Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Авторы признают героические усилия Моники Лукас, Кэтрин Шоу, Райана Тейлора, Джареда Томпсона, Николь Робишо и Хоуп Хили за помощь в размножеству рыб, сборе данных и разработке раннего протокола. Мы также хотели бы поблагодарить трех рецензентов за их предложения по рукописи. Мы считаем, что конечный продукт будет лучшего качества после рассмотрения их замечаний. Эта работа была профинансирована за счет поддержки Со стороны Национального научного фонда #1644965 и #1455405 JRG, а также Грант Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям DG для VLS.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Мичиганского государственного университета.
1. Выбор целей sgRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: Предусмотрен протокол ручного проектирования сгРНВ в шаге...

Фенотипическое богатство слабоэлектрической рыбы, наряду с недавним распространением ресурсов геномики, мотивирует острую потребность в функциональных геномных инструментах в слабо электрической модели рыб. Эта система особенно привлекательна из-за конвергентной эволюции многочи?...

Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Две линии телеостных рыб, остеоглоссиформы и силуриформы, развивались электроприем параллельно, и пять линий телеост (гимназии, мормириды, и род Астроскопус, Малаптерурус, и Synodontis) развивался электрогенез параллельно. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру1,2,3.
Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. В 50 лет с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться4, растущее сообщество ученых получил огромное понимание эволюции развития1,5 ,6, системы и схемы нейробиологии7,8,9,10, клеточной физиологии11,12, экологии и энергетики13 ,14,15,16,17, поведение18,19, и макроэволюция3,20,21 .
В последнее время наблюдается распространение геномных, транскриптомических и протеомных ресурсов для электрической рыбы1,22,23,24,25,26, 27,28. Использование этих ресурсов уже дало важные идеи относительно связи между генотипом и фенотипом у этих видов1,2,3,28,29 ,30. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики31.
Одним из таких инструментов является недавно разработанный кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic Повторы в паре с Cas9 эндонуклеазы (CRISPR/Cas9, CRISPR) техники. CRISPR/Cas9 является инструментом редактирования генома, который вошел широкое применение в обеих моделей32,33,34 и не-модель организмов35,36,37, так. Технология CRISPR/Cas9 продвинулась до такой степени, что лаборатория, способная к базовой молекулярной биологии, может легко генерировать генно-специфические зонды, называемые короткими направляющими РНК (sgRNAs), по низкой цене с использованием метода неклонирования38. CRISPR имеет преимущества по сравнению с другими стратегиями нокаута/нокдауна, такими как морфолинос39,40, транскрипционный активатор-подобный эффектор nucleases (TALENs), и цинковый палец nucleases (ЗФНС), которые являются дорогостоящими и много времени для генерации для каждого целевого гена.
Система CRISPR/Cas9 функционирует для создания генных нокаутов, ориентируясь на определенную область генома, направленную последовательностью sgRNA, и вызывая двухцепочечный разрыв. Двухцепочечный разрыв обнаруживается клеткой и вызывает эндогенные механизмы репарации ДНК, преимущественно используя негомологичные конечные соединения (NHEJ). Этот путь очень подвержен ошибкам: во время процесса ремонта молекула ДНК часто включает вставки или удаления (индельи) в двухцепочечном месте разрыва. Эти indels могут привести к потере функции из-за либо (1) сдвиги в открытой раме чтения, (2) вставки преждевременной остановки кодона, или (3) сдвиги в критической первичной структуре гена продукта. В этом протоколе мы используем редактирование CRISPR/Cas9 для целевых точечных мутаций в генах-мишенях, используя NHEJ у слабо электрических видов рыб. Хотя проще и эффективнее, чем другие методы, этот метод мутагенеза, как ожидается, приведет к ряду фенотипических разрывов в F0, который приписывается генетический мозаичный41,42,43 ,44.
Выбор организмов Для содействия будущим исследованиям по сравнительной геномике слабо электрических рыб необходимо было отобрать представительный вид как для гимназиформ, так и для мормиридов для разработки протокола. После обсуждения в ходе совещания «Электрические рыбы» в Монтевидео, Уругвай, в 2016 году был достигнут консенсус сообщества в отношении использования видов, которые уже могут быть выведены в лаборатории и которые имеют сявко. Тренажерный зал Brachyhypopomus gauderio и mormyrid Brienomyrus brachyistius были выбраны в качестве видов, которые соответствуют этим критериям. В обоих видах, естественные сигналы для индуцирования и поддержания условий размножения легко имитировать в неволе. B. gauderio, gymnotiform видов из южной Америки, имеет преимущество низких требований к животноводству: рыба может храниться при относительно высокой плотности в относительно небольших (4 L) танков. B. gauderio также имеет быстрый оборот поколений в условияхневоле. В лабораторных условиях, B. gauderio может развиваться от яйца к взрослому примерно в 4 месяца.
B. brachyistius, вид мормиридных рыб из Западно-Центральной Африки, легко размножается в неволе. B. brachyistius легко доступен через аквариум торговли, был широко использован во многих исследованиях, и в настоящее время имеет ряд геномных ресурсов. Их жизненный цикл составляет 1–3 года, в зависимости от лабораторных условий. Требования к животноводству несколько более интенсивны для этого вида, требуя средних размеров танков (50–100 л) из-за их агрессии во время размножения.
Лаборатории, изучающие другие виды электрических рыб, должны быть в состоянии легко адаптировать этот протокол до тех пор, пока вид может быть выведен, и одноклеточные эмбрионы могут быть собраны и воспитаны во взрослую жизнь. С другими видами, скорее всего, изменятся показатели жилищного строительства, личинки и экстракорпорального оплодотворения (ЭКО); однако, этот протокол может быть использован в качестве отправной точки для размножения попыток в других слабо электрических рыб.
Идеальный ген Целевой для доказательства концепции: scn4aa Слабо электрические мормиридные и gymnotiform рыбы генерировать электрические поля (электрогенез) путем разрядки специализированного органа, называемого электрическим органом. Электрические разряды органов (EOD) являются результатом одновременного производства потенциалов действия в клетках электрических органов, называемых электроцитами. EODs обнаружены массив электрорецепторов в коже для создания высокого разрешения электрических изображений окружения рыбы45. Слабо электрические рыбы также способны обнаруживать особенности eOD волновых форм их conspecifics18, а также их скорость разряда46,что позволяет EODs функционировать дополнительно в качестве сигнала социальной связи, аналогичной пение птиц или лягушки вокализации47.
Основным компонентом действия потенциального поколения в электроцитах как мормирид, так и gymnotiform слабо электрической рыбы является напряжение-gated натриевый канал NaV1.42. Неэлектрические телеост выражают две паралогические копии генов, scn4aa и scn4ab, кодирование для натриевого канала NaV1.430. В обоих gymnotiform и mormyrid слабо электрических линий рыбы, scn4aa развивалась быстро и претерпела многочисленные аминокислотные замены, которые влияют на его кинетические свойства48. Самое главное, scn4aa стала разобщена в обеих линиях к электрическому органу2,3. Относительно ограниченное выражение scn4aa к электрическому органу, а также его ключевая роль в генерации EODs, делает его идеальной мишенью для экспериментов по нокауту CRISPR/Cas9, так как он имеет минимальные пагубные плейотропные эффекты. Поскольку слабо электрические рыбы начинают выгрузку своих личинок электрических органов 6-8 дней после оплодотворения (DPF), ориентация scn4aa идеально подходит для быстрого фенотипирования после микроинъекции эмбриона.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру. Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. За 50 лет, прошедших с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться, растущее сообщество ученых получило огромное понимание эволюции развития, систем и схем нейронауки, клеточной физиологии, экологии, эволюционной биологии и поведения. В последнее время наблюдается распространение геномных ресурсов для электрической рыбы. Использование этих ресурсов уже способствовало получению важных сведений о связи между генотипом и фенотипом этих видов. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики. Мы сообщаем здесь полный протокол для выполнения CRISPR/Cas9 мутагенеза, который использует эндогенные механизмы репарации ДНК в слабо электрических рыб. Мы демонстрируем, что этот протокол одинаково эффективен как в мормиридных видах Brienomyrus brachyistius, так и в gymnotiform Brachyhypopomus gauderio с помощью CRISPR/Cas9 для целевой indels и точечных мутаций в первом экзоне натриевый канал гена scn4aa. Используя этот протокол, эмбрионы обоих видов были получены и генотипированы, чтобы подтвердить, что прогнозируемые мутации в первом экзоне канала натрия scn4aa присутствовали. Плей-аут успеха фенотип был подтвержден с записями, показывающими снижение электрических амплитуды разряда органов по сравнению с невведенным размером соответствующих элементов управления.

Целевые объекты сгРНК были определены в пределах exon 1 scn4aa в обоих B. gauderio и B. brachyistius, как описано в разделе 1. СГРН были созданы, как описано в разделе 2. После успешного отбора и синтеза сгРНК(Рисунок 1),декольте в пробирке было протестировано(рисуно...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Здесь представлен протокол для производства и заднего CRISPR/Cas9 генома нокаут электрической рыбы. Изложены в деталях являются необходимые молекулярной биологии, селекции, и животноводство требования как для gymnotiform и mormyrid, и инъекционные методы для производства Cas9 индуцированных indel F0 личинок.

Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Редактирование генов CRISPR/Cas9 у слабо электрических рыб, особенно в сравнительном контексте, позволит исследователям проверить гипотезы о том, как специфические гены и генетическая дисперсия способствуют фенотипическим вариациям. CRISPR/Cas9 является эффективным методом генерации мутантных эмбрионов F-zero. Этот протокол позволяет исследователям проводить манипуляции CRISPR-Cas9 в двух конвергентно эволюцию видов слабо электрических рыб.Ключом к использованию этого подхода с некоторыми изменениями в других электрических рыб или других видов рыб является наличие транскриптомных или геномных ресурсов для сделать sgRNAs. Выполнение микроинъекций и визуализация клеток в 3D-месте в 2D плоскости может быть затруднено. Получить небольшую колонию зебры для яиц на практике общих методов микроинъекции.Демонстрацией процедуры с Саввасом Константину будет Джаред Томпсон, техник из моей лаборатории. После жилья видов рыб, представляющих интерес в соответствующих условиях размножения, определить самок рыб, которые появляются gravid. В B.gauderio, самка будет иметь опухшие гонады просто caudal в вентиляционные отверстия.В B.brachyistius самки будут иметь опухшие животы и появляются глубокотелые. После введения анестезии добавьте нерестовой агент в четыре раза больше DPBS в трубку ПЦР с тщательным смешиванием. Раствор станет облачным.Используйте пипетку, чтобы измерить рассчитанную дозу и обойтись разбавленного агента к куску термопластика, прежде чем рисовать раствор в точный стеклянный шприц оснащен 28-го калибра от 19 до 25-миллилитровой длины скошенной иглы. Ввимите раствор в мышцу спинного туловища с гладкой скоростью и дайте игле сидеть в течение двух-четырех секунд до удаления. Затем немедленно поместите рыбу в пресную воду системы для восстановления.Для сбора спермы B.gauderio, через 24 часа, выберите большую мужскую рыбу и как можно быстрее после одации, тщательно высушите рыбу, особенно вокруг головы и Вента. Поместите высушенную рыбу брюшной стороны вверх, передней слева в соответствующий держатель, покрытый MS222 пропитанной влажной бумажное полотенце с головой, как параллельно со столом, как это возможно. Немедленно нанесите давление в caudal к rostral направлению с светом сжимая немедленно над gonads к вентиляции и используя micropipetter с подсказкой, тщательно собираете сперму по мере того как она сжата от мужчины в 50-microliter приращениях.Добавьте алицит спермы непосредственно на 500-микролитерные объемы раствора расширитея спермы на льду. Сразу после сбора поместите рыбу в слизь пальто защиты продукт-обработанной пресной системой воды. Для сбора яиц B.gauderio, после высыхания обезболивающей самки рыбы B.gauderio, немедленно поместите рыбу на бок с головой, обращенной к недоминной руке, и нанесите давление в хвостовом направлении с легким сжатием medially над гонадами к вентиляции.Используя инструмент политетрафторэтилен, тщательно собирайте яйца, как они выдавливаются из клоаки и быстро поместите яйца в небольшой крытый Чашку Петри. Если вы работаете в одиночку после сжатия, коснитесь яичной массы к основанию небольшой чашки Петри, как они изгнаны из женщины. Сразу же после сбора яиц, поместите рыбу в слизь пальто защиты продукт-обработанной пресной воды системы.Для экстракорпорального оплодотворения B.gauderio добавьте 100 микролитров хорошо смешанного раствора спермы SES непосредственно над яичной массой, а затем один миллилитр пресной воды системы. Смешайте подвеску gametes тщательно в течение 30 до 60 секунд, прежде чем добавить дополнительный один-два миллилитров 0,22-микрометровой поры фильтрованной системной воды в клетки. Этикетка блюдо с временем экстракорпорального оплодотворения и поместите блюдо в 29-градусный инкубатор по Цельсию, установив 50-минутный таймер, чтобы проверить ход развития.В период оплодотворения используйте наконечник пипетки микрозагрузщика, чтобы перезагрузить два микролитров инъекционного раствора, представляющих интерес, в микроинъекцию иглы и изгнать жидкость как можно ближе к кончику. Когда одна клетка сформировалась на полюсе животного по крайней мере одной клетки, перенесите блюдо под рассеченный микроскоп и используйте пару тонких щипцы, чтобы сломать кончик иглы под скошенным углом к тому, где конус иглы начинает демонстрировать жесткость. Отверстие иглы должно оставаться как можно меньше при сохранении жесткого конуса.Определите развивающиеся зиготы под микроскопом и используйте пластиковую трубку передачи с разрезом наконечником, чтобы поместить от 10 до 20 яиц в как можно меньше воды на краю слайда стеклянного микроскопа, установленного в перевернутой верхней части чашки Петри. Используя деликатную протрите задачу, осторожно нажмите слайд, чтобы удалить избыток воды, чтобы яйца прочно прилипли к краю слайда. Вода будет злой под слайдом и тянуть яйца к краю.Там должно быть достаточно воды, чтобы держать яйца влажными, сохраняя при этом мало влаги стоя, чтобы избежать движения яйца во время инъекции. Выровняйте яйца против слайда вертикально, перпендикулярно приближающейся игле, и используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу против хориона. Затем, держа иглу под примерно углом 45 градусов, вставьте кончик сначала в хорион, а затем, в одну клетку, впрыскивает через желток, если это возможно.Удалите все сломанные яйца во время инъекции с тонкой типсов. Когда все яйца были введены, используйте шприц бутылку 0,22-микрометровой поры фильтрованной системной воды, чтобы аккуратно промыть яйца от стадии инъекции в новую 100-миллиметровую чашку Петри. После успешного краткого руководства RNAs отбора и синтеза, в пробирке расщепления могут быть проверены для выбора для одноклеточных микроинъекций.После очистки и клонирования ПЦР в этом репрезентативном эксперименте индуцированные мутации CRISPR-Cas9 были выявлены в отдельных клонах B.gauderio и B.brachyistius с сильным снижением амплитуды разряда электрического органа, в то время как неинъекционные элементы управления отображали только ссылающиеся генотипы. Визуализация амплитуды разряда электрического органа между подтвержденными мутантами CRISPR и размером агента, сочетаемой с необъективными управлениями, показала, что оба мутанта SCN-4 AA B.brachyistius и B.gauderio имели значительно более низкие амплитуды разряда электрических органов, чем элементы управления. При выполнении микро-инъекций, двигаться как можно быстрее и намеренно, чтобы максимизировать количество одноклеточных инъекционных эмбрионов, которые выживают.Не тратьте время на сложные яйца. После того, как успешные мутанты были определены, традиционные методы разведения могут создать стабильные линии мутантов, которые устраняют связанные с CRSPR проблемы мозаичности. Этот протокол позволит исследователям провести сравнительные геномные исследования с функциональной проверкой в двух конвергентно эволюцивах видах слабоэлектри электрических рыб.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Цифровой Инлайн Голографическая микроскопия (DIHM) субъектов слабо-рассеяния

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Геном Редактирование в<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Использование Транскрипция Активатор-как эффектор Нуклеазы (Таленс)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Геномная инженерия первичных клеток человека B с использованием CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Инъекции куколки и взрослых для редактирования генов РНКи и CRISPR в Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β-опосредованный переход эндотелия в мезенхимальный переход (EndMT) и функциональная оценка эффекторов EndMT с использованием редактирования генов CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Построение гомозиготных мутантов мигрирующей саранчи с использованием технологии CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...