Name: live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

DLM wordt ondersteund door een NSF GRFP. ALM wordt ondersteund door financiering uit de Smith Family Award for Excellence in biomedisch onderzoek.

1. opwekking van hTERT-RPE-1 cellen die op rendabele wijze RFP-histone 2B (RFP-H2B) en α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) uitdrukken
Opmerking: alle stappen volgen aseptische technieken en vinden plaats in een veiligheidskast van bioveiligheid Level II + (BSL2 +).
<ol><li>Genereer retrovirus met de genen van belang (α-tubulin-EGFP en RFP-H2B) door de transfectie van 293T cellen met de juiste linvirale plasmiden volgens de instructies van de fabrikant van het op lipide gebaseerde transfectie-toedien...

<ol>
	<li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage.">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li><li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis.">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491 (2016).</li><li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint.">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li><li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells.">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes &amp; Development. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer.">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li><li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies:+where+they+stand.">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).</li><li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+into+Focus:+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization.">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li><li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification.">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li><li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes,+chromosome+instability+(CIN)+and+aneuploidy.">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li><li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer.">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li><li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes.">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li><li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer.">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li><li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+centrosomal+kinase,+AIR-1,+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos.">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li><li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces.">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131 (2011).</li><li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers.">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li><li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+clustering+and+chromosomal+(in)stability:+a+matter+of+life+and+death.">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells.">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564 (2009).</li><li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+aberrations:+cause+or+consequence+of+cancer+progression?.">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?.</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li><li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering.">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li></ol>

De tijdelijke resolutie die wordt geleverd door de time-lapse Imaging zorgt voor de visualisatie en beoordeling van sequentiële cellulaire gebeurtenissen binnen enkele cellen. Benaderingen die gebruikmaken van cellulaire synchronisatie gevolgd door het verzamelen en fixeren van cellen op opeenvolgende tijdstippen zijn beperkt in die vergelijkingen worden uiteindelijk gemaakt tussen populaties van cellen. In contexten waar de cellulaire respons op verstoringen niet uniform kan zijn, of waar het proces dat wordt gevisuali...

Op afbeeldingen gebaseerde analyse van vaste cellen wordt vaak gebruikt om de celpopulatie veranderingen te beoordelen in reactie op verschillende verstoringen. In combinatie met celsynchronisatie, gevolgd door de verzameling en imaging van seriële tijdpunten, kunnen dergelijke benaderingen worden gebruikt om een cellulaire opeenvolging van gebeurtenissen voor te stellen. Niettemin, vaste celbeeldvorming is beperkt in die tijdelijke relaties worden geïmpliceerd voor een populatie en niet aangetoond op het niveau van individuele cellen. Op deze manier, terwijl vaste celbeeldvorming en-analyse voldoende zijn om robuuste fenotypes en steady-state veranderingen te observeren, is de mogelijkheid om voorbijgaande veranderingen na verloop van tijd te detecteren en veranderingen die alleen een subpopulatie van de cellen beïnvloeden, onvolmaakt. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire en subcellulaire processen binnen een enkele cel of cellulaire populatie te observeren, na verloop van tijd en zonder de hulp van synchronisatie benaderingen die zelf invloed kunnen hebben op cellulair gedrag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
De vorming van een bipolaire mitotische spil is essentieel voor de juiste chromosoomsegregatie tijdens celdeling, resulterend in twee genetisch identieke dochtercellen. Defecten in de mitotische spil structuur die corrupte mitotische progressie en het compromitteren van de getrouwheid van chromosoomsegregatie kan resulteren in catastrofale celsplitsingen en verminderde levensvatbaarheid van de cel. Om deze reden, mitotische gifstoffen die spindel vorming veranderen zijn veelbelovende Therapeutics om de snelle proliferatie van kankercellen7,8,9te beperken. Niettemin, vaste celanalyse van spil structuur na de toevoeging van mitotische gifstoffen is beperkt in zijn vermogen om het dynamische proces van spindel vorming te beoordelen en kan niet aangeven of waargenomen veranderingen in spil structuur permanent zijn of in plaats van voorbijgaande en kan worden overwonnen om succesvolle celdeling toe te staan.
In dit protocol beschrijven we een benadering voor het beoordelen van de dynamiek van mitose na spindle-perturbaties door Live-celbeeldvorming. Met behulp van de htert vereeuwigd RPE-1 cellijn ontworpen om een RFP-Tagged histone 2b uit te drukken om chromatine te visualiseren, samen met een met EGFP gelabelde α-tubuline om microtubuli te visualiseren, de timing van metafase-chromosoom uitlijning, anafhase aanvang, en uiteindelijk het lot van de mitotische cellen wordt beoordeeld aan de hand van visuele aanwijzingen van chromosoom beweging, verdichting en nucleaire morfologie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>25-510</td>
			<td>A serine protease used to release adherent cells from culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml centrifuge tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Fluor objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For use in retroviral transfection; used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-tubulin-EGFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alisertib</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C02</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>For use in cell culture and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49005</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable glass Pastuer pipets, sterilized&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For use in aspirating cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>10438-026</td>
			<td>Cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and p3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi well Tissue Culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>various</td>
			<td>for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements HC&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.51</td>
			<td>Image acquisition and analysis software; used in sections 3 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotic used in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate bufferred saline (PBS)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBP06-10X1LT</td>
			<td>sterile saline solution for use with cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP- Histone 2B (H2B)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Max</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td>Human retinal pigment epithelial cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100x20mm</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353003</td>
			<td>for use in culturing adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations

Live Cell time-lapse Imaging is een belangrijk hulpmiddel in celbiologie dat inzicht geeft in cellulaire processen die anders zouden kunnen worden vergeten, verkeerd begrepen of verkeerd geïnterpreteerd door de analyse van de vaste cel. Hoewel de vaste celbeeldvorming en-analyse robuust en voldoende zijn om cellulaire stationaire toestand te observeren, kan deze worden beperkt bij het definiëren van een tijdelijke volgorde van gebeurtenissen op cellulair niveau en is slecht uitgerust om de voorbijgaande aard van dynamische processen te beoordelen, waaronder mitotische progressie. Live-celbeeldvorming daarentegen is een welsprekend hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulaire processen in de loop van de tijd op het eencellige niveau te observeren en heeft de capaciteit om de dynamiek van processen vast te leggen die anders slecht zouden worden weergegeven in vaste celbeeldvorming. Hier beschrijven we een aanpak voor het genereren van cellen die fluorescentisch gelabelde markers van chromatine en microtubuli dragen en hun gebruik in Live Cell Imaging benaderingen om de metafase-chromosoom uitlijning en de mitotische uitgang te bewaken. We beschrijven Imaging-gebaseerde technieken om de dynamiek van spil vorming en mitotische progressie te beoordelen, inclusief de identificatie van cellen in verschillende stadia in mitose, identificatie en tracking van mitotische defecten, en analyse van spil dynamiek en mitotische cel lot na de behandeling met mitotische remmers.

Beoordeling van de mitotische progressie in de aanwezigheid van spil perturbaties De regulering van spil paal focus is een essentiële stap in de juiste bipolaire spindel vorming. Verstoring in dit proces door eiwit depletie, remming van de drug, of wijzigingen in centrosoom aantal corrupte spil structuur en vertragen of stoppen mitotische progressie10,11,12,<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Live celbeeldvorming maakt het mogelijk om dynamische cellulaire processen na verloop van tijd in één cel te observeren. Deze benaderingen zijn krachtig voor het beoordelen van de omstandigheden die van invloed zijn op het dynamische proces van celdeling en het onthullen van de effecten die defecten in mitose hebben op de proliferatie en levensvatbaarheid van dochtercellen. Fototoxiciteit die het gevolg is van blootstelling aan licht tijdens beeldvorming is een belangrijke uitdaging in verband met dit protocol.Daarom moeten de belichtingstijden en het beeldinterval en -duur worden geoptimaliseerd. Met behulp van aseptische techniek en een bioveiligheid niveau twee veiligheidskast, gebruik maken van een steriel wegwerpglas Pasteur pipet om het medium aan te trekken uit de kweekplaat met de cellijn die de uitdrukking constructie van belang. Was de cellen kort met 10 milliliter steriele PBS met wervelende en behandel de cellen met twee milliliter van 0,05% trypsine.Voeg na twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius acht milliliter vers medium aan de plaat toe om de reactie te stoppen en de losgemaakte cellen opnieuw op te zetten met zachte pipetting. Breng de celoplossing over naar een steriele buis van 15 milliliter en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Resuspend de pellet in 10 milliliter PBS en centrifugeren de cellen opnieuw.Resuspend de pellet in 10 milliliter medium voor het tellen en verdunnen van de cellen tot een een tot twee keer 10 tot de 5e cellen per milliliter van de celcultuur gemiddelde concentratie. Zaad vervolgens 500 microliter cellen in elke put van een steriele 12-well imaging bodemplaat en plaats de plaat in de celcultuur incubator om de cellen te houden aan het oppervlak van de plaat. Niet meer dan 30 minuten voor beeldvorming, voeg een relevante concentratie van een mitotische drug toe aan een of meer van de putten en voeg een gelijk volume van het remmerverwijding toe aan hetzelfde aantal putten als de controles.Om de microscoop voor te bereiden op beeldvorming, plaats de plaat op het stadium van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge resolutie camera, een milieukamer voorverwarmd tot 37 graden Celsius en een leveringssysteem voor bevochtigde 5%kooldioxide. Selecteer een 20 keer luchtdoelstelling met een numeriek diafragma van 0,5 en uitgerust voor het contrastrijke fluorescentie- en fasecontrast, of heldere veldbeeldvorming en bekijk de cellen om de cursus aan te passen en focus te vinden om cellen in beeld te brengen. Als u de optimale belichtingstijden wilt instellen voor heldere veld-, GFP- en RFP-afbeeldingsverwerving, selecteert u de respectievelijke filterkubussen met de juiste excitatie en emissie voor de fluorofooren die worden afgebeeld en klikt u op Afspelen.Als het signaal niet intensief genoeg is, past u de automatische belichting aan en selecteert u in elk fluorofofkanaal de juiste binning in het vervolgkeuzemenu Opmaak. Selecteer en kalibreer de microscoop fase aan de multi-well schotel volgens de instructies van de fabrikant en gebruik de beeldacquisitie software te markeren of anderszins selecteer de putten die zullen worden afgebeeld. Open het besturingselementpaneel gegenereerde punten en selecteer Onder Werkgebied Beperkt en Grens om het coördinatenselectiegebied te beperken om de grenzen van de put uit te sluiten.Selecteer in het vervolgkeuzemenu Gebiedsbeperking de optie Hele ruimte en selecteer een willekeurige puntplaatsing. Stel het aantal in op zes en klik op Randomize om het aantal en de verdeling van de punten te selecteren die per put moeten worden vastgelegd. Klik vervolgens op en voer de waarden in het controlepaneel van de tijdreeks in om het tijdsinterval en de duur voor het verzamelen van de afbeeldingen te selecteren en in te voeren.Als u de RFP-H2B-gelabelde chromatine wilt visualiseren, selecteert u de afbeeldingen die zijn vastgelegd met de RFP-filterkubus op zijn plaats en identificeert u een cel die mitose invoert, zoals aangegeven door de initiële chromatineverdichting en kerncentpeverdeling om de mitotische timing van de metafase-uitlijning en het begin van de anafase in afzonderlijke cellen te bepalen. Volg de cel van belang door opeenvolgende tijdstippen in de verkregen film om het aantal tijdpunten of minuten te bepalen van mitotische invoer totdat RFP-H2B-gelabelde chromatine de uitlijning op de celevenaar tijdens de metafase voltooit. Om de mitotische timing, mitotische trouw, en cel lot te controleren, blijven de cel te volgen door middel van opeenvolgende tijdstippen om de tijd coördinaat waarop anafase chromosoom segregatie is duidelijk en / of wanneer chromatine decompaction en nucleaire envelop reformatie heeft plaatsgevonden te identificeren.Visualiseer vervolgens RFP-H2B om cellen in elke populatie te identificeren die mitotische defecten vertonen, waaronder achterblijvende chromosomen en chromatinebruggen tijdens de scheiding van anafasechromosoom. Door het visualiseren van alpha tubulin-EGFP, kan worden opgemerkt dat cellen die zinsverdeling verstoring ervaring ondergaan dynamische veranderingen als spindel pull focus wordt bereikt en een bipolaire mitotische spindel wordt gevormd ter voorbereiding van celdeling. Gelijktijdig met spindelassemblage kan chromosoombeweging worden gevisualiseerd met RFP-H2B om de chromosoomuitlijning en segregatietrouw te beoordelen.Met behulp van live celbeeldvorming benaderingen, deze representatieve resultaten tonen aan dat cellen met een normale centrosome inhoud in staat zijn om verder te gaan van nucleaire envelop afbraak door middel van metafase uitlijning en anafase begin om een bipolaire verdeling te bereiken in minder dan 30 minuten. In aanwezigheid van extra centrosomen is bijna 50% van de cellen in staat om een voorbijgaande multipolaire mitotische spindel te overwinnen en een bipolaire as te vormen in volledige celdeling. De resterende cellen zijn niet in staat om een bipolaire spindel te bereiken en als gevolg daarvan, exit mitose door middel van een multipolaire verdeling.Ongeacht of spindelbipolaireiteit wordt bereikt, vertonen cellen met extra centrosomen een aanzienlijk verhoogde duur van mitose in vergelijking met cellen met twee centrosomen. Wat aangeeft dat de dynamiek van mitotische progressie kan worden gewijzigd, zelfs wanneer veranderingen in de mitotische uitkomst niet zichtbaar zijn. Bij het definiëren van belichtingstijden voor fluorescerende kanalen, optimaliseert u de belichtingstijden om de fototoxiciteit te beperken.Ook camera pixel binning kan worden geselecteerd om lagere belichtingstijden te gebruiken. Deze procedure heeft toepassingen in farmacologische screenings, invasie, en migratie analyse. Deze benaderingen kunnen ook worden gebruikt om de werkzaamheid van medicamenteuze behandelingen of de dynamiek van cellulaire beweeglijkheid te onderzoeken.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...