Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Los autores reconocen los heroicos esfuerzos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud y Hope Healey por su ayuda con la cría de peces, la recopilación de datos y el desarrollo temprano del protocolo. También nos gustaría dar las gracias a los tres críticos por sus sugerencias al manuscrito. Creemos que el producto final es de mejor calidad después de abordar sus comentarios. Este trabajo fue financiado por el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias #1644965 y #1455405 a JRG, y la DG del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería a VLS.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.
1. Selección de objetivos sgRNA
NOTA: Se proporciona un protocolo para el diseño manual de los sgRNA en el paso 1.1. Esto se utilizó para la selección de objetivos scn4aa. Se proporciona un protocolo adicional para facilitar este proceso (paso 1.2) utilizando el portal web EFISHGENO...

La riqueza fenotípica de los peces débilmente eléctricos, junto con una reciente proliferación de recursos genómicos, motiva una fuerte necesidad de herramientas genómicas funcionales en el modelo de peces débilmente eléctricos. Este sistema es particularmente atractivo debido a la evolución convergente de numerosos rasgos fenotípicos en linajes paralelos de peces, que se mantienen fácilmente en el laboratorio.
El protocolo descrito aquí demuestra la eficacia de la técnica CRISPR/...

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común1,2,3.
Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnotiformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies, que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno ycomunicarse 4, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo1,5 ,6, sistemas y circuitos neurociencia7,8,9,10, fisiología celular11,12, ecología y energía13 ,14,15,16,17, comportamiento18,19, y macroevolución3,20,21 .
Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos, transcriptomicos y proteómicos para peces eléctricos1,22,23,24,25,26, 27,28. El uso de estos recursos ya ha producido importantes perspectivas sobre la conexión entre genotipo y fenotipo en estas especies1,2,3,28,29 ,30. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales31.
Una de estas herramientas es la técnica de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas recientemente desarrolladas junto con la técnica de endonucleasa Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición del genoma que ha entrado en uso generalizado tanto en los modelos32,33,34 y organismos no modelo35,36,37 por igual. La tecnología CRISPR/Cas9 ha progresado hasta un punto en el que un laboratorio capaz de la biología molecular básica puede generar fácilmente sondas específicas genéticas llamadas ARN de guía corta (SgRNAs), a un bajo costo utilizando un método de no clonación38. CRISPR tiene ventajas sobre otras estrategias de derribo/desaqueo, como morpholinos39,40, nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALENs), y nucleasas de dedos de zinc (ZFN), que son costosas y tiempo para generar para cada gen objetivo.
El sistema CRISPR/Cas9 funciona para crear nocauts genéticos apuntando a una región específica del genoma, dirigida por la secuencia sgRNA, y causando una rotura de doble cadena. La rotura de doble cadena es detectada por la célula y desencadena mecanismos endógenos de reparación del ADN preferentemente utilizando la vía de unión final no homóloga (NHEJ). Esta vía es altamente propensa a errores: durante el proceso de reparación, la molécula de ADN a menudo incorporará inserciones o deleciones (indels) en el sitio de rotura de doble cadena. Estos indels pueden resultar en una pérdida de la función debido a (1) cambios en el marco de lectura abierto, (2) inserción de un codón de parada prematura, o (3) cambios en la estructura primaria crítica del producto genético. En este protocolo, utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para apuntar mutaciones puntuales en genes diana utilizando el NHEJ en especies de peces débilmente eléctricos. Si bien es más simple y eficiente que otras técnicas, se espera que este método de mutagénesis resulte en una serie de severidades fenotípicas en F0,que se atribuye al mosaico genético41,42,43 ,44.
Selección de organismos Con el fin de facilitar futuros estudios sobre la genómica comparativa de los peces débilmente eléctricos, es necesario seleccionar una especie representativa tanto para gimnotiformes como mormyrids para el desarrollo de protocolos. Después de las discusiones durante la reunión de Pescado Eléctrico de 2016 en Montevideo, Uruguay, hubo consenso de la comunidad para utilizar especies que ya podían ser criadas en el laboratorio y que tenían recursos genómicos disponibles. El gymnotiform Brachyhypopomus gauderio y el mormyrid Brienomyrus brachyistius fueron seleccionados como especies que se ajustan a estos criterios. En ambas especies, las señales naturales para inducir y mantener las condiciones de reproducción son fáciles de imitar en cautiverio. B. gauderio,una especie gimnoiforme de América del Sur, tiene la ventaja de bajos requisitos de cría: los peces se pueden mantener a una densidad relativamente alta en tanques relativamente pequeños (4 L). B. gauderio también tiene una rápida rotación generacional en condiciones cautivas. En condiciones de laboratorio, B. gauderio puede desarrollarse de huevo a adulto en aproximadamente 4 meses.
B. brachyistius, una especie de pez mormirid de Africa Occidental-Central, se reproduce fácilmente en cautiverio. B. brachyistius está fácilmente disponible a través del comercio de acuarios, ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios, y ahora tiene una serie de recursos genómicos disponibles. Su ciclo de vida abarca entre 1 y 3 años, dependiendo de las condiciones de laboratorio. Los requisitos de cría son algo más intensivos para esta especie, requiriendo tanques de tamaño moderado (50-100 L) debido a su agresión durante la reproducción.
Los laboratorios que estudian otras especies de peces eléctricos deben ser capaces de adaptar fácilmente este protocolo siempre y cuando la especie pueda ser criada, y los embriones de una sola célula pueden ser recogidos y criados en la edad adulta. Las tasas de vivienda, cría larvaria y fertilización in vitro (FIV) probablemente cambiarán con otras especies; sin embargo, este protocolo puede ser utilizado como punto de partida para los intentos de cría en otros peces débilmente eléctricos.
Un objetivo gene ideal para la prueba de concepto: scn4aa Los peces mormyrid y gimnotiformo débilmente eléctricos generan campos eléctricos (electrogénesis) mediante la descarga de un órgano especializado, llamado órgano eléctrico. Las descargas de órganos eléctricos (EOD) son el resultado de la producción simultánea de potenciales de acción en las células de órganos eléctricos llamadas electrocitos. Los EOD son detectados por una serie de electrorreceptores en la piel para crear imágenes eléctricas de alta resolución del entorno de los peces45. Los peces débilmente eléctricos también son capaces de detectar características de las formas de onda EOD de sus conespecíficos18, así como sus velocidades de descarga46,lo que permite que los EODfunciones funcionen adicionalmente como una señal de comunicación social análoga al canto de los pájaros o ranas vocalizaciones47.
Un componente principal de la generación de potencial de acción en los electrocitos de peces débilmente eléctricos mormyrid y gymnotiform es el canal de sodio cerrado por tensión NaV1.42. Los teleosts no eléctricos expresan dos copias genéticas yólo, scn4aa y scn4ab,codificación para el canal de sodio cerrado con tensión NaV1.430. Tanto en los linajes de peces gimnotiformos como mormyrid débilmente eléctricos, scn4aa ha evolucionado rápidamente y ha sufrido numerosas sustituciones de aminoácidos que afectan a sus propiedades cinéticas48. Lo más importante es que la scn4aa se ha compartimentado en ambos linajes del órgano eléctrico2,3. La expresión relativamente restringida de scn4aa al órgano eléctrico, así como su papel clave en la generación de EODs, lo convierten en un objetivo ideal para los experimentos knockout de CRISPR/Cas9, ya que tiene efectos pleiotrópicos mínimamente nocivos. Debido a que los peces débilmente eléctricos comienzan a descargar sus órganos eléctricos larvales de 6 a 8 días después de la fertilización (DPF), la focalización de scn4aa es ideal para el fenotipado rápido después de la microinyección de embriones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Hay un sorprendente grado de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común. Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnoliformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y comunicarse, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo, los sistemas y circuitos de neurociencia, fisiología celular, ecología, biología evolutiva y comportamiento. Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos para los peces eléctricos. El uso de estos recursos ya ha facilitado importantes conocimientos con respecto a la conexión entre el genotipo y el fenotipo en estas especies. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales. Aquí informamos de un protocolo completo para la realización de mutagénesis CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos endógenos de reparación del ADN en peces débilmente eléctricos. Demostramos que este protocolo es igualmente eficaz tanto en la especie mormyrid Brienomyrus brachyistius como en el gymnotiform Brachyhypopomus gauderio mediante el uso de CRISPR/Cas9 para apuntar a indels y mutaciones puntuales en el primer exón de la canal de sodio scn4aa. Utilizando este protocolo, se obtuvieron embriones de ambas especies y se genotiparon para confirmar que las mutaciones pronosticadas en el primer exón del canal de sodio scn4aa estaban presentes. El fenotipo de éxito de knock-out se confirmó con grabaciones que muestran amplitudes de descarga de órganos eléctricos reducidas en comparación con los controles de tamaño no inyectados.

Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.
L...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

La edición de genes CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos, particularmente en un contexto comparativo, permitirá a los investigadores probar hipótesis sobre cómo los genes específicos y la varianza genética contribuyen a la variación fenotípica. CRISPR/Cas9 es un método eficiente para generar embriones mutantes F-cero. Este protocolo permite a los investigadores llevar a cabo manipulaciones CRISPR-Cas9 en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.La clave para utilizar este enfoque con algunas modificaciones en otros peces eléctricos u otras especies de peces es la disponibilidad de recursos transcriptómicos o genómicos para hacer sgRNAs. Realizar las microinyeccións y visualizar las celdas en una ubicación 3D dentro de un plano 2D puede ser difícil. Obtener una pequeña colonia de peces cebra para que los huevos practiquen técnicas generales de microinyección.Demostrando el procedimiento con Savvas Constantinou estará Jared Thompson, un técnico de mi laboratorio. Después de albergar las especies de peces de interés en las condiciones de cría adecuadas, identifique los peces hembra que aparecen gravid. En B.gauderio, la hembra tendrá gónadas hinchadas a caudal hasta el respiradero.En B.brachyistius las hembras tendrán vientres hinchados y parecen de cuerpo profundo. Después de la administración de anestesia, agregue el agente de desove a cuatro veces el volumen de DPBS en un tubo de PCR con una mezcla completa. La solución se nublará.Utilice una pipeta para medir la dosis calculada y dispensar el agente diluido a una pieza de termoplástico antes de extraer la solución en una jeringa de vidrio de precisión equipada con una aguja biselada de 28 calibres de 19 a 25 mililitros de longitud. Inyecte la solución en el músculo dorsal del tronco a una velocidad suave y deje que la aguja se siente durante dos a cuatro segundos antes de la extracción. A continuación, coloque inmediatamente el pescado en agua fresca del sistema para su recuperación.Para la recolección de espermatozoides B.gauderio, después de 24 horas, seleccione un pez macho grande y lo más rápido posible después de la sedación, secar el pescado a fondo, especialmente alrededor de la cabeza y Vent. Coloque el pescado seco de lado ventral hacia arriba, antes a la izquierda en el soporte adecuado, cubierto en una toalla de papel húmeda empapada MS222 con la cabeza lo más paralela posible con la mesa. Aplicar inmediatamente presión en el caudal en dirección rostral con la luz apretando inmediatamente sobre las gónadas hacia la ventilación y usando un micropipetter con una punta, recoja cuidadosamente el esperma a medida que se exprime del macho en incrementos de 50 microlitros.Añadir alícuota de espermatozoides directamente en volúmenes de 500 microlitros de solución extensora de esperma en hielo. Inmediatamente después de la recolección, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba. Para la recolección de huevos B.gauderio, después de secar un pez hembra B.gauderio anestesiado, coloque inmediatamente el pez de lado con la cabeza mirando hacia la mano nonteminante y aplique presión en el caudal a la dirección rostral con ligero exprimido mediamente sobre las gónadas hacia el respiradero.Usando una herramienta de politetrafluoroetileno, recoja cuidadosamente los huevos a medida que se exprimen de la cloaca y coloque rápidamente los huevos en un pequeño plato de Petri cubierto. Si trabaja solo después de apretar, toque la masa de huevo a la base de la pequeña placa de Petri, ya que son expulsados de la hembra. Inmediatamente después de recoger los huevos, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba.Para la fertilización in vitro de B.gauderio, agregue 100 microlitros de la solución SES de espermatozoides bien mezclada directamente sobre la masa del óvulo, seguido de un mililitro de agua fresca del sistema. Mezcla bien la suspensión de los gametos durante 30 a 60 segundos antes de añadir de uno a dos mililitros adicionales de agua filtrada poro de 0,22 micrómetros a las células. Etiquete el plato con el tiempo de fertilización in vitro y coloque el plato en una incubadora de 29 grados Celsius, estableciendo un temporizador de 50 minutos para comprobar el progreso del desarrollo.Durante el período de fertilización, utilice una punta de pipeta de microcargador para cargar dos microlitros de la solución de inyección de interés en una aguja de microinyección y expulsar el líquido lo más cerca posible de la punta. Cuando una sola célula se haya formado en el polo animal de al menos una célula, transfiera el plato bajo un microscopio diseccionador y use un par de fórceps finos para romper la punta de la aguja en un ángulo biselado hacia donde el cónico de la aguja comienza a demostrar rigidez. El orificio de la aguja debe permanecer lo más pequeño posible mientras se mantiene un cónico rígido.Identifique los cigotos en desarrollo bajo el microscopio y utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para colocar de 10 a 20 huevos en la menor agua posible en el borde del portaobjetos del microscopio de vidrio establecido en la parte superior invertida de la placa Petri. Con una delicada toallita de tarea, presione suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua para permitir que los huevos se adhieran firmemente al borde del portaobjetos. El agua será perversa bajo el tobogán y tirará de los huevos contra el borde.Debe haber suficiente agua para mantener los huevos húmedos mientras se mantiene poca humedad de pie para evitar el movimiento del huevo durante la inyección. Alinee los huevos contra el portaobjetos verticalmente, perpendicular a la aguja que se aproxima, y utilice un micromaniprógrafo para colocar la aguja contra la tarea. Luego, sosteniendo la aguja en un ángulo de aproximadamente 45 grados, inserte la punta primero en la tarea y luego, en la sola celda, inyectando a través de la yema si es posible.Retire los huevos rotos durante la inyección con fórceps finos. Cuando se hayan inyectado todos los huevos, utilice una botella de chorro de agua filtrada del sistema de poro de 0,22 micrómetros para lavar suavemente los huevos de la etapa de inyección en un nuevo plato petri de 100 milímetros de diámetro. Después de una exitosa selección y síntesis de ARN de guía corta, el escote in vitro se puede probar para su selección de microinyeccións de una sola célula.Después de la limpieza y clonación de PCR, en este experimento representativo, se identificaron mutaciones inducidas por CRISPR-Cas9 en clones individuales de B.gauderio y B.brachyistius con una fuerte reducción de la amplitud de descarga de órganos eléctricos, mientras que los controles no inyectados solo mostraban genotipos de referencia. La visualización de la amplitud de descarga de órganos eléctricos entre los mutantes CRISPR confirmados y el tamaño del agente coincidió con los controles no inyectados demostró que tanto los embriones mutantes SCN-4 AA B.brachyistius como B.gauderio tenían amplitudes de descarga de órganos eléctricos significativamente más bajas que los controles. Al realizar las micro inyecciones, muévase lo más rápido y deliberadamente posible para maximizar el número de embriones inyectados de una sola célula que sobreviven.No pierda tiempo con huevos difíciles. Una vez identificados los mutantes exitosos, los métodos de reproducción tradicionales pueden crear líneas mutantes estables, que eliminan las preocupaciones de mosaico asociadas al CRSPR. Este protocolo permitirá a los investigadores realizar estudios genómicos comparativos con validación funcional en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.

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