電気魚モデルにおける機能的ゲノムツールの強い必要性を動機づけている。このシステムは実験室で容易に保たれる魚の並行系統の多数の形質形質の収束の進化のために特に魅力的である。
ここで説明するプロトコルは、電気発生と電気受信を並行して進化させた弱い電気魚の系統におけ?...

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。テレオスト魚の2つの系統、骨グロシ目とシルリフォーム、並行してエレクトロレセプションを進化させ、テレオスト(ジムノチフォルム、モルミリド、および系統アストロズコプス、マラプテルス、シノドンティス)の5つの系統並行して進化した電気発生。共通の遺伝的アーキテクチャを共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。
これはおそらく、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれるジムノチフォームとモルミリド、2種豊富なテレオストクレードの数多くの収束的な特徴によって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、通信する4を発見してから50年の間に、科学者のコミュニティは開発1、5の進化に関する大きな洞察を得ています。 ,6, システム及び回路 神経科学7,8,9,10, 細胞生理学11,12, 生態学とエネルギー13,14,15,16,17, 動作18,19, マクロエボリューション3,20,21.
最近では、電気魚1、22、23、24、25、26のゲノム、転写、およびプロテオミクス資源の増殖が起きており、 27、28.これらの資源の使用は、これらの種1、2、3、28、29における遺伝子型と表現型の関係に関する重要な洞察を既に生み出している 、30.弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的ゲノムツール31の現在の欠如である。
そのようなツールの1つは、最近開発されたクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロミックリピートとCas9エンドヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9、CRISPR)技術です。CRISPR/Cas9は、モデル32、33、34および非モデル生物35、36、37の両方で広く使用されているゲノム編集ツールである。CRISPR/Cas9技術は、基礎分子生物学が可能な実験室が、非クローニング法38を用いて低コストで、ショートガイドRNA(sgRNA)と呼ばれる遺伝子特異的プローブを容易に生成できるところまで進歩した。CRISPRは、モルフォリノス39、40、転写活性化剤様エフェクタヌクレアーゼ(TALENs)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFC)などの他のノックアウト/ノックダウン戦略よりも優れている。すべての標的遺伝子の生成に時間がかかります。
CRISPR/Cas9システムは、sgRNA配列によって指示されるゲノムの特定の領域を標的とし、二本鎖の破壊を引き起こすことによって遺伝子ノックアウトを作成するために機能する。二本鎖の破断は細胞によって検出され、非相同末端結合(NHEJ)経路を用いて優先的に内因性DNA修復機構を引き起こす。この経路は非常に誤差が起こりやすい:修復プロセス中に、DNA分子はしばしば二本鎖破壊部位に挿入または欠失(インデル)を組み込む。これらのインデルは、(1)オープンリーディングフレームのシフト、(2)早期停止コドンの挿入、または(3)遺伝子産物の重要な一次構造のシフトのいずれかによる機能の喪失をもたらす可能性がある。このプロトコルでは、CRISPR/Cas9編集を利用して、弱い電気魚種のNHEJを用いた標的遺伝子の標的点突然変異を標的とする。他の技術よりもシンプルで効率的であるが、この突然変異誘発の方法は、遺伝的モザイク41、42、43に起因するF0における一帯のフェチピックの重症度をもたらすことが期待される。,44.
生物の選択 弱い電気魚の比較ゲノムに関する将来の研究を促進するために、プロトコル開発のためのジムノチフォームとモルミリドの両方の代表的な種を選択する必要がありました。ウルグアイのモンテビデオで開催された2016年の電気魚会議での議論の後、すでに実験室で飼育でき、ゲノム資源を利用できる種を利用するコミュニティコンセンサスがありました。ジムノチフォルム・ブラキポポムス・ガウデリオとモルミリド・ブリエンミロス・ブラキシシウスは、これらの基準に適合する種として選ばれた。両方の種で、繁殖状態を誘導し、維持するための自然の手掛かりは、捕虜を模倣することが容易です。B.ガウデリオは、南米のジムノチフォーム種であり、低い夫の要件の利点を有する:魚は比較的小さな(4 L)タンクで比較的高密度に保つことができる。B.ガウデリオはまた、捕虜の条件下で速い世代のターンオーバーを持っています.実験室の条件下では、B.ガウデリオは約4ヶ月で卵から成人に発達する可能性があります。
西中央アフリカのモルミリド魚の一種であるB.ブラキシシウスは、捕虜の中で容易に繁殖する。B.ブラキシウスは、水族館の貿易を通じて容易に入手可能であり、多くの研究で広く使用されており、現在、利用可能なゲノム資源の数を持っています。彼らのライフサイクルは、実験室の条件に応じて、1-3年に及びます。夫の要件は、繁殖中の攻撃性のために適度なサイズのタンク(50-100 L)を必要とし、この種のためにやや集中的です。
他の種の電気魚を研究する実験室は、種が繁殖できる限りこのプロトコルを容易に適応させることができるはずであり、単一細胞胚を収集し、成人期に飼育することができる。住宅、幼虫の夫、および体外受精(IVF)率は、他の種と変わる可能性があります。しかし、このプロトコルは、他の弱い電気魚の繁殖の試みの出発点として使用することができます。
概念実証のための理想的な遺伝子標的:scn4aa 弱い電気モルミリドとジムノチフォーム魚は、電気器官と呼ばれる特殊な臓器を排出することによって電界(電解)を発生させる。電気器官放電(EOD)は、エレクトロサイトと呼ばれる電気器官細胞における作用電位の同時産生から生じる。EIDは、魚の周囲の高解像度の電気画像を作成するために皮膚内の電気受容体の配列によって検出される45。弱い電気魚はまた、彼らのコンコンフェリングのEOD波形18だけでなく、その排出速度46の特徴を検出することができ、EODは鳥の歌やカエルに類似した社会的コミュニケーション信号としてさらに機能することができます発声47.
モルミリドとジムノチフォームの両方の電気細胞における作用電位発生の主な構成要素は、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.42である。非電気テレオストは、2つのパラロゴス遺伝子コピーを発現し、scn4aaおよびscn4abは、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.430に対するコーディングを行う。ジムノチフォームとモルミリドの両方の弱い電気魚系統において、scn4aaは急速に進化し、その運動特性に影響を与える多数のアミノ酸置換を受けている48.最も重要なことは、scn4aaは電気器官2、3への両方の系統で区画化されている。電気器官に対するscn4aaの比較的制限された発現と、EOFの生成における重要な役割は、有害な多発性効果を最小限に抑えるため、CRISPR/Cas9ノックアウト実験の理想的なターゲットとなります。弱い電気魚は幼虫電気器官を6-8日後に放出し始めるので、scn4aaのターゲティングは胚マイクロインジェクション後の迅速なフェノタイピングに理想的に適しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。共通の遺伝的構造を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。これはおそらく、ジムノチフォームとモルミリドの数多くの収束的な特徴、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれる2種豊富なテレオストクレードによって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、コミュニケーションをとっているという発見から50年の間に、科学者のコミュニティは、開発、システム、回路神経科学の進化に関する大きな洞察を得てきました。細胞生理学、生態学、進化生物学、行動最近では、電気魚のゲノム資源が急増しています。これらの資源の使用は、これらの種における遺伝子型と表現型との関連に関する重要な洞察を既に促進している。弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的なゲノムツールの欠けている現在の欠如である。ここでは、弱い電気魚の内因性DNA修復機構を利用したCRISPR/Cas9突然変異誘発を行うための完全なプロトコルを報告する。我々は、このプロトコルが、CRISPR/Cas9を使用して、最初のエキソンにおけるインデルと点突然変異を標的とすることにより、モルミリ種ブリジノミルス・ブラキシシステウスとジムノチフォーム・ブラキポポムス・ガウデリオの両方で等しく有効であることを実証する。ナトリウムチャネル遺伝子scn4aa.このプロトコルを用いて、両方の種から胚を得て、ナトリウムチャネルscn4aaの最初のエキソンに予測された突然変異が存在することを確認するために遺伝子型化された。ノックアウト成功表現型は、未注入のサイズ一致制御と比較した場合、電気器官放電振幅の低下を示す記録で確認された。

sgRNA標的部位は、セクション1に記載されているように、B.ガウデリオおよびB.ブラキシシウスの両方でscn4aaのエキソン1内で同定された。sgRNAはセクション2の説明に従って生成されました。sgRNAの選択と合成に成功した後(図1)、インビトロ切断を試験した(図2)。その後、インビトロ切断を実証するsgRNAを単一細胞マイクロインジェ?...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノムノックアウト電気魚を製造し、後部するためのプロトコルが提示される。詳細に概説するのは、ジムノチフォームとモルミリドの両方に必要な分子生物学、繁殖、および夫の要件、およびCas9誘発インデルF0幼虫を産生するための注射技術である。

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9遺伝子は、特に比較的に、弱い電気魚の遺伝子編集を可能にし、特定の遺伝子および遺伝的差異が表皮変動にどのように寄与するかについての仮説をテストすることを可能にする。CRISPR/Cas9は、変異型F-ゼロ胚を生成するための効率的な方法です。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚のCRISPR-Cas9操作を行うことを可能にする。他の電気魚や他の魚種のいくつかの変更でこのアプローチを使用する鍵は、sgRNAを作るためにトランスクリプトームまたはゲノムリソースの可用性です。マイクロインジェクションを実行し、2D 平面内の 3D 位置にあるセルを視覚化するのは困難な場合があります。卵のための小さなゼブラフィッシュコロニーを取得し、一般的なマイクロインジェクション技術を実践します。サヴァス・コンスタンティノウとの手順を実証することは、私の研究室の技術者であるジャレッド・トンプソンです。適切な繁殖条件下で関心のある魚種を収容した後、グラビドに見える雌の魚を特定します。B.gauderioでは、女性は通気孔にちょうど尾を行く腫れた生殖腺を持つことになります。B.強発症の女性は腹が腫れ、深い体に見えます。麻酔投与後、十分な混合を伴うPCRチューブ中のDPBSの4倍の体積に産卵剤を添加する。ソリューションは曇りになります。ピペットを使用して計算された線量を測定し、希釈剤を熱可塑性樹脂の一部に分配してから、溶液を28ゲージ19〜25ミリリットルのベベリング針を装備した精密ガラス注射器に引き込みます。滑らかな速度で後尻の体幹の筋肉に溶液を注入し、針は除去する前に2〜4秒間座らせます。その後、すぐに回復のために新鮮なシステムの水に魚を置きます。B.gauderio精子コレクションの場合、24時間後、大きな雄の魚を選択し、セデーション後できるだけ早く、特に頭とベントの周りに魚を徹底的に乾燥させます。乾燥した魚の腹側を上に置き、適切なホルダーの左に前部、可能な限りテーブルと平行に頭でMS222浸した湿ったペーパータオルで覆う。すぐに口内に向かって生殖腺の上に光を絞り、先端を備えたマイクロピペッタを使用して、尾道方向に尾道方向に圧力をかけ、50マイクロリットル単位で男性から絞られる精子を慎重に収集する。氷上の精子エクステンダー溶液の500マイクロリットルの量に直接精子のアリコートを追加します。収集直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。B.gauderioの卵のコレクションの場合、麻酔付きのB.gauderio雌の魚を乾燥させた後、すぐに頭を非支配的な手に向けて横に置き、通気孔に向かってゴナドの上に軽く圧迫する内側の内側に雄大な方向に圧力をかける。ポリテトラフルオロエチレンツールを使用して、クロアカから絞った卵を慎重に収集し、すぐに小さな覆われたペトリ皿に卵を入れます。絞った後に一人で作業する場合は、卵塊を小さなペトリ皿の基部に触れ、メスから追放します。卵を採取した直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。B.gauderio in vitro受精の場合は、卵質量の上に直接よく混合された精子SES溶液の100マイクロリットルを加え、続いて1ミリリットルの淡水を加えます。0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水を細胞に加える前に、30〜60秒間十分にアテとの懸濁液を混ぜます。体外受精時間で皿にラベルを付け、皿を摂氏29度のインキュベーターに入れ、開発の進捗状況を確認するために50分のタイマーを設定します。受精期間中、マイクロローダーピペットチップを使用して、目的の注射液の2マイクロリットルをマイクロインジェクションニードルにバックロードし、できるだけ先端に近い液体を排出します。少なくとも1つの細胞の動物の棒で単一の細胞が形成された場合、解剖顕微鏡の下で皿を移し、針のテーパーが剛性を示し始めるところに向かって斜めの角度で針の先端を壊すために細かい鉗子のペアを使用する。針のボアは、硬いテーパーを維持しながら、できるだけ小さくする必要があります。顕微鏡下で現像する接合体を特定し、切りチップ付きのプラスチックトランスファーピペットを使用して、ペトリ皿の反転した上部に設定されたガラス顕微鏡スライドの端にできるだけ少ない水に10〜20個の卵を入れます。繊細な作業拭き取りを使用して、スライドを軽く押して余分な水を取り除き、卵がスライドの端にしっかりと付着できるようにします。水はスライドの下で邪悪になり、エッジに対して卵を引っ張ります。注入中の卵の動きを避けるために、少し立っている水分を維持しながら、卵を湿らせた保つためにちょうど十分な水があるはずです。卵をスライドに垂直に、接近針に垂直に合わせ、マイクロマニピュレーターを使用して針をチョリオンに対して配置します。次に、針を約45度の角度で保持し、最初に先端をコリヨンに挿入し、次に単一の細胞に挿入し、可能であれば黄身を通して注入する。注射中に細かい鉗子で壊れた卵を取り除きます。すべての卵が注入されたら、0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水の噴出ボトルを使用して、注入段階から新しい100ミリメートル直径のペトリ皿に卵を静かに洗い流します。成功した短いガイドRNA選択および合成に続いて、インビトロ切断は単一細胞のマイクロインジェクションのための選択のためにテストすることができる。PCRのクリーンアップとクローニングの後、この代表的な実験では、CRISPR-Cas9誘発突然変異が強力な電気臓器排出振幅低下を有する個々のB.gauderioおよびB.b.brachyistiusクローンで同定されたのに対し、未注入制御は参照された遺伝子型のみを示した。確認されたCRISPR変異体と薬剤サイズが未注入コントロールと一致する電気臓器排出振幅の可視化は、SCN-4 AA変異体B.brachyistusおよびB.gauderio胚の両方が制御よりも有意に低い電気臓器排出振幅を有することを実証した。マイクロ注射を行う場合は、できるだけ迅速かつ意図的に移動して、生存する単細胞注入胚の数を最大化します。難しい卵で時間を無駄にしないでください。成功した突然変異体が同定されると、従来の繁殖方法は安定した突然変異線を作り出し、CRSPR関連のモザイク化の懸念を排除することができる。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚の機能検証と比較ゲノム研究を行うことを可能にする。

Research

JoVE Journal

Biology

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