Name: silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Yazarlar Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud ve Hope Healey'in balık yetiştiriciliği, veri toplama ve erken protokol geliştirme konusunda yardımcı olmak için gösterdiği kahramanca çabaları kabul etmektedirler. Ayrıca üç yorumcuya da makaleye verdikleri öneriler için teşekkür ederiz. Biz nihai ürün yorumlarını ele sonra daha kaliteli olduğuna inanıyoruz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı #1644965 ve JRG #1455405 ve Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi DG hibe VLS desteği ile finanse edilmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. SGRNA Hedeflerinin Seçilmesi
NOT: Adım 1.1'de sgRNA'ların manuel tasarımı için bir protokol sağlanmıştır. Bu scn4aa hedef seçimi için kullanılmıştır. EFISHGENOMICS web portalı kullanılarak bu işlemi kolaylaştırmak için ek bir protokol (adım 1.2) sağlanmaktadır. Kullanıc...

Zayıf elektrikli balıkların fenotipik zenginliği, genomik kaynakların yakın zamanda çoğalması ile birlikte, zayıf elektrikli balık modelinde fonksiyonel genomik araçlara yönelik güçlü bir ihtiyacı motive eder. Bu sistem, laboratuvarda kolayca tutulan paralel balık soylarında çok sayıda fenotipik özelliğin yakınsak evrimi nedeniyle özellikle çekicidir.
Burada açıklanan protokol, CRISPR/Cas9 tekniğinin elektrogenez ve elektroalımı paralel olarak evrimleşen zayıf ...

Omurgalıların evrimsel tarihinde elektroresepsiyon ve elektrogenez değişmiştir. Teleost balık iki soy, osteoglossiformes ve siluriformes, paralel olarak elektroresepsiyon gelişti, ve teleostların beş lineages (gymnotiformes, mormyrids, ve cins Astroscopus, Malapterurus, ve Synodontis) paralel olarak gelişen elektrogenez. Ortak bir genetik mimari1,2,3paylaşan bu bağımsız olarak türetilmiş fenotipler, yakınsama çarpıcı bir derecesi vardır.
Bu belki de en iyi gymnotiforms ve mormyrids, üretmek ve zayıf elektrik alanları tespit ve zayıf elektrikli balık denir iki tür zengin teleost clades, sayısız yakınsak özellikleri ile örneklenir. 50 yıl içinde zayıf elektrik balık çevrelerini algılamak ve iletişim kurmak için elektrik kullanımı keşfinden bu yana4, bilim adamlarının büyüyen bir toplulukgelişme1,5 evrimi içine muazzam anlayışlar kazanmıştır ,6, sistemleri ve devrelerinörolojik 7,8,9,10, hücresel fizyoloji11,12, ekoloji ve enerji13 ,14,15,16,17, davranış18,19, ve makroevrim3,20,21 .
Daha yakın zamanda, elektrik balıkları için genomik, transkripsiyonik ve proteomik kaynakların çoğalması olmuştur1,22,23,24,25,26, 27,28. Bu kaynakların kullanımı zaten bu türlerde genotip ve fenotip arasındaki bağlantı ile ilgili önemli anlayışlar üretti1,2,3,28,29 ,30. Zayıf elektrikli balıkların henotik verileri ile genomik verilerin entegre edilmesinin önündeki en büyük engel, fonksiyonel genomik aletlerin mevcut eksikliğidir31.
Bu araçlardan biri, Cas9 endondüraz (CRISPR/Cas9, CRISPR) tekniği ile eşleştirilmiş son zamanlarda geliştirilen Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar'dır. CRISPR/Cas9 hem model32,33,34 hem de model olmayanorganizmalarda 35,36,37 hem de yaygın kullanıma girmiş bir genom düzenleme aracıdır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, temel moleküler biyoloji yeteneğine sahip bir laboratuvarın klonlamayan bir yöntemi kullanarak düşük maliyetle kısa kılavuz RNA (sgRNA) adı verilen genlere özgü probları kolayca üretebileceği bir noktaya gelmiştir38. CRISPR morpholinos39,40, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak çekirdekleri (ZFNs) gibi diğer nakavt / nakavt stratejileri, üzerinde avantajları vardır ve pahalı ve her hedef gen için üretmek için zaman alıcı.
CRISPR/Cas9 sistemi, genomun belirli bir bölgesini hedef alarak, sgRNA dizisi tarafından yönlendirilerek ve çift iplikli bir kopmaya neden olarak gen nakavtları oluşturmak için işlev görür. Çift iplikli kopma hücre tarafından tespit edilir ve homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yolu kullanılarak tercihen endojen DNA onarım mekanizmalarını tetikler. Bu yol son derece hata yatkındır: onarım işlemi sırasında, DNA molekülü genellikle çift iplikli mola yerinde eklemeler veya silmeler (indels) dahil edecektir. Bu indels ya (1) açık okuma çerçevesi vardiya, (2) erken stop codon ekleme veya (3) gen ürünün kritik birincil yapısında vardiya nedeniyle fonksiyon kaybına neden olabilir. Bu protokolde, zayıf elektrikli balık türlerinde NHEJ'yi kullanarak hedef genlerdeki nokta mutasyonlarını hedeflemek için CRISPR/Cas9 düzenlemesini kullanıyoruz. Diğer tekniklere göre daha basit ve daha verimli olsa da, bu mutagenez yönteminin genetik mozaisizme atfedilen F0'dabir dizi fenotipik şiddeti ile sonuçlanması beklenmektedir, bu da genetik mozailiğe atfedilir41,42,43 ,44.
Organizmaların Seçimi Zayıf elektrikli balıkların karşılaştırmalı genomikleri üzerinde gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak amacıyla, protokol gelişimi için hem gymnotiforms hem de mormyrids için temsili bir tür seçilmelidir. Uruguay'ın Montevideo kentinde düzenlenen 2016 Elektrikli Balık toplantısı nın ardından, laboratuvarda yetiştirilebilecek ve genomik kaynaklara sahip türleri kullanmak için topluluk konusunda fikir birliği sağlandı. Gymnotiform Brakihipopomus gauderio ve mormyrid Brienomyrus brachyistius bu kriterlere uygun türler olarak seçildi. Her iki türde de üreme koşullarını tetiklemek ve sürdürmek için doğal ipuçları esaret altında taklit etmek kolaydır. B. gauderio, Güney Amerika'dan bir gymnotiform türler, düşük hayvancılık gereksinimleri avantajı vardır: balık nispeten küçük (4 L) tanklarda nispeten yüksek yoğunlukta tutulabilir. B. gauderio da esir koşullar altında hızlı nesil cirosuvardır. Laboratuvar koşullarında, B. gauderio yaklaşık 4 ay içinde yumurtadan yetişkine gelişebilir.
B. Brachyistius, Batı-Orta Afrika mormyrid balık bir tür, kolayca esaret içinde ürerler. B. brachyistius akvaryum ticareti yoluyla kolayca kullanılabilir, yaygın birçok çalışmada kullanılmıştır, ve şimdi genomik kaynakların bir dizi mevcuttur. Yaşam döngüleri laboratuvar koşullarına bağlı olarak 1−3 yıl sürer. Hayvancılık gereksinimleri bu tür için biraz daha yoğundur ve üreme sırasındaki saldırganlıkları nedeniyle orta büyüklükte tanklara (50−100 L) ihtiyaç vardır.
Diğer elektrikli balık türlerini inceleyen laboratuvarlar, türler yetiştirilebildiği ve tek hücreli embriyoların toplanıp yetişkinliğe kadar yetiştirilebildiği sürece bu protokolü kolayca uyarlayabilmeli. Konut, larva yetiştiriciliği ve in vitro fertilizasyon (IVF) oranları diğer türler ile birlikte büyük olasılıkla değişecektir; ancak, bu protokol diğer zayıf elektrikli balıkların üreme girişimleri için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
Kavram Kanıtı için İdeal Bir Gen Hedefi: scn4aa Zayıf elektrikli mormyrid ve gymnotiform balık elektrik organı olarak adlandırılan özel bir organ, boşaltarak elektrik alanları (elektrogenez) oluşturmak. Elektrik organ deşarjları (EODs) elektrosit adı verilen elektrik organ hücrelerinde eylem potansiyellerinin eşzamanlı üretimi sonucu. EOD'ler, balığın çevresinin yüksek çözünürlüklü elektriksel görüntülerini oluşturmak için derideki bir dizi elektroreseptör tarafından tespit edilir45. Zayıf elektrikli balıklar da kendi conspecifics 'EOD dalga formları özellikleri tespit yeteneğine sahiptir18 yanı sıra deşarj oranları46, EODs kuş şarkısı veya kurbağa benzer bir sosyal iletişim sinyali olarak ek olarak çalışmasına izin vokalizasyon47.
Hem mormyrid ve gymnotiform zayıf elektrikli balık elektrositlerde eylem potansiyel nesil bir ana bileşeni voltaj kapılı sodyum kanalı NaV1.42. Elektrik olmayan teleosts iki paralogus gen kopyaları ifade, scn4aa ve scn4ab, voltaj kapılı sodyum kanalı NaV1.430için kodlama . Hem gymnotiform ve mormyrid zayıf elektrikli balık soyları, scn4aa hızla gelişti ve kinetik özelliklerini etkileyen çok sayıda amino asit ikameleri uğramıştır48. En önemlisi, scn4aa elektrik organı2,3her iki soy da bölümlere ayrılmıştır . Elektrik organına scn4aa nispeten sınırlı ifade, yanı sıra EODs üretiminde ki kilit rolü, CRISPR / Cas9 nakavt deneyleri için ideal bir hedef yapar, minimal zararlı pleiotropic etkileri olduğu gibi. Zayıf elektrikli balıklar larva elektrik organlarını 6−8 gün sonra döllenme (DPF) boşaltmaya başladıklarından, scn4aa'nın hedeflenmesi embriyo mikroenjeksiyonunu takiben hızlı fenotipleme için idealdir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 mg/mL RNA grade Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 bp DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL</td>
			<td>PNA Biology</td>
			<td>CP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10289651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-824-654</td>
			<td>referred to as &#34;precision glass syringe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>referred to as &#34;delicate task wipe&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>used for in vitro cleavage assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq DNA kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovaprim</td>
			<td>Syndel USA</td>
			<td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td>
			<td>referred to as &#34;spawning agent&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td>referred to as &#34;thermoplastic&#34; in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SU-P97</td>
			<td>sutter brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable needle- requires customization</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7803-02</td>
			<td>Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203L</td>
			<td>Use with the 10X NEB buffer that is included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coated tools</td>
			<td>bonefolder.com</td>
			<td>T-SPATULA4PIECE</td>
			<td>referred to as &#34;polytetrafluoroethene&#34; in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silencing the spark: crispr/cas9 genome editing in weakly electric fish

Omurgalıların evrimsel tarihinde elektroresepsiyon ve elektrogenez değişmiştir. Ortak bir genetik mimariyi paylaşan bu bağımsız olarak elde edilen fenotiplerde çarpıcı bir yakınsama derecesi vardır. Bu belki de en iyi gymnotiforms ve mormyrids, üretmek ve zayıf elektrik alanları tespit ve zayıf elektrikli balık denir iki tür zengin teleost clades sayısız yakınsak özellikleri ile örneklenir. Zayıf elektrikli balıkların çevrelerini algılamak ve iletişim kurmak için elektriği kullandıklarının keşfinden bu yana geçen 50 yıl içinde, büyüyen bir bilim adamı topluluğu, gelişim, sistem ve devrelerin nörolojisinin evrimi hakkında muazzam bir içgörü kazandı. hücresel fizyoloji, ekoloji, evrimsel biyoloji ve davranış. Daha yakın zamanlarda, elektrikli balıklar için genomik kaynakların çoğalması olmuştur. Bu kaynakların kullanımı zaten bu türlerde genotip ve fenotip arasındaki bağlantı ile ilgili önemli anlayışlar kolaylaştırmıştır. Genomik verilerin zayıf elektrikli balıkların henotik verileriyle bütünleştirilmesinin önündeki en büyük engel, mevcut fonksiyonel genomik araçlarının eksikliğidir. Burada zayıf elektrikli balıklarda endojen DNA onarım mekanizmaları kullanan CRISPR/Cas9 mutagenezinin icrası için tam bir protokol sunacağız. Bu protokolün hem mormyrid türü Brienomyrus brachyistius hem de gymnotiform Brakihypopomus gauderio'da CRISPR/Cas9 kullanarak indels ve nokta mutasyonlarını hedef alarak eşit derecede etkili olduğunu gösteriyoruz. sodyum kanal gen scn4aa. Bu protokol kullanılarak, her iki türden de embriyolar elde edildi ve scn4aa sodyum kanalının ilk eksonlarında öngörülen mutasyonların mevcut olduğunu doğrulamak için genotiplendi. Nakavt başarı fenotip enjekte edilmemiş boyut eşleşen kontroller ile karşılaştırıldığında azaltılmış elektrik organı deşarj genlikleri gösteren kayıtları ile doğrulandı.

SGRNA hedef bölgeleri Bölüm 1'de açıklandığı gibi Hem B. gauderio hem de B. brachyistius'ta scn4aa'nın eksex 1'inde tanımlanmıştır. SGRNA'lar Bölüm 2'de açıklandığı şekilde oluşturuldu. Başarılı sgRNA seçimi ve sentezinden sonra(Şekil 1),in vitro dekolte test edildi (Şekil 2). İn vitro kesim gösteren sgRNA'lar daha sonra tek hücreli mikroenjeksiyonlar için seçildi.
Erişkin b...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish at JoVE.com

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Burada CRISPR/Cas9 genom nakavt elektrikli balık üretimi ve arkası için bir protokol sunulmuştur. Ayrıntılı olarak özetlenen bir gymnotiform ve mormyrid hem de gerekli moleküler biyoloji, Üreme ve hayvancılık gereksinimleri ve cas9 indel F0 larvaları üretmek için enjeksiyon teknikleri vardır.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi zayıf elektrikli balıklarda, özellikle karşılaştırmalı bir bağlamda, araştırmacıların belirli genlerin ve genetik varyansın henotik varyasyona nasıl katkıda bulunacağı konusunda hipotezleri test etmelerini sağlayacaktır. CRISPR/Cas9 mutant F-zero embriyoları üretmek için etkili bir yöntemdir. Bu protokol, araştırmacıların zayıf elektrikli balıkların yakınsavetle evrimleşmiş iki türünde CRISPR-Cas9 manipülasyonları yapmalarına olanak tanır.Diğer elektrikli balık veya diğer balık türlerinde bazı değişiklikler ile bu yaklaşımı kullanmanın anahtarı sgRNA yapmak için transkripsiyonik veya genomik kaynakların kullanılabilirliğidir. Mikroenjeksiyonları gerçekleştirmek ve hücreleri 2B düzlemiçinde 3Boyutlu bir yerde görselleştirmek zor olabilir. Genel mikroenjeksiyon teknikleri uygulamak için yumurta için küçük bir zebra balığı kolonisi edinin.Savvas Constantinou ile prosedürü göstermek Jared Thompson, benim laboratuvar bir teknisyen olacak. Uygun üreme koşulları altında ilgi balık türlerinin barınma sonra, gravid görünen dişi balık tanımlayın. B.gauderio'da dişinin sadece havalandırmaya kadar kaudal olan gonadları şişmiş olacak.B.brachyistius'ta dişiler karınları şişmiş ve derin vücutlu görünürler. Anestezi uygulandıktan sonra, tam karıştırma ile bir PCR tüp dpbs hacmi dört kat yumurtlama ajan ekleyin. Çözüm bulutlu olacak.Hesaplanan dozu ölçmek için bir pipet kullanın ve 28-gauge 19-25 mililitre uzunluğunda beveled iğne ile donatılmış hassas bir cam şırınga içine çözelti çekmeden önce termoplastik bir parça içine seyreltilmiş ajan dağıtmak. Pürüzsüz bir oranda dorsal gövde kas içine solüsyon enjekte ve iğne çıkarmadan önce iki ila dört saniye oturup sağlar. Sonra, hemen kurtarma için tatlı sistem su içine balık yerleştirin.B.gauderio sperm toplama için, 24 saat sonra, büyük bir erkek balık seçin ve sedasyon sonra mümkün olduğunca çabuk, iyice balık kuru, özellikle baş ve Vent etrafında. Kurutulmuş balık ventral tarafı yukarı yerleştirin, uygun tutucu sola, mümkün olduğunca masaya paralel olarak baş ile bir MS222 ıslatılmış nemli kağıt havlu kaplı. Hemen kaudal yönde ışık hemen deliğe doğru gonadlar üzerinde sıkma ve bir ucu ile bir mikropipet kullanarak rostral yönde basınç uygulayın, dikkatle 50 mikrolitrelik artışlarla erkek ten sıkılır gibi sperm toplamak.Buz üzerinde sperm genişletici çözelti500 mikrolitre hacimleri üzerine doğrudan sperm aliquot ekleyin. Toplama hemen sonra, balçık kat koruma ürün arıtılmış tatlı sistem suyu içine balık yerleştirin. B.gauderio yumurta toplama için, bir anestezi B.gauderio dişi balık kuruduktan sonra, hemen başı baskın olmayan ele bakan kendi tarafına balık yerleştirin ve ışık havalandırma doğru gondadlar üzerinde medily sıkma ile rostral yönde kaudal yönde basınç uygulayın.Bir politetrafloroetilen aracı kullanarak, cloaca'dan sıkılırken yumurtaları dikkatlice toplayın ve yumurtaları hızlı bir şekilde küçük bir kapalı Petri kabına yerleştirin. Sıkma sonra tek başına çalışıyorsanız, onlar dişi den atılır gibi küçük Petri çanak tabanına yumurta kütlesi dokunun. Yumurtaları topladıktan hemen sonra, balığı balçık koruma ürünü arıtılmış tatlı sistem suyuna yerleştirin.B.gauderio in vitro fertilizasyon için, iyi karışık sperm SES çözeltisi doğrudan yumurta kütlesi üzerine 100 mikrolitre ekleyin, tatlı sistem suyu bir mililitre takip. Hücrelere 0,22 mikrometrelik gözenek filtrelenmiş sistem suyu ek bir ila iki mililitre eklemeden önce 30 ila 60 saniye boyunca gamet süspansiyon iyice karıştırın. Yemeği in vitro fertilizasyon süresiyle etiketleyin ve yemeği 29 derecelik bir kantine yerleştirin ve gelişmenin ilerlemesini kontrol etmek için 50 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın.Döllenme süresi boyunca, bir mikroenjeksiyon iğnesine ilgi çeken enjeksiyon çözeltisinin iki mikrolitresini geri yüklemek ve sıvıyı ucuna mümkün olduğunca yakın çıkarmak için bir mikroyükleyici pipet ucu kullanın. En az bir hücrenin hayvan direğinde tek bir hücre oluştuğunda, bir kesme mikroskobu altında çanak aktarın ve iğne konik sertlik göstermeye başlar doğru eğimli bir açıyla iğne ucu kırmak için ince forseps bir çift kullanın. İğnenin deliği sert bir konik korurken mümkün olduğunca küçük kalmalıdır.Mikroskop altında gelişmekte olan zigotları belirleyin ve petri kabının ters üst kısmında ki cam mikroskop kaydırağının kenarına mümkün olduğunca az suya 10 ila 20 yumurta yerleştirmek için kesik uçlu plastik bir transfer pipetkullanın. Hassas bir görev silme kullanarak, yumurtaların sakaya sıkıca yapışmasını sağlamak için fazla suyu çıkarmak için kaydırağa hafifçe basın. Su kaydırak altında kötü olacak ve kenarına karşı yumurta çekin.Enjeksiyon sırasında yumurta hareketini önlemek için az ayakta nem korurken yumurta nemli tutmak için yeterli su olmalıdır. Yumurtaları yaklaşan iğneye dik olarak dikey olarak kaydırağa doğru hizala ve iğneyi korrion'a karşı konumlandırmak için bir mikromanipülatör kullanın. Daha sonra, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla iğnetutarak, kolion içine ilk ucu takın ve daha sonra, tek bir hücreiçine, mümkünse sarısı ile enjekte.İnce forceps ile enjeksiyon sırasında herhangi bir kırık yumurta çıkarın. Tüm yumurtalar enjekte edildiğinde, yumurtaları enjeksiyon aşamasından 100 milimetre çapındaki yeni bir Petri kabına yavaşça atmak için 0,22 mikrometrelik gözenek filtrelenmiş sistem suyundan oluşan bir fışkırtma şişesi kullanın. Başarılı bir kısa kılavuz RNA seçimi ve sentezinden sonra, in vitro dekolte tek hücreli mikroenjeksiyonlar için seçim için test edilebilir.PCR temizliği ve klonlama dan sonra, bu temsili deneyde, CRISPR-Cas9 indüklenen mutasyonlar bireysel B.gauderio ve B.brachyistius klonlar güçlü elektrik organ deşarj genlik azaltma ile tespit edildi, enjekte edilmemiş kontroller ise sadece başvurulan genotipler görüntülenir. Doğrulanmış CRISPR mutantları ile ajan boyutu eşleşen enjekte edilmemiş kontroller arasındaki elektrik organı deşarj genliğini görselleştirmesi, hem SCN-4 AA mutant B.brachyistius hem de B.gauderio embriyolarının kontrollerden önemli ölçüde daha düşük elektrik organı deşarj genliklerine sahip olduğunu göstermiştir. Mikro enjeksiyonları yaparken, hayatta tek hücreli enjekte embriyoların sayısını maksimize etmek için mümkün olduğunca hızlı ve kasıtlı olarak hareket.Zor yumurtaile zaman kaybetmeyin. Başarılı mutantlar tespit edildikten sonra, geleneksel üreme yöntemleri CRSPR ilişkili mozaik endişeleri ortadan kaldırmak istikrarlı mutant hatları oluşturabilirsiniz. Bu protokol, araştırmacıların, zayıf elektrik balıklarının yakınsazik olarak evrimleşmiş iki türünde fonksiyonel doğrulama ile karşılaştırmalı genomik çalışmalar yapmalarına olanak sağlayacaktır.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Biyoloji

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Zayıf-saçılma Konular Dijital Inline Holografik Mikroskop (DIHM)

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...