Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Forfatterne erkjenner den heroiske innsatsen til Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, og Hope Healey for hjelp med fiskeoppdrett, datainnsamling, og tidlig protokoll utvikling. Vi vil også gjerne takke de tre anmeldere for deres forslag til manuskriptet. Vi tror det endelige produktet til å være av bedre kvalitet etter adressering sine kommentarer. Dette arbeidet ble finansiert av støtte fra National Science Foundation #1644965 og #1455405 til JRG, og naturvitenskap og engineering Research Council DG stipend til VLS.

Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Michigan begrunne universitet.
1. velge sgRNA mål
Merk: En protokoll er gitt for manuell utforming av sgRNAs i trinn 1,1. Dette ble benyttet for scn4aa Target valg. En ekstra protokoll er gitt for å forenkle denne prosessen (trinn 1,2) ved hjelp av EFISHGENOMICS webportal. Det anbefales at brukerne velger protokollen 1,2, som har ...

Den fenotypiske rikdommen av svakt elektrisk fisk, sammen med en fersk spredning av Genomics ressurser, motiverer et sterkt behov for funksjonelle genomisk verktøy i svakt elektrisk fisk modell. Dette systemet er spesielt attraktivt på grunn av den konvergent utviklingen av mange fenotypiske trekk i parallelle linjene av fisk, som er lett oppbevares i laboratoriet.
Protokollen som beskrives her demonstrerer effekten av CRISPR/Cas9 teknikk i linjene av svakt elektrisk fisk som utviklet seg el...

Electroreception og electrogenesis har endret seg i evolusjons historien til virveldyr. To linjene av tetramerisk fisk, visninger og Maller, utviklet electroreception parallelt, og fem linjene av teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, og slekter Astroscopus, Malapterurus og Synodontis) utviklet seg electrogenesis parallelt. Det er en slående grad av konvergens i disse uavhengig avledet fenotyper, som deler en felles genetisk arkitektur1,2,3.
Dette er kanskje best illustrert av de mange konvergent funksjonene i gymnotiforms og mormyrids, to arter-rik tetramerisk klader, som produserer og oppdager svake elektriske felt og kalles svakt elektrisk fisk. I 50 år siden oppdagelsen at svakt elektrisk fisk bruker elektrisitet til å fornemme sine omgivelser og kommunisere4, et voksende fellesskap av forskere har fått enorm innsikt i utviklingen av utviklingen1,5 ,6, systemer og kretser nevrovitenskap7,8,9,10, cellular fysiologi11,12, økologi og energi13 ,14,15,16,17, atferd18,19, og makroevolusjon3,20,21 .
Mer nylig har det vært en spredning av genomisk, transcriptomic, og Proteomikk ressurser for elektrisk fisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Bruk av disse ressursene har allerede produsert viktig innsikt om sammenhengen mellom genotype og fenotype i disse artene1,2,3,28,29 ,30. Et stort hinder for å integrere Genomics data med fenotypiske data av svakt elektrisk fisk er en gave mangel på funksjonelle Genomics verktøy31.
Et slikt verktøy er den nylig utviklet gruppert regelmessig oppdelt Short Palindromic gjentar sammenkoblet med Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) teknikk. CRISPR/Cas9 er en Genova redigere bort verktøyet det har inngikk utstrakt bruk inne begge to modell32,33,34 og ingen-modell organisere35,36,37 ens. CRISPR/Cas9 teknologi har kommet til et punkt der et laboratorium i stand til grunnleggende molekylærbiologi kan lett generere gen-spesifikke sonder kalt kort guide RNAs (sgRNAs), til en lav kostnad ved hjelp av en ikke-kloning metode38. CRISPR har fordeler fremfor andre knockout/knockdown strategier, slik som morpholinos39,40, transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs), og sink finger nukleaser (zfner), som er kostbare og tidkrevende å generere for hvert mål genet.
Den CRISPR/Cas9 System funksjoner for å skape genet Knockouts ved å målrette en bestemt region av Genova, regissert av sgRNA sekvensen, og forårsaker en dobbel-strandet pause. Den doble strandet pause oppdages av cellen og utløser endogene DNA reparasjon mekanismer fortrinnsvis bruker ikke-homologe slutten sammenføyning (NHEJ) veien. Denne veien er svært feil utsatt: under reparasjonsprosessen, DNA-molekylet vil ofte innlemme innsettinger eller slettinger (indeler) på dobbel-strandet pause området. Disse indeler kan føre til tap av funksjon på grunn av enten (1) Skift i den åpne lese RAM men, (2) innsetting av en for tidlig stopp-Codon, eller (3) endringer i den kritiske primære strukturen av genet produktet. I denne protokollen, bruker vi CRISPR/Cas9 redigering til målet punkt mutasjoner i målet gener ved hjelp av NHEJ i svakt elektriske fiskearter. Mens enklere og mer effektiv enn andre teknikker, er denne metoden for mutagenese forventes å resultere i en rekke fenotypiske alvorlighetsgradene i F0, som er tilskrevet genetisk mosaikk41,42,43 ,44.
Utvalg av organismer For å tilrettelegge fremtidige studier på komparativ Genomics av svakt elektrisk fisk, en representativ arter for både gymnotiforms og mormyrids for protokoll utvikling nødvendig for å bli valgt. Etter diskusjoner i løpet av 2016 Electric Fish møte i Montevideo, Uruguay, det var samfunnet konsensus for å utnytte arter som allerede kan bli avlet i laboratoriet og som hadde genomisk ressurser tilgjengelig. Den gymnotiform Brachyhypopomus gauderio og mormyrid Brienomyrus brachyistius ble valgt som arter som passer disse kriteriene. I begge artene er naturlige indikatorer for å indusere og opprettholde avl forhold lett å etterligne i fangenskap. B. gauderio, en gymnotiform Art fra Sør-Amerika, har fordelen av krav til lav husdyrhold: fisk kan oppbevares ved relativt høy tetthet i relativt små (4 L) tanker. B. gauderio har også rask generasjonsskifte omsetning under forhold med fange. Under laboratorieforhold, kan B. gauderio utvikle seg fra egg til voksen i ca 4 måneder.
B. brachyistius, en art av mormyrid fisk fra Vest-Sentral-Afrika, raser lett i fangenskap. B. brachyistius er lett tilgjengelig gjennom akvariet handelen, har vært mye brukt i mange studier, og har nå en rekke genomisk ressurser tilgjengelig. Deres livssyklus spenner over 1 − 3 år, avhengig av laboratorieforhold. Kravene til reindrift er noe mer intensive for denne arten, som krever moderat store tanker (50 − 100 L) på grunn av aggresjon under avl.
Laboratorier som studerer andre arter av elektrisk fisk skal kunne enkelt tilpasse denne protokollen så lenge arten kan være avlet, og enkelt celle embryo kan samles og oppvokst i voksen alder. Boliger, larvestadiet husdyrhold, og in vitro befruktning (IVF) priser vil trolig endres med andre arter; Imidlertid kan denne protokollen brukes som et utgangspunkt for avl forsøk i andre svakt elektrisk fisk.
En ideal Gene mål for Proof av begrep: scn4aa Svakt elektrisk mormyrid og gymnotiform fisk genererer elektriske felt (electrogenesis) ved å tømme en spesialisert organ, kalt elektrisk organ. Elektriske orgel utslipp (EODs) er et resultat av samtidig produksjon av handlings potensialer i de elektriske organ cellene som kalles electrocytes. EODs oppdages av en rekke elektroreseptorer i huden for å lage høyoppløselige elektriske bilder av Fiskene omgivelser45. Svakt elektrisk fisk er også i stand til å oppdage funksjoner i deres conspecifics ' EOD bølgeformer18 så vel som deres utslipp priser46, slik at EODs å fungere i tillegg som en sosial kommunikasjon signal analoge til fuglesang eller frosk vocalizations47.
En hovedkomponent i aksjon potensiell generasjon i electrocytes av både mormyrid og gymnotiform svakt elektrisk fisk er spenning-gated natrium kanal NaV 1.42. Ikke-elektriske teleosts uttrykker to paralogous gen kopier, scn4aa og scn4ab, koding for spennings-gated natrium kanal NAV 1.430. I både gymnotiform og mormyrid svakt elektrisk fisk linjene, scn4aa har utviklet seg raskt og gjennomgått mange aminosyre erstatninger som påvirker dens kinetisk egenskaper48. Viktigst, scn4aa har blitt compartmentalized i begge linjene til elektrisk organ2,3. Den relativt begrensede uttrykk for scn4aa til elektrisk organ, så vel som sin nøkkelrolle i generasjonen av EODs, gjør det til et ideelt mål for CRISPR/Cas9 knockout eksperimenter, som det har minimal skadelige pleiotropic effekter. Fordi svakt elektrisk fisk begynner å tømme sine larvestadiet elektriske organer 6 − 8 dager etter befruktning (DPF), er målretting av scn4aa ideell for rask bestemmelse av fenotype etter embryo microinjection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

Electroreception og electrogenesis har endret seg i evolusjons historien til virveldyr. Det er en slående grad av konvergens i disse uavhengig avledet fenotyper, som deler en felles genetisk arkitektur. Dette er kanskje best illustrert av de mange konvergent funksjonene i gymnotiforms og mormyrids, to arter-rik tetramerisk klader som produserer og oppdager svake elektriske felt og kalles svakt elektrisk fisk. I 50 år siden oppdagelsen at svakt elektrisk fisk bruker elektrisitet til å fornemme sine omgivelser og kommunisere, et voksende fellesskap av forskere har fått enorm innsikt i utviklingen av utvikling, systemer og kretser nevrovitenskap, cellulære fysiologi, økologi, evolusjonære biologi og atferd. Flere nylig har det vært en spredning av genomisk ressurser for elektrisk fisk. Bruk av disse ressursene har allerede tilrettelagt viktig innsikt med hensyn til sammenhengen mellom genotype og fenotype i disse artene. Et stort hinder for å integrere Genomics data med fenotypiske data av svakt elektrisk fisk er en gave mangel på funksjonelle Genomics verktøy. Vi rapporterer her en full protokoll for å utføre CRISPR/Cas9 mutagenese som utnytter endogene DNA reparasjon mekanismer i svakt elektrisk fisk. Vi viser at denne protokollen er like effektiv i både mormyrid arter Brienomyrus brachyistius og gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO ved hjelp CRISPR/Cas9 å målrette indeler og punkt mutasjoner i den første ekson av natrium kanal gen scn4aa. Ved hjelp av denne protokollen ble embryo fra begge artene innhentet og genotyped for å bekrefte at de anslåtte mutasjoner i den første ekson av natrium kanalen scn4aa var til stede. Den Knock-Out suksess fenotype ble bekreftet med opptak viser redusert elektrisk organ utladning amplituder sammenlignet med uninjected størrelse matchet kontroller.

SgRNA målområder ble identifisert i ekson 1 av scn4aa i både B. gauderio og b. brachyistius som beskrevet i avsnitt 1. SgRNAs ble generert som beskrevet i avsnitt 2. Etter vellykket sgRNA utvelgelse og syntese (figur 1), ble in vitro testet (figur 2). Den sgRNAs demonstrere in vitro skjæring ble deretter valgt for enkelt celle microinjections.
Voksen fisk var betinget for reproduksjon (§ 4,1), deretter ...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Her er en protokoll presentert for å produsere og bak CRISPR/Cas9 Genova knockout elektrisk fisk. Skissert i detalj er nødvendig molekylærbiologi, avl og oppdrett krav til både en gymnotiform og en mormyrid, og injeksjon teknikker for å produsere Cas9-indusert indel F0 larver.

Deaktivere spark: CRISPR/Cas9 Genova redigere i svakt Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9 genredigering i svakt elektrisk fisk, spesielt i komparativ sammenheng, vil gjøre det mulig for forskere å teste hypoteser om hvordan spesifikke gener og genetisk varians bidrar til fenotypisk variasjon. CRISPR/Cas9 er en effektiv metode for generering av muterte F-null embryoer. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å utføre CRISPR-Cas9 manipulasjoner i to konvergerende utviklede arter av svakt elektrisk fisk.Nøkkelen til å bruke denne tilnærmingen med noen modifikasjoner i andre elektriske fisk eller andre fiskearter er tilgjengeligheten av transkripsjons- eller genomiske ressurser for å lage sgRNAer. Det kan være vanskelig å utføre mikroinjeksjonene og visualisere cellene på et 3D-sted i et 2D-plan. Få en liten sebrafisk koloni for egg å praktisere generelle mikroinjeksjon teknikker.Å demonstrere prosedyren med Savvas Constantinou vil være Jared Thompson, en tekniker fra laboratoriet mitt. Etter å ha boliger fiskeartene av interesse under de aktuelle avlsforholdene, identifisere kvinnelig fisk som vises gravid. I B.gauderio vil kvinnen ha hovne gonader bare caudal til ventilen.I B.brachyistius kvinner vil ha hovne mager og vises dyp-bodied. Etter anestesiadministrasjon, tilsett gytemiddel til fire ganger volumet av DPBS i et PCR-rør med grundig blanding. Løsningen vil bli overskyet.Bruk en pipette til å måle ut den beregnede dosen og dispensere det fortynnede middelet til et stykke termoplastisk før du trekker oppløsningen inn i en presisjonsglasssprøyte utstyrt med en 28-gauge 19 til 25 milliliter lengde skrå nål. Injiser oppløsningen i dorsal trunk muskelen i en jevn hastighet og la nålen sitte i to til fire sekunder før fjerning. Deretter plasserer du umiddelbart fisk i ferskvann for utvinning.For B.gauderio sperm samling, etter 24 timer, velg en stor mannlig fisk og så raskt som mulig etter sedasjon, tørk fisken grundig, spesielt rundt hodet og Vent. Plasser den tørkede fiskeventralen med forsiden opp, fremre til venstre i passende holder, dekket av et MS222 gjennomvåt fuktig papirhåndkle med hodet så parallelt med bordet som mulig. Umiddelbart påfør trykk i caudal til rostral retning med lys klemme umiddelbart over gonads mot ventilen og bruke en mikropipetter med et tips, forsiktig samle sperm som det er presset fra hannen i 50-mikroliter trinn.Legg aliquot av sperm direkte på 500-mikroliter volumer av sperm extender løsning på is. Umiddelbart etter innsamlingen, plasser fisk i slim strøk beskyttelse produktbehandlet ferskvann. For B.gauderio egg samling, etter tørking en bedøvet B.gauderio kvinnelig fisk, umiddelbart plassere fisken på siden med hodet vendt mot den ikke-dominerende hånden og legge press i caudal til rostral retning med lys klemme medially over gonads mot ventilen.Bruk et polytetrafluoretylenverktøy, samle forsiktig eggene når de klemmes fra cloaca og legger raskt eggene i en liten dekket petriskål. Hvis du arbeider alene etter klemming, berører du eggmassen til bunnen av den lille petriskålen når de blir utvist fra kvinnen. Umiddelbart etter å ha samlet eggene, legg fisken i slimfrakkbeskyttelse produktbehandlet ferskvann.For B.gauderio in vitro befruktning, tilsett 100 mikroliter av den godt blandede sperm SES-løsningen rett over eggmassen, etterfulgt av en milliliter ferskvann. Bland gametes suspensjon grundig i 30 til 60 sekunder før du legger til en ekstra en til to milliliter av 0,22-mikrometer pore filtrert system vann til cellene. Merk parabolen med in vitro befruktningstid og legg parabolen i en 29-graders Celsius inkubator, og angi en 50-minutters timer for å sjekke fremdriften av utviklingen.I befruktningsperioden, bruk en mikrolasterpipettespiss for å laste to mikroliter av injeksjonsoppløsningen av interesse til en mikroinjeksjonsnål og utvise væsken så nær spissen som mulig. Når en enkelt celle har dannet seg på dyrestangen på minst en celle, overfør parabolen under et dissekerende mikroskop og bruk et par fine pinsett for å bryte nålespissen i skrå vinkel mot hvor nålens nål begynner å demonstrere stivhet. Nålens boring skal forbli så liten som mulig samtidig som en stiv taper opprettholdes.Identifiser de utviklende zygotene under mikroskopet og bruk en plastoverføringspipette med en kuttspiss for å plassere 10 til 20 egg i så lite vann som mulig på kanten av glassmikroskopsklien satt i den omvendte toppen av petriskålen. Bruk en delikat oppgavesletting, trykk forsiktig på lysbildet for å fjerne overflødig vann slik at eggene kan feste seg fast til kanten av lysbildet. Vann vil bli ond under sklien og trekke egg mot kanten.Det bør være akkurat nok vann til å holde eggene fuktige samtidig som de opprettholder lite stående fuktighet for å unngå eggbevegelse under injeksjon. Juster eggene mot lysbildet vertikalt, vinkelrett på den nærmer seg nålen, og bruk en mikromanipulator til å plassere nålen mot chorion. Deretter holder nålen i en omtrent 45-graders vinkel, sett spissen først inn i chorion og deretter, inn i den ene cellen, injisere gjennom eggeplommen hvis mulig.Fjern eventuelle ødelagte egg under injeksjonen med fine tang. Når alle eggene er injisert, bruk en sprutflaske med 0,22 mikrometer pore filtrert systemvann for å forsiktig skylle eggene fra injeksjonsstadiet til en ny 100 millimeter diameter Petriskål. Etter en vellykket kort guide RNA-valg og syntese, kan in vitro cleavage testes for valg for enkeltcellemikroinjeksjoner.Etter pcr opprydding og kloning, i dette representative eksperimentet, CRISPR-Cas9 induserte mutasjoner ble identifisert i individuelle B.gauderio og B.brachyistius kloner med sterk elektrisk organ utslipp amplitude reduksjon, mens uinjektede kontroller vises bare referert genotyper. Visualisering av elektroorganutladningsamlituden mellom bekreftede CRISPR-mutanter og agentstørrelse matchet uinjekte kontroller viste at både SCN-4 AA mutant B.brachyistius og B.gauderio embryoer hadde betydelig lavere elektriske organutladningsamlektrier enn kontroller. Når du utfører mikroinjeksjoner, flytte så raskt og bevisst som mulig for å maksimere antall encellede injisert embryoer som overlever.Ikke kast bort tid med vanskelige egg. Når vellykkede mutanter er identifisert, kan tradisjonelle avlsmetoder skape stabile mutantlinjer, noe som eliminerer CRSPR-tilknyttede mosaikkbekymringer. Denne protokollen vil tillate forskere å gjennomføre komparative genomiske studier med funksjonell validering i to konvergerende utviklede arter av svakt elektrisk fisk.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genome Redigerer med CompoZr Custom sink finger nukleaser (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital Inline Holografisk Mikros (DIHM) av Weakly-spredning Emner

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generasjon av Genomiske slettinger i pattedyrcellelinjer via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Redigerer i<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Ved hjelp av transkripsjon Activator-lignende Effector nukleaser (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Forberede og injisere embryoer av Culex mygg for å generere nullmutasjoner ved hjelp av CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Genomteknikk av primære humane B-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Pupal og voksen injeksjoner for RNAi og CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β mediert endotelial til mesenchymal overgang (EndMT) og den funksjonelle vurderingen av EndMT-effektorer ved hjelp av CRISPR/Cas9 Genredigering

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruksjon av homozygote mutanter av migrerende gresshopper ved bruk av CRISPR/Cas9-teknologi

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...