Name: live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations at JoVE.com

DLM é apoiado por um NSF GRFP. O ALM é apoiado pelo financiamento do prêmio Smith Family de excelência em pesquisa biomédica.

1. geração de células hTERT-RPE-1 que expressam estavelmente RFP-histona 2B (RFP-H2B) e α-tubulina-EGFP (Tub-EGFP)
Nota: todas as etapas seguem técnicas assépticas e acontecem em um gabinete de segurança de nível II + (BSL2 +) de biosseguridade.
<ol><li>Gerar retrovírus carregando os genes do interesse (α-tubulin-EGFP e RFP-H2B) pelo transfection de 293T pilhas com os plasmídeos lentivirais apropriados de acordo com as instruções do fabricante do sistema lipídico-baseado da ent...

<ol>
	<li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage.">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li><li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis.">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491 (2016).</li><li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint.">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li><li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells.">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes &amp; Development. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer.">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li><li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies:+where+they+stand.">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).</li><li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+into+Focus:+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization.">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li><li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification.">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li><li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes,+chromosome+instability+(CIN)+and+aneuploidy.">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li><li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer.">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li><li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes.">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li><li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer.">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li><li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+centrosomal+kinase,+AIR-1,+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos.">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li><li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces.">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131 (2011).</li><li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers.">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li><li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+clustering+and+chromosomal+(in)stability:+a+matter+of+life+and+death.">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells.">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564 (2009).</li><li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+aberrations:+cause+or+consequence+of+cancer+progression?.">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?.</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li><li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering.">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li></ol>

A resolução temporal fornecida pela imagem de lapso de tempo permite a visualização e avaliação de eventos celulares seqüenciais dentro de células individuais. Abordagens que fazem uso de sincronização celular seguido pela coleta e fixação de células em pontos de tempo seqüencial são limitadas em que as comparações são feitas em última análise entre as populações de células. Em contextos onde a resposta celular às perturbações pode ser não uniforme, ou onde o processo que está sendo visualizad...

A análise baseada em imagem de células fixas é comumente usada para avaliar as alterações de nível populacional de células em resposta a várias perturbações. Quando combinado com a sincronização de células, seguido pela coleta e imagem de pontos de tempo serial, essas abordagens podem ser usadas para sugerir uma seqüência de eventos celular. Não obstante, a imagem latente fixa da pilha é limitada que as relações temporais estão implícitas para uma população e não demonstrada a nível de pilhas individuais. Desta maneira, quando a imagem latente e a análise fixas da pilha forem suficientes observar fenótipos robustos e mudanças do estado estacionário, a habilidade de detectar mudanças transientes sobre o tempo e as mudanças que impactam somente um subpopulação das pilhas são imperfeitas. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares e subcellular dentro de uma única pilha, ou população celular, sobre o tempo e sem a ajuda de aproximações da sincronização que podem eles mesmos impactar o comportamento celular 1. º , 2. º , 3. º , 4. º , 5. º , a 6.
A formação de um eixo mitotic bipolar é essencial para a segregação apropriada do cromossoma durante a divisão da pilha, tendo por resultado duas pilhas genetically idênticas da filha. Os defeitos na estrutura mitotic do eixo que corromper a progressão mitotic e comprometer a fidelidade da segregação do cromossoma podem conduzir às divisões de pilha catastróficas e à viabilidade reduzida da pilha. Por esta razão, os venenos mitóticos que alteram a formação do fuso são terapêuticas promissoras para limitar a rápida proliferação das células cancerosas7,8,9. Não obstante, a análise fixa da pilha da estrutura do eixo que segue a adição de venenos mitotic é limitada em sua habilidade de avaliar o processo dinâmico da formação do eixo e não pode indicar se as mudanças observadas na estrutura do eixo são permanentes ou são em vez transiente e pode ser superado para permitir a divisão celular bem-sucedida.
Neste protocolo, nós descrevemos uma aproximação para avaliar a dinâmica do mitose que segue perturbações do eixo pela imagem latente viva da pilha. Usando o hTERT imortalized RPE-1 linha celular projetada para expressar um RFP-Tagged histona 2B para visualizar a cromatina, juntamente com um EGFP-Tagged α-tubulin para visualizar microtúbulos, o sincronismo do alinhamento do cromossomo metafase, início da anaphase, e, finalmente, o Fate da pilha mitotic é avaliado usando indicações visuais do movimento do cromossoma, da compactação, e da morfologia nuclear.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>25-510</td>
			<td>A serine protease used to release adherent cells from culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml centrifuge tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Fluor objective&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>For use in retroviral transfection; used in step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-tubulin-EGFP&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alisertib</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11139-03</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C02</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>For use in cell culture and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49005</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49002</td>
			<td>Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable glass Pastuer pipets, sterilized&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For use in aspirating cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>10438-026</td>
			<td>Cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 and p3000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi well Tissue Culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>various</td>
			<td>for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements HC&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Version 4.51</td>
			<td>Image acquisition and analysis software; used in sections 3 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibo-Life sciences</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotic used in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate bufferred saline (PBS)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBP06-10X1LT</td>
			<td>sterile saline solution for use with cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td>Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pr-1</td>
			<td>Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP- Histone 2B (H2B)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>various numbers</td>
			<td>Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Max</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4000</td>
			<td>Human retinal pigment epithelial cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100x20mm</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353003</td>
			<td>for use in culturing adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla sCMOS camera&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging to assess the dynamics of metaphase timing and cell fate following mitotic spindle perturbations

A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é uma ferramenta importante na biologia da pilha que fornece a introspecção em processos celulares que poderiam de outra maneira ser negligenciados, incompreendido, ou interpretado mal pela análise da fixo-pilha. Embora a imagem e a análise de células fixas sejam robustas e suficientes para observar o estado estacionário celular, ela pode ser limitada na definição de uma ordem temporal de eventos no nível celular e está mal equipada para avaliar a natureza transitória dos processos dinâmicos, incluindo progressão mitótica. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares a nível da único-pilha sobre o tempo e tem a capacidade capturar a dinâmica dos processos que seriam representados de outra maneira mal na imagem latente fixa da pilha. Aqui nós descrevemos uma aproximação para gerar as pilhas que carregam marcadores cDNAs etiquetados da cromatina e dos microtúbulos e seu uso em aproximações da imagem latente da pilha viva para monitorar o alinhamento do cromossoma da metafase e a saída mitotic. Nós descrevemos técnicas Imaging-Based para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic, incluindo a identificação das pilhas em vários estágios no mitosis, na identificação e no seguimento de defeitos mitotic, e na análise da dinâmica do eixo e destino de células mitóticas após o tratamento com inibidores mitóticos.

Avaliação da progressão mitótica na presença de perturbações do fuso O Regulamento do pólo do eixo que focalizando é uma etapa essencial na formação bipolar apropriada do eixo. Rompimento nesse processo por meio de depleções de proteínas, inibição de fármacos ou alterações no número centrosome corromper a estrutura do fuso e atrasar ou interromper a progressão mitótica10,11,<sup...

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Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

A imagem celular viva permite a observação de processos celulares dinâmicos ao longo do tempo dentro de uma única célula. Essas abordagens são poderosas para avaliar as condições que impactam o processo dinâmico de divisão celular e revelar os impactos que os defeitos na mitose têm na proliferação e viabilidade celular da filha. A fototoxicidade resultante da exposição à luz durante a imagem representa um desafio significativo associado a este protocolo.Portanto, os tempos de exposição e o intervalo e duração da imagem devem ser otimizados. Utilizando técnica asséptica e um armário de segurança de nível dois de biossegurança, use uma pipeta pasteur descartável estéril para aspirar o meio da placa de cultura contendo a linha celular carregando a construção de expressão de interesse. Lave brevemente as células com 10 mililitros de PBS estéreis com redemoinho e trate as células com dois mililitros de 0,05% de trippsina.Depois de dois a cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione oito mililitros de meio fresco à placa para parar a reação e resuspensar as células separadas com tubulação suave. Transfira a solução celular para um tubo estéril de 15 mililitros e colete as células por centrifugação. Resuspengue a pelota em 10 mililitros de PBS e centrifuge as células novamente.Resuspend a pelota em 10 mililitros de média para contagem e diluir as células para uma de uma a duas vezes 10 a 5ª células por mililitro de concentração média de cultura celular. Em seguida, semente 500 microliters de células em cada poço de uma placa inferior de imagem estéril de 12 poços e colocar a placa na incubadora de cultura celular para permitir que as células aderam à superfície da placa. Não mais do que 30 minutos antes da imagem, adicione uma concentração relevante de uma droga mitótica a um ou mais dos poços e adicione um volume igual do inibidor diluído ao mesmo número de poços que os controles.Para preparar o microscópio para imagem, coloque a placa no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com uma câmera de alta resolução, uma câmara ambiental pré-superaquecida a 37 graus Celsius e um sistema de entrega para dióxido de carbono umidificado de 5%. Selecione um objetivo de ar 20 vezes com uma abertura numérica de 0,5 e equipada para a fluorescência de alto contraste e contraste de fase, ou imagens de campo brilhante e visualize as células para ajustar o curso e encontrar foco para colocar as células em foco. Para definir os tempos de exposição ideais para aquisição de imagens de campo brilhante, GFP e RFP, selecione os respectivos cubos de filtro com a excitação e emissão adequadas para os fluoroforos que serão imagens e clique em Reproduzir.Se o sinal não for suficientemente intenso, ajuste a exposição automática e em cada canal fluorforeiro selecione o binning apropriado do menu suspenso Formato. Selecione e calibra o estágio do microscópio para o prato multi-poço de acordo com as instruções do fabricante e use o software de aquisição de imagens para destacar ou selecionar os poços que serão imagens. Abra o painel de controle de pontos gerados e em Área de Trabalho selecione Restrito e Fronteiriço para restringir a área de seleção de coordenadas para excluir os limites do poço.No menu suspenso de restrição de área, selecione Área Completa e selecione uma colocação aleatória de pontos. Defina a contagem para seis e clique em Randomize para selecionar o número e a distribuição dos pontos a serem capturados por poço, respectivamente. Em seguida, clique e digite os valores no painel de controle de sequência de tempo para selecionar e inserir o intervalo de tempo e a duração para coletar as imagens.Para visualizar a cromatina rotulada RFP-H2B, selecione as imagens capturadas com o cubo do filtro RFP no lugar e identifique uma célula que entra em mitose, conforme indicado pela compactação inicial de cromatina e quebra de envelope nuclear para determinar o tempo mitotístico do alinhamento da metafase e do aparecimento de anafase em células individuais. Acompanhe a célula de interesse através de pontos de tempo consecutivos no filme adquirido para determinar o número de pontos de tempo ou minutos da entrada mitótica até que a cromatina rotulada RFP-H2B complete o alinhamento no equador da célula durante a metafase. Para monitorar o tempo mitotístico, a fidelidade mitótica e o destino celular, continuem a rastrear a célula através de pontos de tempo consecutivos para identificar a coordenada de tempo em que a segregação do cromossomo anafase é aparente e/ou quando ocorreu a descompação da cromatina e a reforma do envelope nuclear.Em seguida, visualize rfp-H2B para identificar células em cada população que apresentam defeitos mitóticos, incluindo cromossomos atrasados e pontes de cromatina durante a segregação do cromossomo anáfase. Ao visualizar a tubulina alfa-EGFP, pode-se observar que as células que experimentam a interrupção do fuso sofrem mudanças dinâmicas à medida que o foco de tração do fuso é alcançado e um fuso mitotístico bipolar é formado em preparação para a divisão celular. Simultâneo com montagem de eixo, o movimento do cromossomo pode ser visualizado com RFP-H2B para avaliar o alinhamento cromossomo e a fidelidade da segregação.Usando abordagens de imagem de células vivas, esses resultados representativos mostram que as células com conteúdo centralo normal são capazes de proceder desde a quebra do envelope nuclear até o alinhamento de metafase e o início da anfífase para alcançar uma divisão bipolar em menos de 30 minutos. Na presença de centrosomos extras, quase 50% das células são capazes de superar um fuso mitocótico multipolar transitório e formar um fuso bipolar na divisão celular completa. As células restantes são incapazes de alcançar um fuso bipolar e, como resultado, saem da mitose através de uma divisão multipolar.Independentemente de se a bipolaridade do eixo for alcançada, as células com centrosomos extras apresentam uma duração significativamente maior de mitose em comparação com células com dois centrossomos. Indicando que a dinâmica da progressão mitótica pode ser alterada mesmo quando as alterações no desfecho mitótico não são aparentes. Ao definir os tempos de exposição para canais fluorescentes, otimize os tempos de exposição para limitar a fototoxicidade.Além disso, o binning de pixels da câmera pode ser selecionado para permitir que menores tempos de exposição sejam usados. Este procedimento tem aplicações em triagens farmacológicas, invasão e análise migratória. Essas abordagens também podem ser empregadas para examinar a eficácia dos tratamentos medicamentosos ou a dinâmica da motilidade celular.

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