Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

והוא מודה בתמיכה טכנית מעולה. המחברים מודים לרובנס-נטו לדיונים פוריים על ניתוח תמונות.

הפרוטוקול לאיסוף הרוק נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחוז ארהוס (M-20100032).
1. טיפוח ביוגידים של הממלכה הצולבת
<ol><li>הגדל את ה- DSM 20523 ו -C. אלביקנס ncpf 3179 על לוחות דם אגר ב 37 ° c בתנאים אירוביים.</li>
	<li>העברת מושבות יחיד של כל אורגניזם כדי לבדוק את הצינורות מלאים 5 מ ל של המוח ?...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

פרוטוקולים שונים לטיפוח של הממלכה הצולבת ביוגיאמים הקשורים C. אלביקנס ו סטרפטוקוקוס spp. תוארו בעבר9,22,23,24,25. עם זאת, הכיוונון הנוכחי מתמקד בתנאי גדילה פשוטים, לוח זמנים התואם לימי עבודה ר?...

ביומדי הממלכה, המורכב הן ממינים פטרייתיים וחיידקיים, מעורבים במצבים פתולוגיים בחלל הפה. קנדידה spp לעתים קרובות מבודדים זיהומים אנדודונטיים1 ומפני נגעים חניכיים2,3. בזיהומים רירית, מינים streptococcal מהקבוצה mitis הוכחו לשפר את היווצרות ביופלורין, הפלישה רקמות, והפצת הן בתוך מודלים מחוץ לארץ מורנין4,5,6,7. מעניין ביותר, מנשא אוראלי של קנדידה spp הוכח להיות משויך לשכיחות של עששת אצל ילדים8. כפי שמוצג במודלים של מכרסמים, קשר סימביוטי בין מוגני סטרפטוקוקוס ו קנביאנים אלביקנס מגביר את הייצור של פוליסכפידים של מסחטות ומוביל להיווצרות של ביואמים עבים יותר ויותר9,10.
בכל התנאים שהוזכרו לעיל, העששת המוקדמת בפרט, ה-pH של הביוilm הוא בעל חשיבות להתקדמות המחלה, והתפקיד הנודע של מטריצת הביוilm לפיתוח מיקרויוגניים11 שיחות למתודולוגיות המאפשרות לימוד שינויי pH בתוך ביואמים של הממלכה הצולבת. מיקרוסקופיה פשוטה ומדויקת גישות מבוססות לנטר pH בתוך חיידקי12 ו פטרייתי13 ביואילאמים פותחו. עם לצבוע את הצבע C-נהם-4 ואת הסף מבוסס התמונה לאחר העיבוד, ה-pH החילוץ יכול להיקבע בזמן אמת בכל שלושת הממדים של ביוilm14. לעומת טכניקות אחרות שפורסמו בניטור pH-מבוססי מיקרוסקופ ב-ביואמים, pH מטימטריה עם C-סנף-4 הוא פשוט וזול, כי זה לא דורש סינתזה של חלקיקים או תרכובות הכוללות צבע התייחסות15 או שימוש בשני הפוטון עירור16. השימוש בצבע אחד בלבד מונע בעיות עם מידור בדיקה, פלורסנט בכיוון, ו הלבנה סלקטיבית16,17,18 תוך שהוא עדיין מאפשר בידול אמין בין הפנים והחילוץ pH. בסופו של דבר, הדגירה עם הצבע מבוצעת לאחר הצמיחה של ביוilm, אשר מאפשר ללמוד הן מעבדה והן בתוך מקומיים מגודלים ביואמים.
מטרת העבודה הנוכחית היא להאריך את השימוש ב-pH מטימטריה ולספק שיטה ללימוד שינויי חומציות בביואמים מהממלכה. כהוכחה למושג, השיטה משמשת לניטור pH ב-ביואמים של מינים כפולים, המורכב מ -S. מיונים ו-C. אלביקנס חשופים גלוקוז.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

בין הממלכה ביואמים המורכבת הן בתאי פטרייתי בקטריאלי מעורבים במגוון של מחלות הפה, כגון זיהומים אנדודונטיים, חניכיים, זיהומים רירית, בעיקר, עששת הילדות המוקדמת. בכל התנאים הללו, ה-pH במטריקס משפיע על אינטראקציות מארחות בחיידק ולכן התקדמות המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מבוססת על מיקרוסקופיה לניטור הדינמיקה של ה-pH בתוך ביויואמים של הממלכה הכוללת את הקנדידה ו סטרפטוקוקוס. הספקטרום של פליטת הפליטה הכפולה והתכונות המכתימה של בדיקת הטימטרי C-נהם-4 מנוצלים כדי לקבוע טיפות ב-pH באזורים של מסחטות של הביואמים. השימוש ב-pH טימטריה עם הגשוש דורש בחירה מדוקדקת של פרמטרי דימות, כיול יסודי של הצבע, וזהיר, מבוסס הסף על עיבוד הנתונים של התמונה. כאשר נעשה שימוש נכון, הטכניקה מאפשרת הערכה מהירה של pH החילוץ באזורים שונים של ביוilm, ובכך את הניטור של שני מעברי pH אופקי ואנכי לאורך זמן. בעוד שהשימוש במיקרוסקופיה מגבילה את ה-Z-פרופיל ל ביויואמים דקים של 75 יקרומטר או פחות, השימוש ב-pH מטימטריה מתאים באופן אידיאלי למחקר לא פולשני של גורם התקפה אלימה חשובה בתוך ביוילאמים חוצי הממלכה.

לאחר 24 h ו 48 h, ביוציאמים עמידים בפני הממלכה התפתחו בצלחות הבאר. C. אלביקנס הראה דרגות שונות של צמיחה filamentous, ו S. מוסטנים יצרו אשכולות צפופים של עד 35 יקרומטר בגובה. תאים בודדים ושרשראות של S. מוסטנים מקובצים סביב מפרידי פטריות, וחללים בין-סלולאריים גדולים מצביעים על נוכחות של מטר?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

הפרוטוקול מציג שיטה קלה לביצוע לטיפוח ביופילמים חוצי ממלכה המורכבים מסטרפטוקוקוס. מוטנים וקנדידה אלביקנים. יחס ה-pH המבוסס על מיקרוסקופיה קונפוקולרית עוקבת מאפשר ניטור מדויק של התפתחויות ה- pH בתוך המטריצה החוץ-תאית של ביופילמים אלה.הבחירה הקפדנית בפרמטרים של רכישת תמונה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת נתוני תמונה עם ניגודיות מספקת לניתוח הבא. יחס pH הוא שיטה מהירה, מדויקת וזול ללמוד מעברי צבע אופקיים ואנכיים של pH בביופילמים חוצי ממלכה בזמן אמת. יחס pH יכול להתבצע גם ביופילמים פטרייתיים ובקטריאליים גרין.השיטה תורמת להגברת ההבנה שלנו של חילוף החומרים המיקרוביאלי בביופילמים. הפגנת ההליך לצמיחת ביופילם תהיה אנט אקג'אר תומסון, טכנאית מהמעבדה שלי. לגדל S.mutans ו C.albicans על צלחות אגר דם ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אירוביים.לאחר מכן להעביר מושבות בודדות של כל אורגניזם למבחנות מלאות חמישה מיליליטר של עירוי לב המוח ולגדל אותם במשך 18 שעות נוספות. ביום שלמחר, צנטריפוגה התרבויות ב 1, 200 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. תן שימוש חוזר בתאים במים מלוחים פיזיולוגיים והתאם את ה- OD 550 ל- 0.5 הן עבור C.albicans והן עבור S.mutans.ואז לדלל את ההשעיה S.mutans אחד עד 10 כדי להשיג ריכוזים שווי ערך. פיפטה 50 מיקרוליטרים של פתרון רוק סטרילי לתוך בארות של צלחת אופטית 96 בארות עבור מיקרוסקופיה. דגירה את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 100 microliters של מלוחים פיזיולוגיים סטריליים ולרוקן את בארות.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של השעיית C.albicans לכל באר, דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הטוב שלוש פעמים עם מלוחים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סרום חזיר עוברי ללא חום לכל באר. דגירה הצלחת במשך שעתיים, ולאחר מכן לשטוף אותו שלוש פעמים עם מלוחים.רוקנו את בארות אך השאירו מאגר של 20 מיקרוליטר כדי להימנע מ לכוחות גזיר מוגזמים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של השעיית S.mutans ו-150 מיקרוליטרים של BHI עם 5% סוכרוז לכל באר. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות או יותר.כאשר מטפחים ביופילמים ישנים יותר, מחליפים את המדיום מדי יום. בסוף שלב הצמיחה חוצה הממלכה, לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם מלוחים פיזיולוגיים סטריליים. להדמיית pH יחסמטרי, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך עם עדשת טבילת שמן או מים 63X, קו לייזר 543 ננומטר, ומערכת הדמיה ספקטרלית.השתמש באינקובטור כדי לחמם את שלב המיקרוסקופ ל 35 מעלות צלזיוס. הגדר את הגלאי לגילוי בו זמנית של פלואורסצנטיות ירוקה מ 576 עד 608 ננומטר ו פלואורסצנטיות אדומה מ 629 ל 661 ננומטר. לאחר מכן בחר כוח לייזר מתאים ולהשיג כדי למנוע מעל וחשיפה.הגדר את גודל חור הסיכה ליחידת אוויר אחת או לפרוסה אופטית של כ- 0.8 מיקרומטר. לאחר מכן הגדר את גודל התמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת מהירות הסריקה לשניים. בחר ממוצע שורה של שניים באמצעות האפשרות הממוצעת.הכינו 100 מיקרוליטרים של מלוחים פיזיולוגיים סטריליים עם 0.4% גלוקוז עד pH 7. לאחר מכן לעשות פתרון מלאי של C-SNARF-4 ולהוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 30 micromolar. רוקנו את אחת האגם עם הביופילם חוצה הממלכה והשאירו מאגר של 20 מיקרוליטר והוסיפו את תמיסת מלח עם גלוקוז וצבע יחסמטרי.מניחים את הצלחת על שלב המיקרוסקופ ומתחילים בהדמיה. הכן סדרה של חיץ MES 50 מילימולרי titrated ל pH ארבע עד 7.8 במרווחים של 0.2 יחידות pH ב 35 מעלות צלזיוס. פיפטה 150 מיקרוליטרים של כל פתרון חיץ לתוך בארות של צלחת אופטית 96 בארות.מוסיפים את הצבע ל בארות מלאות החיץ בריכוז של 30 מיקרומולרים ונותנים לו לצייד במשך חמש דקות. מחממים את שלב המיקרוסקופ ל-35 מעלות צלזיוס ולבחור את אותן הגדרות כמו הדמיית pH יחסמטרי שתוארה קודם לכן. מניחים את צלחת 96 הבאר על שלב המיקרוסקופ ולהתמקד בתחתית הבארות.רכוש תמונות ערוץ ירוק ואדום עבור כל פתרונות המאגר. במרווחי זמן קבועים, לצלם עם הלייזר כבוי כדי לתקן עבור היסט גלאי. בצע את ניסוי הכיול ב- triplicate וייצא את כל התמונות כקבצי TIFF.אחסן את התמונות הירוקות והארדומים בתיקיות נפרדות ושנה את שמן של שתי סדרות הקבצים למספרים רציפים. יבא את התמונות לתוכנה ייעודית לניתוח תמונות כגון ImageJ. בתמונות שצולמו עם הלייזר כבוי, לחץ על לנתח היסטוגרמה כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.הפחת ערך זה מתמונות הביופילם על-ידי לחיצה על תהליך, מתמטיקה וחיסור. לאחר מכן יבא את שתי סדרות התמונות ל-daime ובצע פילוח מבוסס סף של תמונות הערוץ האדום על-ידי לחיצה על מקטע, פילוח אוטומטי סף מותאם אישית. הגדר את הסף הנמוך מעל עוצמת הפלואורסצנטיות של הציטופלסמה הפטרייתית ואת הסף הגבוה מתחת לעוצמת קירות התא הפטרייתי והחיידקים.לאחר מכן העבר את שכבת האובייקט של סדרת התמונות המקטעים לסדרת התמונות של הערוץ הירוק בלחיצה על מקטע והעברת שכבת אובייקט. מחק פיקסלים שאינם אובייקטים בסדרת הערוצים האדומה והירוקה. עכשיו תמונות biofilm מנוקים תאים חיידקיים ופטריות ניתן לייצא כמו קבצי TIFF.יבא את סדרת התמונות בחזרה ל- ImageJ וחלק את סידרת התמונות האדומות בעצמה. לאחר מכן הכפילו את התוצאה בסדרת התמונות המקורית. סדרת התמונות המתקבלת זהה למקור, פרט לכך שכל הפיקסלים בעוצמת אפס יוסרו.חזור על התהליך באמצעות סידרת התמונות הירוקה. לאחר מכן, השתמש במסנן הממוצע בשתי סדרות התמונות כדי לפצות על רעש גלאי. חלקו את הירוק בסדרת התמונה האדומה המניבה את היחס בין ירוק לאדום לכל פיקסלי האובייקט.ביופילמים חוצי ממלכה חזקים שפותחו בצלחות באר לאחר 24 ו -48 שעות. תאים בודדים ושרשראות של S.mutans מקובצים סביב hyphae פטרייתי ומרחבים תאיים גדולים הצביעו על נוכחות של מטריצה רחבת ידיים. ה- pH במרחב החוץ-תאי הודמי באמצעות טבלת בדיקת מידע.ה- pH החוץ-תאי בביופילמים ירד במהירות בחמש הדקות הראשונות לאחר החשיפה לגלוקוז. לאחר מכן, חומציות האטה בדרך כלל להגיע לערכים של 5.5 כדי 5.8 לאחר 15 דקות. בשל שינויי ה- pH המקומיים, עוצמת הפלואורסצנטיות בביופילמים השתנתה עם הזמן.במהלך פילוח התמונה, נבחרו סף גבוה ונמוך כדי לחסל כראוי את כל האזורים המסוקרים על ידי תאים חיידקיים ופטריות. האזורים הכחולים והירוקים בוטלו על ידי הסף הנמוך וה גבוה בהתאמה. הבחירה הקפדה בפרמטרים של רכישת תמונה חיונית להשגת ניגודיות טובה בין תאי חיידקים, תאים פטרייתיים ומטריצת הביופילם.אם ביופילמים חוצי ממלכה גדלים בתאי זרימה, ניתן לפקח על פיתוחי pH בתנאי זרימה המחקה את אלה בחלל הפה. pH יחס הועסק כדי לזהות אזורים מקומיים ביופילמים שיניים עם pH נמוך במיוחד, מה שנקרא נקודות חמות חומציות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

הדמית ratiometric של pH התאי Biofilms השיניים

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...