Name: live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

DLM은 NSF GRFP에서 지원됩니다. ALM은 생물 의학 연구에 있는 우수성을 위한 스미스 가족 상에서 자금조달에 의해 지원됩니다.

1. 안정적으로 발현RFP-히스톤 2B (RFP-H2B) 및 α-tubulin-EGFP (욕조-EGFP)를 발현하는 hTERT-RPE-1 세포의 생성
참고: 모든 단계는 무균 기술을 따르고 생체 안전 수준 II+(BSL2+) 안전 캐비닛에서 진행됩니다.
<ol><li>지질계 형혈 전달 시스템의 제조사의 지시에 따라 적절한 렌티바이러스 플라스미드를 가진 293T 세포의 형질감염에 의해 관심 있는 유전자(α-tubulin-EGFP 및 RFP-H2B)를 운반하는 레?...

<ol>
	<li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage.">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li><li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis.">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491 (2016).</li><li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint.">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li><li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells.">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes &amp; Development. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer.">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li><li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies:+where+they+stand.">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).</li><li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+into+Focus:+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization.">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li><li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification.">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li><li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes,+chromosome+instability+(CIN)+and+aneuploidy.">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li><li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer.">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li><li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes.">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li><li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer.">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li><li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+centrosomal+kinase,+AIR-1,+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos.">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li><li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces.">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131 (2011).</li><li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers.">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li><li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+clustering+and+chromosomal+(in)stability:+a+matter+of+life+and+death.">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells.">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564 (2009).</li><li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+aberrations:+cause+or+consequence+of+cancer+progression?.">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?.</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li><li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering.">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li></ol>

타임랩스 이미징에 의해 제공되는 시간적 해상도는 단일 세포 내에서 순차적 세포 이벤트의 시각화 및 평가를 가능하게 합니다. 순차적 시점에서 세포의 수집 및 고정에 이어 세포 동기화를 사용하는 접근법은 궁극적으로 세포의 집단 간에 비교가 이루어진다는 점에서 제한적입니다. 섭동에 대한 세포 반응이 균일하지 않거나 시각화되는 프로세스가 동적인 상황에서, 라이브 셀 타임랩스 이미징...

고정 된 세포의 이미지 기반 분석은 일반적으로 다양한 섭동에 반응하여 세포 집단 수준 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 동기화와 결합된 다음 직렬 시간 포인트의 수집 및 이미징을 수행하면 이러한 접근법을 사용하여 이벤트의 셀룰러 서열을 제안할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 고정된 세포 화상 진찰은 시간적인 관계가 인구를 위해 암시되고 개별 적인 세포의 수준에서 설명되지 않는다는 점에서 제한됩니다. 이런 식으로 고정 된 세포 이미징 및 분석은 강력한 표현형 및 정상 상태 변화를 관찰하기에 충분하지만 시간이 지남에 따라 일시적인 변화를 감지하고 세포의 하위 모집단에만 영향을 미치는 변화는 불완전합니다. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 단 하나 세포 내의 세포 및 세포 소 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있는 웅변 공구, 또는 셀 방식 인구, 시간이 지남에 따라 그리고 그 자체가 세포 행동에 영향을 미칠 수 있는 동기화 접근의 원조 없이 1개 , 2개 , 3개 , 4개 , 5개 , 6.
양극성 유사분열 스핀들의 형성은 세포 분열 동안 적절한 염색체 분리에 필수적이며, 그 결과 두 개의 유전적으로 동일한 딸 세포가 생성됩니다. 유사분열 성 진행을 손상시키고 염색체 분리의 충실도를 손상시키는 유사분열 스핀들 구조의 결함은 치명적인 세포 분열과 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 스핀들 형성을 변화시키는 유사분열 독은암세포의급속한 증식을 제한하는 유망한 치료법7,8,9. 그럼에도 불구하고, 유사분열 독의 첨가에 따른 스핀들 구조의 고정 세포 분석은 스핀들 형성의 동적 과정을 평가하는 능력에 제한이 있으며, 스핀들 구조의 관찰된 변화가 영구적인지 또는 대신 일시적이며 성공적인 세포 분열을 허용하기 위해 극복 될 수있다.
이 프로토콜에서는, 우리는 살아있는 세포 화상 진찰에 의하여 스핀들 섭동을 따르는 유사분열의 역학을 평가하기 위하여 접근을 기술합니다. RFP 태그가 달린 히스톤 2B를 발현하기 위해 설계된 hTERT 불멸형 RPE-1 세포주를 사용하여 염색질을 시각화하고, EGFP 태그가 달린 α-tubulin과 함께 미세관을 시각화하고, 메타페이즈 염색체 정렬, 아나페이즈 발병의 타이밍을 시각화하고, 궁극적으로 유사분열 세포 운명은 염색체 운동, 다짐 및 핵 형태학의 시각적 단서를 사용하여 평가됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>25-510</td>
			<td>A serine protease used to release adherent cells from culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml centrifuge tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Fluor objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For use in retroviral transfection; used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-tubulin-EGFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alisertib</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C02</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>For use in cell culture and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49005</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable glass Pastuer pipets, sterilized&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For use in aspirating cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>10438-026</td>
			<td>Cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and p3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi well Tissue Culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>various</td>
			<td>for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements HC&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.51</td>
			<td>Image acquisition and analysis software; used in sections 3 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotic used in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate bufferred saline (PBS)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBP06-10X1LT</td>
			<td>sterile saline solution for use with cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP- Histone 2B (H2B)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Max</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td>Human retinal pigment epithelial cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100x20mm</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353003</td>
			<td>for use in culturing adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations

살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 그렇지 않으면 간과될 지도 모르다 세포 프로세스에 통찰력을 제공하는 세포 생물학에 있는 중요한 공구, 오해, 또는 고정세포 분석에 의해 오해될 수 있습니다. 고정 된 세포 이미징 및 분석은 세포 정상 상태를 관찰하기에 강력하고 충분하지만 세포 수준에서 이벤트의 시간적 순서를 정의하는 데 제한 될 수 있으며 다음과 같은 동적 프로세스의 일시적인 특성을 평가하기에 적합하지 않습니다. 유사 분열. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 셀 방식 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있고 그렇지 않으면 고정된 세포 화상 진찰에서 제대로 표현될 프로세스의 역학을 붙잡기 위하여 능력을 가지고 있는 웅변공구입니다. 여기에서 우리는 염색체와 microtubules의 형광표지마커및 살아있는 세포 화상 진찰 접근에 있는 그들의 사용을 운반하는 세포를 생성하는 접근을 메타페이즈 염색체 정렬 및 유사분열 출구를 감시하기 위하여 기술합니다. 우리는 유사분열의 다양한 단계에서 세포의 식별, 유사분열 결함의 식별 및 추적, 스핀들 역학의 분석을 포함하여 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 이미징 기반 기술을 설명하고, 유사분열 억제제로 치료 한 후 유사 분열 세포 운명.

스핀들 교란이 있는 유사분열 진행평가 스핀들 폴 포커싱의 조절은 적절한 양극성 스핀들 형성에 필수적인 단계입니다. 이러한 과정에서 단백질 고갈, 약물 억제, 또는 중추의 변화로 인한 변형이 손상된 스핀들 구조및 미토화 진행을 지연 또는중단(10,11,12,13)등으로 한...

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Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

라이브 세포 이미징은 단일 세포 내에서 시간이 지남에 따라 동적 세포 프로세스를 관찰할 수 있습니다. 이 접근은 세포 분열의 동적 프로세스에 영향을 미치는 조건을 평가하고 미토시스에 있는 결점이 딸 세포 증식 및 생존에 미치는 충격을 밝히기 위한 강력합니다. 이미징 중 광 노출로 인한 광독성은 이 프로토콜과 관련된 중요한 과제를 나타냅니다.따라서 노출 시간과 이미징 간격 및 지속 시간을 최적화해야 합니다. 무균 기술과 생물안전 수준 2안전 캐비닛을 사용하여, 멸균 일회용 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 발현 구조를 운반하는 세포줄을 포함하는 배양판으로부터 배지를 흡습한다. 간략하게 소용돌이와 멸균 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척하고 0.05 %의 트립신의 두 밀리리터로 세포를 치료.섭씨 37도에서 2~5분 후, 8밀리리터의 신선한 배지를 접시에 추가하여 반응을 멈추고 부드러운 파이펫팅으로 분리된 세포를 다시 중단합니다. 세포 용액을 멸균 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 원심분리합니다.셀 배양 배지 농도의 밀리리터 당 1~2회 10회 세포에 세포를 1~2회 희석시키기 위한 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 그런 다음 멸균 12웰 이미징 바닥 플레이트의 각 웰에 세포의 500 마이크로리터를 시드하고 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치하여 세포가 플레이트 표면에 부착할 수 있도록 합니다. 이미징 하기 전에 30 분 이상, 하나 이상의 우물에 미토 틱 약물의 관련 농도를 추가 하 고 컨트롤과 같은 수의 우물에 희석제희석제의 동일한 볼륨을 추가.이미징용 현미경을 준비하기 위해 고해상도 카메라가 장착된 반전 된 상피 성화 현미경의 단계에 플레이트를 배치하고, 섭씨 37도에 예열된 환경 챔버및 가습 5 % 이산화탄소를위한 전달 시스템. 0.5의 수치 조리개와 높은 대비 형광 및 위상 대비를 위해 장착된 20배의 공기 목표를 선택하거나, 밝은 필드 이미징을 장착하고 세포를 바라보며 과정을 조정하고 세포를 초점으로 데 초점을 맞출 수 있습니다. 밝은 필드, GFP 및 RFP 이미지 수집에 대한 최적의 노출 시간을 설정하려면 이미지화될 형광에 대해 적절한 여기및 방출이 있는 각 필터 큐브를 선택하고 재생을 클릭합니다.신호가 충분히 강렬하지 않은 경우 자동 노출을 조정하고 각 플루오로포어 채널에서 포맷 드롭다운 메뉴에서 적절한 비닝을 선택합니다. 제조업체의 지침에 따라 현미경 단계를 멀티 웰 접시로 선택하고 보정하고 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지 이미지를 강조하거나 이미지할 우물을 선택합니다. 생성된 점 제어판을 열고 작업 영역 에서 제한된 및 테두리를 선택하여 좌표 선택 영역을 제한하여 웰의 경계를 제외합니다.영역 제한 드롭다운 메뉴에서 전체 영역을 선택하고 임의점 배치를 선택합니다. 카운트를 6개로 설정하고 Randomize를 클릭하여 각각 잘 캡처할 포인트의 수와 분포를 선택합니다. 그런 다음 시간 시퀀스 제어판에서 값을 클릭하고 입력하여 이미지 수집 시간 간격과 기간을 선택하고 입력합니다.RFP-H2B 표지 크로마틴을 시각화하려면 RFP 필터 큐브로 캡처된 이미지를 선택하고 초기 크로마틴 다짐 및 핵 봉투 분해에 의해 표시된 바와 같이 미토시스를 입력하는 세포를 식별하여 개별 세포에서 메타위상 정렬 및 상 발병의 미토틱 타이밍을 결정한다. 획득된 영화의 연속 시간 지점을 통해 관심셀을 추적하여 MIP-H2B 라벨이 부착된 크로마틴이 메타상 동안 셀 적도에서 정렬을 완료할 때까지 미토틱 항목으로부터의 시간 포인트 또는 분 수를 결정합니다. 미토성 타이밍, 미토틱 충실도 및 세포 운명을 모니터링하기 위해, 항상 염색체 분리가 명백하고/또는 크로마틴 디압축 및 핵 봉투 개혁이 발생한 시좌를 확인하기 위해 연속시간 지점을 통해 세포를 계속 추적한다.그런 다음 RFP-H2B를 시각화하여 해부학 염색체 분리 중 염색체및 염색진 다리를 뒤들이는 것을 포함하여 미토틱 결함을 나타내는 각 집단의 세포를 식별합니다. 알파 튜룰린-EGFP를 시각화함으로써 스핀들 장애를 경험하는 세포가 스핀들 풀 포커스가 달성되고 양극성 미토틱 스핀들이 세포 분열에 대비하여 형성됨에 따라 동적 변화를 겪는 것을 관찰할 수 있다. 스핀들 어셈블리와 동시, 염색체 운동은 염색체 정렬 및 분리 충실도를 평가하기 위해 RFP-H2B와 함께 시각화될 수 있다.살아있는 세포 화상 진찰 접근을 사용하여, 이 대표적인 결과는 일반적인 중구 적인 내용을 가진 세포가 30 분 안에 양극성 분열을 달성하기 위하여 메타위상 정렬 및 anaphase 개시를 통해 핵 봉투 고장에서 진행할 수 있다는 것을 보여줍니다. 여분의 중구가 있을 때, 세포의 거의 50%는 일시적인 다극성 미토틱 스핀들을 극복하고 완전한 세포 분열에서 양극성 스핀들을 형성할 수 있다. 나머지 세포는 양극성 스핀들을 달성할 수 없으며 그 결과 다극성 분열을 통해 미토시스를 종료합니다.스핀들 양극성이 달성되는지 여부에 관계없이, 추가 중심을 가진 세포는 2개의 중척추를 가진 세포에 비해 미토시스의 현저하게 증가한 기간을 전시합니다. 미토성 진행의 역학이 미토틱 결과의 변화가 명백하지 않더라도 변경될 수 있음을 나타냅니다. 형광 채널의 노출 시간을 정의할 때 노출 시간을 최적화하여 광독성을 제한합니다.또한 카메라 픽셀 비닝을 선택하여 노출 시간을 낮출 수 있습니다. 이 절차는 약리학적 검사, 침입 및 마이그레이션 분석에 응용 프로그램이 있습니다. 이러한 접근은 또한 약물 치료의 효능 또는 세포 운동성의 역학을 검사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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SCIENTISTS IN ACTION

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

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Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

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The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

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