Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
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Los autores reconocen los heroicos esfuerzos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud y Hope Healey por su ayuda con la cría de peces, la recopilación de datos y el desarrollo temprano del protocolo. También nos gustaría dar las gracias a los tres críticos por sus sugerencias al manuscrito. Creemos que el producto final es de mejor calidad después de abordar sus comentarios. Este trabajo fue financiado por el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias #1644965 y #1455405 a JRG, y la DG del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería a VLS.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.
1. Selección de objetivos sgRNA
NOTA: Se proporciona un protocolo para el diseño manual de los sgRNA en el paso 1.1. Esto se utilizó para la selección de objetivos scn4aa. Se proporciona un protocolo adicional para facilitar este proceso (paso 1.2) utilizando el portal web EFISHGENO...

La riqueza fenotípica de los peces débilmente eléctricos, junto con una reciente proliferación de recursos genómicos, motiva una fuerte necesidad de herramientas genómicas funcionales en el modelo de peces débilmente eléctricos. Este sistema es particularmente atractivo debido a la evolución convergente de numerosos rasgos fenotípicos en linajes paralelos de peces, que se mantienen fácilmente en el laboratorio.
El protocolo descrito aquí demuestra la eficacia de la técnica CRISPR/...

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común1,2,3.
Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnotiformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies, que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno ycomunicarse 4, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo1,5 ,6, sistemas y circuitos neurociencia7,8,9,10, fisiología celular11,12, ecología y energía13 ,14,15,16,17, comportamiento18,19, y macroevolución3,20,21 .
Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos, transcriptomicos y proteómicos para peces eléctricos1,22,23,24,25,26, 27,28. El uso de estos recursos ya ha producido importantes perspectivas sobre la conexión entre genotipo y fenotipo en estas especies1,2,3,28,29 ,30. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales31.
Una de estas herramientas es la técnica de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas recientemente desarrolladas junto con la técnica de endonucleasa Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición del genoma que ha entrado en uso generalizado tanto en los modelos32,33,34 y organismos no modelo35,36,37 por igual. La tecnología CRISPR/Cas9 ha progresado hasta un punto en el que un laboratorio capaz de la biología molecular básica puede generar fácilmente sondas específicas genéticas llamadas ARN de guía corta (SgRNAs), a un bajo costo utilizando un método de no clonación38. CRISPR tiene ventajas sobre otras estrategias de derribo/desaqueo, como morpholinos39,40, nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALENs), y nucleasas de dedos de zinc (ZFN), que son costosas y tiempo para generar para cada gen objetivo.
El sistema CRISPR/Cas9 funciona para crear nocauts genéticos apuntando a una región específica del genoma, dirigida por la secuencia sgRNA, y causando una rotura de doble cadena. La rotura de doble cadena es detectada por la célula y desencadena mecanismos endógenos de reparación del ADN preferentemente utilizando la vía de unión final no homóloga (NHEJ). Esta vía es altamente propensa a errores: durante el proceso de reparación, la molécula de ADN a menudo incorporará inserciones o deleciones (indels) en el sitio de rotura de doble cadena. Estos indels pueden resultar en una pérdida de la función debido a (1) cambios en el marco de lectura abierto, (2) inserción de un codón de parada prematura, o (3) cambios en la estructura primaria crítica del producto genético. En este protocolo, utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para apuntar mutaciones puntuales en genes diana utilizando el NHEJ en especies de peces débilmente eléctricos. Si bien es más simple y eficiente que otras técnicas, se espera que este método de mutagénesis resulte en una serie de severidades fenotípicas en F0,que se atribuye al mosaico genético41,42,43 ,44.
Selección de organismos Con el fin de facilitar futuros estudios sobre la genómica comparativa de los peces débilmente eléctricos, es necesario seleccionar una especie representativa tanto para gimnotiformes como mormyrids para el desarrollo de protocolos. Después de las discusiones durante la reunión de Pescado Eléctrico de 2016 en Montevideo, Uruguay, hubo consenso de la comunidad para utilizar especies que ya podían ser criadas en el laboratorio y que tenían recursos genómicos disponibles. El gymnotiform Brachyhypopomus gauderio y el mormyrid Brienomyrus brachyistius fueron seleccionados como especies que se ajustan a estos criterios. En ambas especies, las señales naturales para inducir y mantener las condiciones de reproducción son fáciles de imitar en cautiverio. B. gauderio,una especie gimnoiforme de América del Sur, tiene la ventaja de bajos requisitos de cría: los peces se pueden mantener a una densidad relativamente alta en tanques relativamente pequeños (4 L). B. gauderio también tiene una rápida rotación generacional en condiciones cautivas. En condiciones de laboratorio, B. gauderio puede desarrollarse de huevo a adulto en aproximadamente 4 meses.
B. brachyistius, una especie de pez mormirid de Africa Occidental-Central, se reproduce fácilmente en cautiverio. B. brachyistius está fácilmente disponible a través del comercio de acuarios, ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios, y ahora tiene una serie de recursos genómicos disponibles. Su ciclo de vida abarca entre 1 y 3 años, dependiendo de las condiciones de laboratorio. Los requisitos de cría son algo más intensivos para esta especie, requiriendo tanques de tamaño moderado (50-100 L) debido a su agresión durante la reproducción.
Los laboratorios que estudian otras especies de peces eléctricos deben ser capaces de adaptar fácilmente este protocolo siempre y cuando la especie pueda ser criada, y los embriones de una sola célula pueden ser recogidos y criados en la edad adulta. Las tasas de vivienda, cría larvaria y fertilización in vitro (FIV) probablemente cambiarán con otras especies; sin embargo, este protocolo puede ser utilizado como punto de partida para los intentos de cría en otros peces débilmente eléctricos.
Un objetivo gene ideal para la prueba de concepto: scn4aa Los peces mormyrid y gimnotiformo débilmente eléctricos generan campos eléctricos (electrogénesis) mediante la descarga de un órgano especializado, llamado órgano eléctrico. Las descargas de órganos eléctricos (EOD) son el resultado de la producción simultánea de potenciales de acción en las células de órganos eléctricos llamadas electrocitos. Los EOD son detectados por una serie de electrorreceptores en la piel para crear imágenes eléctricas de alta resolución del entorno de los peces45. Los peces débilmente eléctricos también son capaces de detectar características de las formas de onda EOD de sus conespecíficos18, así como sus velocidades de descarga46,lo que permite que los EODfunciones funcionen adicionalmente como una señal de comunicación social análoga al canto de los pájaros o ranas vocalizaciones47.
Un componente principal de la generación de potencial de acción en los electrocitos de peces débilmente eléctricos mormyrid y gymnotiform es el canal de sodio cerrado por tensión NaV1.42. Los teleosts no eléctricos expresan dos copias genéticas yólo, scn4aa y scn4ab,codificación para el canal de sodio cerrado con tensión NaV1.430. Tanto en los linajes de peces gimnotiformos como mormyrid débilmente eléctricos, scn4aa ha evolucionado rápidamente y ha sufrido numerosas sustituciones de aminoácidos que afectan a sus propiedades cinéticas48. Lo más importante es que la scn4aa se ha compartimentado en ambos linajes del órgano eléctrico2,3. La expresión relativamente restringida de scn4aa al órgano eléctrico, así como su papel clave en la generación de EODs, lo convierten en un objetivo ideal para los experimentos knockout de CRISPR/Cas9, ya que tiene efectos pleiotrópicos mínimamente nocivos. Debido a que los peces débilmente eléctricos comienzan a descargar sus órganos eléctricos larvales de 6 a 8 días después de la fertilización (DPF), la focalización de scn4aa es ideal para el fenotipado rápido después de la microinyección de embriones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Hay un sorprendente grado de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común. Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnoliformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y comunicarse, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo, los sistemas y circuitos de neurociencia, fisiología celular, ecología, biología evolutiva y comportamiento. Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos para los peces eléctricos. El uso de estos recursos ya ha facilitado importantes conocimientos con respecto a la conexión entre el genotipo y el fenotipo en estas especies. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales. Aquí informamos de un protocolo completo para la realización de mutagénesis CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos endógenos de reparación del ADN en peces débilmente eléctricos. Demostramos que este protocolo es igualmente eficaz tanto en la especie mormyrid Brienomyrus brachyistius como en el gymnotiform Brachyhypopomus gauderio mediante el uso de CRISPR/Cas9 para apuntar a indels y mutaciones puntuales en el primer exón de la canal de sodio scn4aa. Utilizando este protocolo, se obtuvieron embriones de ambas especies y se genotiparon para confirmar que las mutaciones pronosticadas en el primer exón del canal de sodio scn4aa estaban presentes. El fenotipo de éxito de knock-out se confirmó con grabaciones que muestran amplitudes de descarga de órganos eléctricos reducidas en comparación con los controles de tamaño no inyectados.

Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.
L...

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

La edición de genes CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos, particularmente en un contexto comparativo, permitirá a los investigadores probar hipótesis sobre cómo los genes específicos y la varianza genética contribuyen a la variación fenotípica. CRISPR/Cas9 es un método eficiente para generar embriones mutantes F-cero. Este protocolo permite a los investigadores llevar a cabo manipulaciones CRISPR-Cas9 en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.La clave para utilizar este enfoque con algunas modificaciones en otros peces eléctricos u otras especies de peces es la disponibilidad de recursos transcriptómicos o genómicos para hacer sgRNAs. Realizar las microinyeccións y visualizar las celdas en una ubicación 3D dentro de un plano 2D puede ser difícil. Obtener una pequeña colonia de peces cebra para que los huevos practiquen técnicas generales de microinyección.Demostrando el procedimiento con Savvas Constantinou estará Jared Thompson, un técnico de mi laboratorio. Después de albergar las especies de peces de interés en las condiciones de cría adecuadas, identifique los peces hembra que aparecen gravid. En B.gauderio, la hembra tendrá gónadas hinchadas a caudal hasta el respiradero.En B.brachyistius las hembras tendrán vientres hinchados y parecen de cuerpo profundo. Después de la administración de anestesia, agregue el agente de desove a cuatro veces el volumen de DPBS en un tubo de PCR con una mezcla completa. La solución se nublará.Utilice una pipeta para medir la dosis calculada y dispensar el agente diluido a una pieza de termoplástico antes de extraer la solución en una jeringa de vidrio de precisión equipada con una aguja biselada de 28 calibres de 19 a 25 mililitros de longitud. Inyecte la solución en el músculo dorsal del tronco a una velocidad suave y deje que la aguja se siente durante dos a cuatro segundos antes de la extracción. A continuación, coloque inmediatamente el pescado en agua fresca del sistema para su recuperación.Para la recolección de espermatozoides B.gauderio, después de 24 horas, seleccione un pez macho grande y lo más rápido posible después de la sedación, secar el pescado a fondo, especialmente alrededor de la cabeza y Vent. Coloque el pescado seco de lado ventral hacia arriba, antes a la izquierda en el soporte adecuado, cubierto en una toalla de papel húmeda empapada MS222 con la cabeza lo más paralela posible con la mesa. Aplicar inmediatamente presión en el caudal en dirección rostral con la luz apretando inmediatamente sobre las gónadas hacia la ventilación y usando un micropipetter con una punta, recoja cuidadosamente el esperma a medida que se exprime del macho en incrementos de 50 microlitros.Añadir alícuota de espermatozoides directamente en volúmenes de 500 microlitros de solución extensora de esperma en hielo. Inmediatamente después de la recolección, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba. Para la recolección de huevos B.gauderio, después de secar un pez hembra B.gauderio anestesiado, coloque inmediatamente el pez de lado con la cabeza mirando hacia la mano nonteminante y aplique presión en el caudal a la dirección rostral con ligero exprimido mediamente sobre las gónadas hacia el respiradero.Usando una herramienta de politetrafluoroetileno, recoja cuidadosamente los huevos a medida que se exprimen de la cloaca y coloque rápidamente los huevos en un pequeño plato de Petri cubierto. Si trabaja solo después de apretar, toque la masa de huevo a la base de la pequeña placa de Petri, ya que son expulsados de la hembra. Inmediatamente después de recoger los huevos, coloque el pescado en agua fresca tratada con el producto de protección de la piel de baba.Para la fertilización in vitro de B.gauderio, agregue 100 microlitros de la solución SES de espermatozoides bien mezclada directamente sobre la masa del óvulo, seguido de un mililitro de agua fresca del sistema. Mezcla bien la suspensión de los gametos durante 30 a 60 segundos antes de añadir de uno a dos mililitros adicionales de agua filtrada poro de 0,22 micrómetros a las células. Etiquete el plato con el tiempo de fertilización in vitro y coloque el plato en una incubadora de 29 grados Celsius, estableciendo un temporizador de 50 minutos para comprobar el progreso del desarrollo.Durante el período de fertilización, utilice una punta de pipeta de microcargador para cargar dos microlitros de la solución de inyección de interés en una aguja de microinyección y expulsar el líquido lo más cerca posible de la punta. Cuando una sola célula se haya formado en el polo animal de al menos una célula, transfiera el plato bajo un microscopio diseccionador y use un par de fórceps finos para romper la punta de la aguja en un ángulo biselado hacia donde el cónico de la aguja comienza a demostrar rigidez. El orificio de la aguja debe permanecer lo más pequeño posible mientras se mantiene un cónico rígido.Identifique los cigotos en desarrollo bajo el microscopio y utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para colocar de 10 a 20 huevos en la menor agua posible en el borde del portaobjetos del microscopio de vidrio establecido en la parte superior invertida de la placa Petri. Con una delicada toallita de tarea, presione suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua para permitir que los huevos se adhieran firmemente al borde del portaobjetos. El agua será perversa bajo el tobogán y tirará de los huevos contra el borde.Debe haber suficiente agua para mantener los huevos húmedos mientras se mantiene poca humedad de pie para evitar el movimiento del huevo durante la inyección. Alinee los huevos contra el portaobjetos verticalmente, perpendicular a la aguja que se aproxima, y utilice un micromaniprógrafo para colocar la aguja contra la tarea. Luego, sosteniendo la aguja en un ángulo de aproximadamente 45 grados, inserte la punta primero en la tarea y luego, en la sola celda, inyectando a través de la yema si es posible.Retire los huevos rotos durante la inyección con fórceps finos. Cuando se hayan inyectado todos los huevos, utilice una botella de chorro de agua filtrada del sistema de poro de 0,22 micrómetros para lavar suavemente los huevos de la etapa de inyección en un nuevo plato petri de 100 milímetros de diámetro. Después de una exitosa selección y síntesis de ARN de guía corta, el escote in vitro se puede probar para su selección de microinyeccións de una sola célula.Después de la limpieza y clonación de PCR, en este experimento representativo, se identificaron mutaciones inducidas por CRISPR-Cas9 en clones individuales de B.gauderio y B.brachyistius con una fuerte reducción de la amplitud de descarga de órganos eléctricos, mientras que los controles no inyectados solo mostraban genotipos de referencia. La visualización de la amplitud de descarga de órganos eléctricos entre los mutantes CRISPR confirmados y el tamaño del agente coincidió con los controles no inyectados demostró que tanto los embriones mutantes SCN-4 AA B.brachyistius como B.gauderio tenían amplitudes de descarga de órganos eléctricos significativamente más bajas que los controles. Al realizar las micro inyecciones, muévase lo más rápido y deliberadamente posible para maximizar el número de embriones inyectados de una sola célula que sobreviven.No pierda tiempo con huevos difíciles. Una vez identificados los mutantes exitosos, los métodos de reproducción tradicionales pueden crear líneas mutantes estables, que eliminan las preocupaciones de mosaico asociadas al CRSPR. Este protocolo permitirá a los investigadores realizar estudios genómicos comparativos con validación funcional en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Investigación

Biología

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital Inline holográfica Microscopía (MHDL) de sujetos débilmente dispersión de

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...