Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Os autores reconhecem os esforços heróicos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey para ajudar com a criação de peixes, coleta de dados e desenvolvimento precoce do protocolo. Gostaríamos também de agradecer aos três revisores por suas sugestões ao manuscrito. Acreditamos que o produto final seja de melhor qualidade depois de abordar seus comentários. Este trabalho foi financiado pelo apoio da National Science Foundation #1644965 e #1455405 ao JRG, e da bolsa DG do Conselho de Pesquisa de Ciências Naturais e Engenharia para o VLS.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Michigan State University.
1. Seleção de alvos sgRNA
Nota: Um protocolo é fornecido para o projeto manual de sgRNAs na etapa 1.1. Isso foi utilizado para a seleção de alvos scn4aa. Um protocolo adicional é fornecido para facilitar este processo (passo 1.2) usando o portal web EFISHGENOMICS. É aconselhável que os usuários selec...

A riqueza phenotípica de peixes fracamente elétricos, juntamente com uma recente proliferação de recursos genômicos, motiva uma forte necessidade de ferramentas genômicas funcionais no modelo de peixe seleto fraco. Este sistema é particularmente atraente devido à evolução convergente de numerosas características phenotípicas em linhagens paralelas de peixes, que são facilmente mantidos em laboratório.
O protocolo aqui descrito demonstra a eficácia da técnica CRISPR/Cas9 em linh...

A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Duas linhagens de peixes teleost, osteoglossiformes e siluriformes, evoluíram o electroreception em paralelo, e cinco linhagens de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e os Astros generacopus, Malapterurus, e Synodontis) evoluiu a eletrogênese em paralelo. Há um grau impressionante de convergência nestes fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum1,2,3.
Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies, que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que os peixes fracamente elétricos usam eletricidade para sentir seu entorno e comunicar4, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento1,5 ,6, sistemas e circuitos neurociência7,8,9,10, fisiologia celular11,12, ecologia e energéticos13 ,14,15,16,17, comportamento18,19,e macroevolução3,20,21 .
Mais recentemente, houve uma proliferação de recursos genômicos, transcriptômicos e proteômicos para peixes elétricos1,22,23,24,25,26, 27,28. O uso desses recursos já produziu importantes insights sobre a conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies1,2,3,28,29 30de ano. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas de genômica funcional31.
Uma dessas ferramentas é a recém-desenvolvida técnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic, emparelhada com a técnica de endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição do genoma que entrou em uso generalizado em ambos osmodelos 32,33,34 e organismos não-modelo35,36,37 iguais. A tecnologia CRISPR/Cas9 progrediu a um ponto onde um laboratório capaz da biologia molecular básica possa facilmente gerar as pontas de prova gene-específicas chamadas RNAs curtos do guia (sgRNAs), a um baixo custo usando um método non-cloning38. Crispr tem vantagens sobre outras estratégias de nocaute / knockdown, como morpholinos39,40, ativador de transcrição como nucleases efetores efetos (TALENs), e nucleases de dedo de zinco (ZFNs), que são caros e demorado para gerar para cada gene alvo.
O sistema CRISPR/Cas9 funciona para criar nocautes genéticos, visando uma região específica do genoma, dirigida pela sequência sgRNA, e causando uma quebra dupla. A ruptura dupla encalhada é detectada pela célula e desencadeia mecanismos de reparo de DNA endógenos preferencialmente usando a via de junção final não-homólogo (NHEJ). Esta via é altamente propensa a erros: durante o processo de reparo, a molécula de DNA muitas vezes incorpora inserções ou exclusões (indels) no local de ruptura duplamente encalhado. Estes indels podem conduzir a uma perda de função devido a ambos (1) deslocamentos no frame aberto da leitura, (2) inserção de um codon prematuro do batente, ou (3) deslocamentos na estrutura preliminar crítica do produto do gene. Neste protocolo, utilizamos a edição CRISPR/Cas9 para atingir mutações de pontos em genes-alvo usando o NHEJ em espécies de peixes fracamente elétricas. Embora mais simples e mais eficiente do que outras técnicas, espera-se que este método de mutagênese resulte em uma série de gravidades phenotípicas em F0,que é atribuída ao mosaicismo genético41,42,43 ,44.
Seleção de organismos Para fins de facilitar futuros estudos sobre a genômica comparativa de peixes elétricos fracos, uma espécie representativa tanto para gymnotiforms quanto para mormyrids para desenvolvimento de protocolo saqueou. Após discussões durante a reunião de 2016 sobre Peixes Elétricos em Montevidéu, Uruguai, houve consenso da comunidade para utilizar espécies que já poderiam ser criadas em laboratório e que tinham recursos genômicos disponíveis. O gymnotiform Brachyhypopomus gauderio e o mormyrid Brienomyrus brachyistius foram selecionados como espécies que se encaixam nesses critérios. Em ambas as espécies, pistas naturais para induzir e manter condições de reprodução são fáceis de imitar em cativeiro. B. gauderio, uma espécie de gymnotiformena da América do Sul, tem a vantagem de baixos requisitos de criação: os peixes podem ser mantidos em densidade relativamente alta em tanques relativamente pequenos (4 L). B. gauderio também tem rotatividade geracional rápida em condições cativas. Em condições de laboratório, B. gauderio pode se desenvolver de ovo para adulto em cerca de 4 meses.
B. brachyistius, uma espécie de peixe mormyrid da África Central Ocidental, se reproduz prontamente em cativeiro. B. brachyistius está prontamente disponível através do comércio do aquário, tem sido amplamente utilizado em muitos estudos, e agora tem uma série de recursos genômicos disponíveis. Seu ciclo de vida abrange 1 a 3 anos, dependendo das condições de laboratório. Os requisitos de criação são um pouco mais intensivos para esta espécie, exigindo tanques de tamanho moderado (50 a 100 L) devido à sua agressão durante a reprodução.
Laboratórios que estudam outras espécies de peixes elétricos devem ser capazes de adaptar facilmente este protocolo, enquanto a espécie pode ser criada, e embriões unicelulares podem ser coletados e criados na idade adulta. Habitação, criação de larvas e taxas de fertilização in vitro (FIV) provavelmente mudarão com outras espécies; no entanto, este protocolo pode ser usado como ponto de partida para tentativas de reprodução em outros peixes fracamente elétricos.
Um alvo ideal do gene para a prova do conceito: scn4aa Peixes mormitridas e gymnotiformes fracamente elétricos geram campos elétricos (eletrogênese) descarregando um órgão especializado, chamado órgão elétrico. As descargas de órgãos elétricos (EODs) resultam da produção simultânea de potenciais de ação nas células de órgãos elétricos chamadas eletrocitos. EODs são detectados por uma matriz de eletroreceptores na pele para criar imagens elétricas de alta resolução do ambiente do peixe45. Os peixes fracamente elétricos também são capazes de detectar características das formas de onda EOD de suas coespecíficas18, bem como suas taxas de descarga46,permitindo que os EODs funcionem adicionalmente como um sinal de comunicação social análogo ao canto dos pássaros ou rã vocalizações47.
Um componente principal da geração potencial de ação nos eletrocitos de peixes mormiridos e gymnotiformes fracamente elétricos é o canal de sódio nav1.42. Teleosts não elétricos expressam duas cópias de genes paralogous, scn4aa e scn4ab,codificando para o canal de sódio nav1.430. Em ambas as linhagens de peixes gymnotiformes e mormiridas fracamente elétricas, a scn4aa evoluiu rapidamente e passou por inúmeras substituições de aminoácidos que afetam suas propriedades cinéticas48. Mais importante, scn4aa tornou-se compartimentado em ambas as linhagens para o órgão elétrico2,3. A expressão relativamente restrita de scn4aa ao órgão elétrico, bem como seu papel fundamental na geração de EODs, faz com que seja um alvo ideal para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, pois tem efeitos pleiotrópicos deletérios mínimos. Porque os peixes fraca elétricos começam a descarregar seus órgãos elétricos larval 6-8 dias após a fertilização (DPF), alvejar do scn4aa é serido idealmente para a phenotyping rápida que segue a microinjeção do embrião.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Há um grau impressionante de convergência nesses fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum. Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que peixes elétricos fracos usam eletricidade para sentir seu entorno e se comunicar, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento, sistemas e circuitos de neurociência, fisiologia celular, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Mais recentemente, tem havido uma proliferação de recursos genômicos para peixes elétricos. O uso desses recursos já facilitou insights importantes no que diz respeito à conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas genômicas funcionais. Relatamos aqui um protocolo completo para a realização de mutagênese CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos de reparo de DNA endógenos em peixes fracamente elétricos. Demonstramos que este protocolo é igualmente eficaz tanto na espécie mormyrid Brienomyrus brachyistius e no gymnotiform Brachyhypopomus gauderio usando CRISPR/Cas9 para atingir indels e mutações pontuais na primeira exon do sódio canal gene scn4aa. Usando este protocolo, embriões de ambas as espécies foram obtidos e genotipados para confirmar que as mutações previstas no primeiro exon do canal de sódio scn4aa estavam presentes. O fenótipo de sucesso knock-out foi confirmado com gravações mostrando amplitudes reduzidas de descarga de órgãos elétricos quando comparadas a controles não injetados combinados com o tamanho.

Os locais-alvo sgRNA foram identificados dentro do exon 1 de scn4aa em B. gauderio e B. brachyistius como descrito na Seção 1. Os sgRNAs foram gerados conforme descrito na Seção 2. Após a seleção e síntese bem sucedida sgRNA (Figura 1), clivagem in vitro foi testado(Figura 2). Os sgRNAs que demonstram o corte in vitro foram selecionados então para microinjections da única pilha.
Os peixes adultos f...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.

Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

A edição de genes CRISPR/Cas9 em peixes fracamente elétricos, particularmente em um contexto comparativo, permitirá que os pesquisadores testem hipóteses sobre como genes específicos e variância genética contribuem para a variação fenotípica. CRISPR/Cas9 é um método eficiente para gerar embriões mutantes F-zero. Este protocolo permite que os pesquisadores conduzam manipulações CRISPR-Cas9 em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.A chave para usar essa abordagem com algumas modificações em outros peixes elétricos ou outras espécies de peixes é a disponibilidade de recursos transcriômicos ou genômicos para fazer sgRNAs. Realizar as microinjeções e visualizar as células em um local 3D dentro de um plano 2D pode ser difícil. Obtenha uma pequena colônia de zebrafish para ovos para praticar técnicas gerais de microinjeção.Demonstrando o procedimento com Savvas Constantinou estará Jared Thompson, um técnico do meu laboratório. Depois de abrigar as espécies de peixes de interesse sob as condições adequadas de reprodução, identifique peixes fêmeas que pareçam gravid. Em B.gauderio, a fêmea terá gônadas inchadas apenas caudal para a ventilação.Em B.brachyistius as fêmeas terão barrigas inchadas e aparecerão encorpadas. Após a administração da anestesia, adicione o agente de desova a quatro vezes o volume de DPBS em um tubo PCR com mistura completa. A solução ficará nebulosa.Use uma pipeta para medir a dose calculada e dispense o agente diluído em um pedaço de termoplástico antes de desenhar a solução em uma seringa de vidro de precisão equipada com uma agulha chanfrada de 28 bitolas de 19 a 25 mililitros. Injete a solução no músculo dorsal do tronco a uma taxa suave e deixe a agulha sentar-se por dois a quatro segundos antes da remoção. Em seguida, coloque imediatamente os peixes em água fresca do sistema para recuperação.Para a coleta de esperma de B.gauderio, após 24 horas, selecione um peixe macho grande e o mais rápido possível após a sedação, seque o peixe completamente, especialmente ao redor da cabeça e vent. Coloque o lado ventral do peixe seco para cima, anterior à esquerda no suporte apropriado, coberto por uma toalha de papel úmido embebida MS222 com a cabeça o mais paralela possível com a mesa. Aplique imediatamente pressão na direção caudal à rostral com a luz apertando imediatamente sobre as gônnas em direção à ventilação e usando uma micropipetter com uma ponta, colete cuidadosamente o esperma enquanto ele é espremido do macho em incrementos de 50 microliteres.Adicione alíquota de esperma diretamente em volumes de 500 microliter de solução extensora de esperma no gelo. Imediatamente após a coleta, coloque os peixes em água fresca tratada com produtos de proteção de lodo. Para a coleta de ovos B.gauderio, depois de secar um peixe fêmea B.gauderio anestesiado, coloque imediatamente o peixe de lado com a cabeça voltada para a mão nondominante e aplique pressão na direção caudal para rostral com leve apertando medialmente sobre as gônadas em direção à ventilação.Usando uma ferramenta de politetrafluoroetileno, colete cuidadosamente os ovos à medida que são espremidos da cloaca e coloque rapidamente os ovos em uma pequena placa de Petri coberta. Se trabalhar sozinho depois de apertar, toque a massa de ovos na base da pequena placa de Petri enquanto são expulsos da fêmea. Imediatamente após a coleta dos ovos, coloque o peixe em água fresca tratada com o produto tratado pelo produto.Para fertilização in vitro B.gaudio, adicione 100 microliters da solução ses de esperma bem misturado diretamente sobre a massa de óvulos, seguido por um mililitro de água fresca do sistema. Misture bem a suspensão dos gametas por 30 a 60 segundos antes de adicionar um adicional de um a dois mililitros de 0,22 micrômetros filtrados água do sistema às células. Rotule o prato com o tempo de fertilização in vitro e coloque o prato em uma incubadora Celsius de 29 graus, estabelecendo um temporizador de 50 minutos para verificar o progresso do desenvolvimento.Durante o período de fertilização, use uma dica de pipeta de microcarregador para carregar dois microliters da solução de injeção de interesse em uma agulha de microinjeção e expelir o líquido o mais próximo possível da ponta. Quando uma única célula se formar no polo animal de pelo menos uma célula, transfira o prato sob um microscópio dissecando e use um par de fórceps finos para quebrar a ponta da agulha em um ângulo chanfrado em direção onde o afunilador da agulha começa a demonstrar rigidez. O furo da agulha deve permanecer o menor possível, mantendo um taper rígido.Identifique as zigotes em desenvolvimento sob o microscópio e use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta de corte para colocar 10 a 20 ovos em tão pouca água quanto possível na borda do slide do microscópio de vidro colocado na parte superior invertida da placa de Petri. Usando uma limpeza de tarefa delicada, pressione suavemente o slide para remover o excesso de água para permitir que os ovos aderam firmemente à borda do slide. A água será perversa sob o escorregador e puxará ovos contra a borda.Deve haver água suficiente para manter os ovos úmidos, mantendo pouca umidade em pé para evitar o movimento dos ovos durante a injeção. Alinhe os ovos contra o slide verticalmente, perpendicular à agulha que se aproxima, e use um micromanipulador para posicionar a agulha contra o acorde. Em seguida, segurando a agulha em um ângulo de aproximadamente 45 graus, insira a ponta primeiro no acorde e, em seguida, na única célula, injetando através da gema, se possível.Remova todos os ovos quebrados durante a injeção com fórceps finos. Quando todos os ovos forem injetados, use uma garrafa de esguicho de 0,22 micrômetros filtrado água do sistema para lavar suavemente os ovos do estágio de injeção em uma nova placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro. Após um guia curto bem sucedido seleção e síntese de RNAs, o decote in vitro pode ser testado para seleção para microinjeções de célula única.Após a limpeza e clonagem do PCR, neste experimento representativo, foram identificadas mutações induzidas pelo CRISPR-Cas9 em clones b.gauderio e b.brachyistius com forte redução da amplitude de descarga de órgãos elétricos, enquanto os controles não injetados apresentaram apenas genótipos referenciados. A visualização da amplitude de descarga do órgão elétrico entre mutantes CRISPR confirmados e o tamanho do agente coincidiu com controles não injetados demonstraram que tanto os embriões mutantes do CN-4 AA B.braquiistius quanto os embriões B.gauderio tinham amplitudes de descarga de órgãos elétricos significativamente menores do que os controles. Ao realizar as micro injeções, mova-se o mais rápido e deliberadamente possível para maximizar o número de embriões injetados por células únicas que sobrevivem.Não perca tempo com ovos difíceis. Uma vez identificados mutantes bem sucedidos, métodos tradicionais de reprodução podem criar linhas mutantes estáveis, que eliminam as preocupações do mosaico associado ao CRSPR. Este protocolo permitirá que os pesquisadores realizem estudos genômicos comparativos com validação funcional em duas espécies convergentemente evoluídas de peixes fracamente elétricos.

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