Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Os autores reconhecem os esforços heróicos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey para ajudar com a criação de peixes, coleta de dados e desenvolvimento precoce do protocolo. Gostaríamos também de agradecer aos três revisores por suas sugestões ao manuscrito. Acreditamos que o produto final seja de melhor qualidade depois de abordar seus comentários. Este trabalho foi financiado pelo apoio da National Science Foundation #1644965 e #1455405 ao JRG, e da bolsa DG do Conselho de Pesquisa de Ciências Naturais e Engenharia para o VLS.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Michigan State University.
1. Seleção de alvos sgRNA
Nota: Um protocolo é fornecido para o projeto manual de sgRNAs na etapa 1.1. Isso foi utilizado para a seleção de alvos scn4aa. Um protocolo adicional é fornecido para facilitar este processo (passo 1.2) usando o portal web EFISHGENOMICS. É aconselhável que os usuários selec...

A riqueza phenotípica de peixes fracamente elétricos, juntamente com uma recente proliferação de recursos genômicos, motiva uma forte necessidade de ferramentas genômicas funcionais no modelo de peixe seleto fraco. Este sistema é particularmente atraente devido à evolução convergente de numerosas características phenotípicas em linhagens paralelas de peixes, que são facilmente mantidos em laboratório.
O protocolo aqui descrito demonstra a eficácia da técnica CRISPR/Cas9 em linh...

A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Duas linhagens de peixes teleost, osteoglossiformes e siluriformes, evoluíram o electroreception em paralelo, e cinco linhagens de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e os Astros generacopus, Malapterurus, e Synodontis) evoluiu a eletrogênese em paralelo. Há um grau impressionante de convergência nestes fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum1,2,3.
Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies, que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que os peixes fracamente elétricos usam eletricidade para sentir seu entorno e comunicar4, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento1,5 ,6, sistemas e circuitos neurociência7,8,9,10, fisiologia celular11,12, ecologia e energéticos13 ,14,15,16,17, comportamento18,19,e macroevolução3,20,21 .
Mais recentemente, houve uma proliferação de recursos genômicos, transcriptômicos e proteômicos para peixes elétricos1,22,23,24,25,26, 27,28. O uso desses recursos já produziu importantes insights sobre a conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies1,2,3,28,29 30de ano. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas de genômica funcional31.
Uma dessas ferramentas é a recém-desenvolvida técnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic, emparelhada com a técnica de endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição do genoma que entrou em uso generalizado em ambos osmodelos 32,33,34 e organismos não-modelo35,36,37 iguais. A tecnologia CRISPR/Cas9 progrediu a um ponto onde um laboratório capaz da biologia molecular básica possa facilmente gerar as pontas de prova gene-específicas chamadas RNAs curtos do guia (sgRNAs), a um baixo custo usando um método non-cloning38. Crispr tem vantagens sobre outras estratégias de nocaute / knockdown, como morpholinos39,40, ativador de transcrição como nucleases efetores efetos (TALENs), e nucleases de dedo de zinco (ZFNs), que são caros e demorado para gerar para cada gene alvo.
O sistema CRISPR/Cas9 funciona para criar nocautes genéticos, visando uma região específica do genoma, dirigida pela sequência sgRNA, e causando uma quebra dupla. A ruptura dupla encalhada é detectada pela célula e desencadeia mecanismos de reparo de DNA endógenos preferencialmente usando a via de junção final não-homólogo (NHEJ). Esta via é altamente propensa a erros: durante o processo de reparo, a molécula de DNA muitas vezes incorpora inserções ou exclusões (indels) no local de ruptura duplamente encalhado. Estes indels podem conduzir a uma perda de função devido a ambos (1) deslocamentos no frame aberto da leitura, (2) inserção de um codon prematuro do batente, ou (3) deslocamentos na estrutura preliminar crítica do produto do gene. Neste protocolo, utilizamos a edição CRISPR/Cas9 para atingir mutações de pontos em genes-alvo usando o NHEJ em espécies de peixes fracamente elétricas. Embora mais simples e mais eficiente do que outras técnicas, espera-se que este método de mutagênese resulte em uma série de gravidades phenotípicas em F0,que é atribuída ao mosaicismo genético41,42,43 ,44.
Seleção de organismos Para fins de facilitar futuros estudos sobre a genômica comparativa de peixes elétricos fracos, uma espécie representativa tanto para gymnotiforms quanto para mormyrids para desenvolvimento de protocolo saqueou. Após discussões durante a reunião de 2016 sobre Peixes Elétricos em Montevidéu, Uruguai, houve consenso da comunidade para utilizar espécies que já poderiam ser criadas em laboratório e que tinham recursos genômicos disponíveis. O gymnotiform Brachyhypopomus gauderio e o mormyrid Brienomyrus brachyistius foram selecionados como espécies que se encaixam nesses critérios. Em ambas as espécies, pistas naturais para induzir e manter condições de reprodução são fáceis de imitar em cativeiro. B. gauderio, uma espécie de gymnotiformena da América do Sul, tem a vantagem de baixos requisitos de criação: os peixes podem ser mantidos em densidade relativamente alta em tanques relativamente pequenos (4 L). B. gauderio também tem rotatividade geracional rápida em condições cativas. Em condições de laboratório, B. gauderio pode se desenvolver de ovo para adulto em cerca de 4 meses.
B. brachyistius, uma espécie de peixe mormyrid da África Central Ocidental, se reproduz prontamente em cativeiro. B. brachyistius está prontamente disponível através do comércio do aquário, tem sido amplamente utilizado em muitos estudos, e agora tem uma série de recursos genômicos disponíveis. Seu ciclo de vida abrange 1 a 3 anos, dependendo das condições de laboratório. Os requisitos de criação são um pouco mais intensivos para esta espécie, exigindo tanques de tamanho moderado (50 a 100 L) devido à sua agressão durante a reprodução.
Laboratórios que estudam outras espécies de peixes elétricos devem ser capazes de adaptar facilmente este protocolo, enquanto a espécie pode ser criada, e embriões unicelulares podem ser coletados e criados na idade adulta. Habitação, criação de larvas e taxas de fertilização in vitro (FIV) provavelmente mudarão com outras espécies; no entanto, este protocolo pode ser usado como ponto de partida para tentativas de reprodução em outros peixes fracamente elétricos.
Um alvo ideal do gene para a prova do conceito: scn4aa Peixes mormitridas e gymnotiformes fracamente elétricos geram campos elétricos (eletrogênese) descarregando um órgão especializado, chamado órgão elétrico. As descargas de órgãos elétricos (EODs) resultam da produção simultânea de potenciais de ação nas células de órgãos elétricos chamadas eletrocitos. EODs são detectados por uma matriz de eletroreceptores na pele para criar imagens elétricas de alta resolução do ambiente do peixe45. Os peixes fracamente elétricos também são capazes de detectar características das formas de onda EOD de suas coespecíficas18, bem como suas taxas de descarga46,permitindo que os EODs funcionem adicionalmente como um sinal de comunicação social análogo ao canto dos pássaros ou rã vocalizações47.
Um componente principal da geração potencial de ação nos eletrocitos de peixes mormiridos e gymnotiformes fracamente elétricos é o canal de sódio nav1.42. Teleosts não elétricos expressam duas cópias de genes paralogous, scn4aa e scn4ab,codificando para o canal de sódio nav1.430. Em ambas as linhagens de peixes gymnotiformes e mormiridas fracamente elétricas, a scn4aa evoluiu rapidamente e passou por inúmeras substituições de aminoácidos que afetam suas propriedades cinéticas48. Mais importante, scn4aa tornou-se compartimentado em ambas as linhagens para o órgão elétrico2,3. A expressão relativamente restrita de scn4aa ao órgão elétrico, bem como seu papel fundamental na geração de EODs, faz com que seja um alvo ideal para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, pois tem efeitos pleiotrópicos deletérios mínimos. Porque os peixes fraca elétricos começam a descarregar seus órgãos elétricos larval 6-8 dias após a fertilização (DPF), alvejar do scn4aa é serido idealmente para a phenotyping rápida que segue a microinjeção do embrião.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Há um grau impressionante de convergência nesses fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum. Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que peixes elétricos fracos usam eletricidade para sentir seu entorno e se comunicar, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento, sistemas e circuitos de neurociência, fisiologia celular, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Mais recentemente, tem havido uma proliferação de recursos genômicos para peixes elétricos. O uso desses recursos já facilitou insights importantes no que diz respeito à conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas genômicas funcionais. Relatamos aqui um protocolo completo para a realização de mutagênese CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos de reparo de DNA endógenos em peixes fracamente elétricos. Demonstramos que este protocolo é igualmente eficaz tanto na espécie mormyrid Brienomyrus brachyistius e no gymnotiform Brachyhypopomus gauderio usando CRISPR/Cas9 para atingir indels e mutações pontuais na primeira exon do sódio canal gene scn4aa. Usando este protocolo, embriões de ambas as espécies foram obtidos e genotipados para confirmar que as mutações previstas no primeiro exon do canal de sódio scn4aa estavam presentes. O fenótipo de sucesso knock-out foi confirmado com gravações mostrando amplitudes reduzidas de descarga de órgãos elétricos quando comparadas a controles não injetados combinados com o tamanho.

Os locais-alvo sgRNA foram identificados dentro do exon 1 de scn4aa em B. gauderio e B. brachyistius como descrito na Seção 1. Os sgRNAs foram gerados conforme descrito na Seção 2. Após a seleção e síntese bem sucedida sgRNA (Figura 1), clivagem in vitro foi testado(Figura 2). Os sgRNAs que demonstram o corte in vitro foram selecionados então para microinjections da única pilha.
Os peixes adultos f...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

A edição de genes CRISPR/Cas9 em peixes fracamente elétricos, particularmente em um contexto comparativo, permitirá que os pesquisadores testem hipóteses sobre como genes específicos e variância genética contribuem para a variação fenotípica. CRISPR/Cas9 é um método eficiente para gerar embriões mutantes F-zero. Este protocolo permite que os pesquisadores conduzam manipulações CRISPR-Cas9 em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.A chave para usar essa abordagem com algumas modificações em outros peixes elétricos ou outras espécies de peixes é a disponibilidade de recursos transcriômicos ou genômicos para fazer sgRNAs. Realizar as microinjeções e visualizar as células em um local 3D dentro de um plano 2D pode ser difícil. Obtenha uma pequena colônia de zebrafish para ovos para praticar técnicas gerais de microinjeção.Demonstrando o procedimento com Savvas Constantinou estará Jared Thompson, um técnico do meu laboratório. Depois de abrigar as espécies de peixes de interesse sob as condições adequadas de reprodução, identifique peixes fêmeas que pareçam gravid. Em B.gauderio, a fêmea terá gônadas inchadas apenas caudal para a ventilação.Em B.brachyistius as fêmeas terão barrigas inchadas e aparecerão encorpadas. Após a administração da anestesia, adicione o agente de desova a quatro vezes o volume de DPBS em um tubo PCR com mistura completa. A solução ficará nebulosa.Use uma pipeta para medir a dose calculada e dispense o agente diluído em um pedaço de termoplástico antes de desenhar a solução em uma seringa de vidro de precisão equipada com uma agulha chanfrada de 28 bitolas de 19 a 25 mililitros. Injete a solução no músculo dorsal do tronco a uma taxa suave e deixe a agulha sentar-se por dois a quatro segundos antes da remoção. Em seguida, coloque imediatamente os peixes em água fresca do sistema para recuperação.Para a coleta de esperma de B.gauderio, após 24 horas, selecione um peixe macho grande e o mais rápido possível após a sedação, seque o peixe completamente, especialmente ao redor da cabeça e vent. Coloque o lado ventral do peixe seco para cima, anterior à esquerda no suporte apropriado, coberto por uma toalha de papel úmido embebida MS222 com a cabeça o mais paralela possível com a mesa. Aplique imediatamente pressão na direção caudal à rostral com a luz apertando imediatamente sobre as gônnas em direção à ventilação e usando uma micropipetter com uma ponta, colete cuidadosamente o esperma enquanto ele é espremido do macho em incrementos de 50 microliteres.Adicione alíquota de esperma diretamente em volumes de 500 microliter de solução extensora de esperma no gelo. Imediatamente após a coleta, coloque os peixes em água fresca tratada com produtos de proteção de lodo. Para a coleta de ovos B.gauderio, depois de secar um peixe fêmea B.gauderio anestesiado, coloque imediatamente o peixe de lado com a cabeça voltada para a mão nondominante e aplique pressão na direção caudal para rostral com leve apertando medialmente sobre as gônadas em direção à ventilação.Usando uma ferramenta de politetrafluoroetileno, colete cuidadosamente os ovos à medida que são espremidos da cloaca e coloque rapidamente os ovos em uma pequena placa de Petri coberta. Se trabalhar sozinho depois de apertar, toque a massa de ovos na base da pequena placa de Petri enquanto são expulsos da fêmea. Imediatamente após a coleta dos ovos, coloque o peixe em água fresca tratada com o produto tratado pelo produto.Para fertilização in vitro B.gaudio, adicione 100 microliters da solução ses de esperma bem misturado diretamente sobre a massa de óvulos, seguido por um mililitro de água fresca do sistema. Misture bem a suspensão dos gametas por 30 a 60 segundos antes de adicionar um adicional de um a dois mililitros de 0,22 micrômetros filtrados água do sistema às células. Rotule o prato com o tempo de fertilização in vitro e coloque o prato em uma incubadora Celsius de 29 graus, estabelecendo um temporizador de 50 minutos para verificar o progresso do desenvolvimento.Durante o período de fertilização, use uma dica de pipeta de microcarregador para carregar dois microliters da solução de injeção de interesse em uma agulha de microinjeção e expelir o líquido o mais próximo possível da ponta. Quando uma única célula se formar no polo animal de pelo menos uma célula, transfira o prato sob um microscópio dissecando e use um par de fórceps finos para quebrar a ponta da agulha em um ângulo chanfrado em direção onde o afunilador da agulha começa a demonstrar rigidez. O furo da agulha deve permanecer o menor possível, mantendo um taper rígido.Identifique as zigotes em desenvolvimento sob o microscópio e use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para colocar 10 a 20 ovos em tão pouca água quanto possível na borda do slide do microscópio de vidro colocado na parte superior invertida da placa de Petri. Usando uma limpeza de tarefa delicada, pressione suavemente o slide para remover o excesso de água para permitir que os ovos aderam firmemente à borda do slide. A água será perversa sob o escorregador e puxará ovos contra a borda.Deve haver água suficiente para manter os ovos úmidos, mantendo pouca umidade em pé para evitar o movimento dos ovos durante a injeção. Alinhe os ovos contra o slide verticalmente, perpendicular à agulha que se aproxima, e use um micromanipulador para posicionar a agulha contra o acorde. Em seguida, segurando a agulha em um ângulo de aproximadamente 45 graus, insira a ponta primeiro no acorde e, em seguida, na única célula, injetando através da gema, se possível.Remova todos os ovos quebrados durante a injeção com fórceps finos. Quando todos os ovos forem injetados, use uma garrafa de esguicho de 0,22 micrômetros filtrado água do sistema para lavar suavemente os ovos do estágio de injeção em uma nova placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro. Após um guia curto bem sucedido seleção e síntese de RNAs, o decote in vitro pode ser testado para seleção para microinjeções de célula única.Após a limpeza e clonagem do PCR, neste experimento representativo, foram identificadas mutações induzidas pelo CRISPR-Cas9 em clones b.gauderio e b.brachyistius com forte redução da amplitude de descarga de órgãos elétricos, enquanto os controles não injetados apresentaram apenas genótipos referenciados. A visualização da amplitude de descarga do órgão elétrico entre mutantes CRISPR confirmados e o tamanho do agente coincidiu com controles não injetados demonstraram que tanto os embriões mutantes do CN-4 AA B.braquiistius quanto os embriões B.gauderio tinham amplitudes de descarga de órgãos elétricos significativamente menores do que os controles. Ao realizar as micro injeções, mova-se o mais rápido e deliberadamente possível para maximizar o número de embriões injetados por células únicas que sobrevivem.Não perca tempo com ovos difíceis. Uma vez identificados mutantes bem sucedidos, métodos tradicionais de reprodução podem criar linhas mutantes estáveis, que eliminam as preocupações do mosaico associado ao CRSPR. Este protocolo permitirá que os pesquisadores realizem estudos genômicos comparativos com validação funcional em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Biologia

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Construção de mutantes homozigotos de gafanhotos migratórios utilizando tecnologia CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...