Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
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Anette Aakjær थॉमसन और जेवियर ई. गार्सिया उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं । लेखक छवि विश्लेषण पर उपयोगी चर्चाके लिए रूबेन्स स्पिन-नेटो का शुक्रिया अदा करते हैं ।

लार संग्रह के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की और Aarhus काउंटी (एम-२०१०००३२) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती
<ol><li>एरोबिक परिस्थितियों में 37 डिग्री से?...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

सी एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपी से जुड़ी क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल पहले9,22,23,24,25वर्णित किए गए ह?...

फंगल और बैक्टीरियल दोनों प्रजातियों को शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्ममौखिक गुहा में कई पैथिक स्थितियों में शामिल हैं। कैंडिडा spp. अक्सर एंडोडोन्टिक संक्रमण1 से अलग किया गया है और पीरियोडोन्टल घावों2,3से । म्यूकोसल संक्रमणों में, मिटिस समूह से स्ट्रेप्टोकोकल प्रजातियों को इन विट्रो और म्यूरन मॉडल4,5,6,7दोनों में फंगल बायोफिल्म गठन, ऊतक आक्रमण और प्रसार को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। सबसे दिलचस्प बात यह है कि कैंडिडा पीपी की मौखिक गाड़ी8बच्चों में क्षरण की व्यापकता से जुड़ी हुई साबित हुई है । जैसा कि कृंतक मॉडलों में दिखाया गया है, स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडास एल्बिकान के बीच एक सहजीवी संबंध एक्स्ट्रासेलुलर पॉलीसैकराइड्स के उत्पादन को बढ़ाता है और मोटा और अधिक कैरिओजेनिक बायोफिल्म्स9,10के गठन की ओर जाता है।
उपर्युक्त सभी स्थितियों में, विशेष रूप से प्रारंभिक बाल्यावस्था क्षरण, रोग प्रगति के लिए बायोफिल्म पीएच का महत्व है, और एसिडोजेनिक माइक्रोवातावरण के विकास के लिए बायोफिल्म मैट्रिक्स की प्रख्यात भूमिका11 उन पद्धतियों के लिए कॉल करती है जो क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच परिवर्तन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। बैक्टीरियल12 और फंगल13 बायोफिल्म्स के अंदर पीएच की निगरानी के लिए सरल और सटीक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। रेशियोमेट्रिक डाइ सी-SNARF-4 और दहलीज आधारित छवि पोस्ट प्रसंस्करण के साथ, एक्स्ट्रासेलुलर पीएच एक बायोफिल्म14के सभी तीन आयामों में वास्तविक समय में निर्धारित किया जा सकता है । बायोफिल्म्स में माइक्रोस्कोपी आधारित पीएच-मॉनिटरिंग के लिए अन्य प्रकाशित तकनीकों की तुलना में, सी-SNARF-4 के साथ पीएच रेशियोमेट्री सरल और सस्ता है, क्योंकि इसमें कणों या यौगिकों के संश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है जिसमें संदर्भडाइ15 या दो-फोटॉन उत्तेजना16का उपयोग शामिल है। सिर्फ एक रंग का उपयोग जांच के साथ समस्याओं को रोकता है, फ्लोरोसेंट खून के माध्यम से, और चयनात्मक ब्लीचिंग16,17,18 जबकि अभी भी अंतर और बाह्य शिक्की पीएच के बीच एक विश्वसनीय भेदभाव के लिए अनुमति देता है । अंत में, बायोफिल्म विकास के बाद डाइ के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जो प्रयोगशाला और सीटू-ग्रोन बायोफिल्म्स दोनों का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
वर्तमान कार्य का उद्देश्य पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग का विस्तार करना और क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। अवधारणा के सबूत के रूप में, विधि का उपयोग दोहरी प्रजातियों की जैव फिल्मों में पीएच की निगरानी के लिए किया जाता है जिसमें एस म्यूटन और सी एल्बिकान होते हैं जो ग्लूकोज के संपर्क में होते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

फंगल और बैक्टीरियल कोशिकाओं दोनों से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्मएं विभिन्न प्रकार की मौखिक बीमारियों में शामिल होती हैं, जैसे एंडोडोटिक संक्रमण, पीरियोडोंटाइटिस, म्यूकोसल संक्रमण और, सबसे विशेष रूप से, बचपन की मिर्च। इन सभी स्थितियों में, बायोफिल्म मैट्रिक्स में पीएच माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन को प्रभावित करता है और इस प्रकार रोग प्रगति करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि का वर्णन किया गया है। पीएच-निर्भर दोहरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और रेशियोमेट्रिक जांच सी-SNARF-4 के धुंधला गुणों का शोषण बायोफिल्मों के बाह्य क्षेत्रों में पीएच में बूंदों का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। जांच के साथ पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग के लिए इमेजिंग पैरामीटर, रंग का पूरी तरह से अंशांकन, और छवि डेटा के सावधानीपूर्वक, सीमा आधारित पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता होती है। जब सही ढंग से उपयोग किया जाता है, तो तकनीक बायोफिल्म के विभिन्न क्षेत्रों में बाह्य पीएच के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार समय के साथ क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ग्रेडिएंट दोनों की निगरानी करती है। जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग जेड-प्रोफाइलिंग को 75 माइक्रोन या उससे कम की पतली बायोफिल्मों तक सीमित करता है, पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग आदर्श रूप से क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक महत्वपूर्ण उग्रता कारक के नॉनइनवेसिव अध्ययन के लिए अनुकूल है।

24 एच और 48 घंटे के बाद, अच्छी प्लेटों में मजबूत क्रॉस-किंगडम बायोफिल्मविकसित हुई। सी एल्बिकान ने तंतुओं के विकास की अलग-अलग डिग्री दिखाई, और एस म्यूटन ने ऊंचाई में 35 माइक्रोन तक के घने समूहों का गठन ?...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

प्रोटोकॉल कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती का वर्णन करता है और इन बायोफिल्म्स के अंदर एक्स्सेल्युलर पीएच की निगरानी के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित विधि प्रस्तुत करता है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक्स्ट्रासेलुलर पीएच की निगरानी

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

प्रोटोकॉल स्ट्रेप्टोकोक्यूस से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती के लिए एक आसान-से-प्रदर्शन विधि प्रस्तुत करता है। म्यूटन और कैंडिडा एल्बिकान। बाद में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित पीएच अनुपात धातु उन बायोफिल्म्स के बाह्य मैट्रिक्स के अंदर पीएच विकास की सटीक निगरानी के लिए अनुमति देता है।बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त विपरीत के साथ छवि डेटा प्राप्त करने के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों का सावधानीपूर्वक विकल्प अत्यंत महत्वपूर्ण है। पीएच अनुपातमेट्री वास्तविक समय में क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ग्रेडिएंट दोनों का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से, सटीक और सस्ती विधि है। पीएच अनुपात मीटर भी विशुद्ध रूप से कवक और जीवाणु बायोफिल्म में किया जा सकता है।यह विधि बायोफिल्म्स में माइक्रोबियल मेटाबोलिज्म की हमारी समझ को बढ़ाने में योगदान देती है। बायोफिल्म विकास के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन Anette Aakjaer थॉमसन, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा । एरोबिक परिस्थितियों में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रक्त आगर प्लेटों पर एस. mutans और C.albicans बढ़ो ।फिर प्रत्येक जीव की एकल उपनिवेशों को मस्तिष्क हृदय जलसेक के पांच मिलीलीटर से भरे परीक्षण ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें अतिरिक्त 18 घंटे के लिए विकसित करें। अगले दिन, पांच मिनट के लिए 1, 200 बार जी पर संस्कृतियों को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्याग दें। शारीरिक खारा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और सी एल्बिकान और एस म्यूटन दोनों के लिए ओडी 550 से 0.5 को समायोजित करें।फिर समकक्ष सांद्रता प्राप्त करने के लिए एस. म्यूटंस निलंबन एक से 10 को पतला करें। पिपेट 50 माइक्रोलीटर बाँझ लार समाधान के कुओं में एक ऑप्टिकल नीचे 96-माइक्रोस्कोपी के लिए अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में। थाली को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर प्लेट को बाँझ शारीरिक नमकीन के 100 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं और कुओं को खाली करें।प्रत्येक अच्छी तरह से सी एल्बिकान निलंबन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, फिर नमकीन के साथ तीन बार अच्छी तरह से धोएं। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। दो घंटे के लिए थाली को इनक्यूबेट करें, फिर इसे नमकीन से तीन बार धोएं।कुओं को खाली करें लेकिन अत्यधिक कतरनी ताकतों से बचने के लिए 20 माइक्रोलीटर जलाशय छोड़ दें । प्रत्येक कुएं में 5% सुक्रोज के साथ एस.म्यूटंस सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर और बीएचआई के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर 24 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट।पुराने बायोफिल्म्स की खेती करते समय, माध्यम को दैनिक रूप से बदलें। क्रॉस-किंगडम विकास चरण के अंत में, प्लेट को बाँझ शारीरिक नमकीन के साथ पांच बार धोएं। अनुपातमेट्रिक पीएच इमेजिंग के लिए, एक उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग 63X तेल या पानी विसर्जन लेंस, एक 543 नैनोमीटर लेजर लाइन और एक स्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम के साथ करें।माइक्रोस्कोप चरण को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए एक इनक्यूबेटर का उपयोग करें। 576 से 608 नैनोमीटर और लाल फ्लोरेसेंस 629 से 661 नैनोमीटर तक ग्रीन फ्लोरेसेंस का एक साथ पता लगाने के लिए डिटेक्टर सेट करें। फिर एक उपयुक्त लेजर शक्ति चुनें और अधिक और कम धैर्य से बचने के लिए लाभ करें।पिनहोल का आकार एक एयर यूनिट या लगभग 0.8 माइक्रोमीटर का ऑप्टिकल स्लाइस सेट करें। इसके बाद इमेज साइज को 512 पिक्सल और स्कैन स्पीड को टू सेट करें। मतलब विकल्प का उपयोग करके दो का एक लाइन औसत चुनें।पीएच सात के लिए 0.4% ग्लूकोज titrated के साथ बाँझ शारीरिक नमकीन के 100 माइक्रोलीटर तैयार करें। इसके बाद सी-SNARF-4 का स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं और डाई को 30 माइक्रोमोलर की अंतिम सांद्रता में डालें। क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म के साथ कुओं में से एक को खाली करें जो 20 माइक्रोलीटर जलाशय छोड़ रहा है और ग्लूकोज और अनुपातमेट्रिक डाई के साथ नमकीन जोड़ता है।प्लेट को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और इमेजिंग शुरू करें। 35 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 पीएच इकाइयों की वेतन वृद्धि में पीएच चार से 7.8 करने के लिए 50 मिलीमोलर एमईएस बफर की एक श्रृंखला तैयार करें। एक ऑप्टिकल नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में प्रत्येक बफर समाधान के पिपेट 150 माइक्रोलीटर।30 माइक्रोमोलर की एकाग्रता पर बफर से भरे कुओं में डाई डालें और इसे पांच मिनट के लिए समतुल्य होने दें । माइक्रोस्कोप चरण को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और पहले वर्णित अनुपातमेट्रिक पीएच इमेजिंग के लिए समान सेटिंग्स चुनें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर 96-वेल प्लेट रखें और कुओं के नीचे पर ध्यान दें।सभी बफर समाधानों के लिए हरे और लाल चैनल छवियों को प्राप्त करें। नियमित अंतराल पर, लेजर के साथ छवियों को ले डिटेक्टर ऑफसेट के लिए सही करने के लिए बंद कर दिया । ट्रिपलिटेट में अंशांकन प्रयोग करें और सभी छवियों को झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।हरे और लाल छवियों को अलग-अलग फ़ोल्डर में स्टोर करें और अनुक्रमिक नंबरों के साथ फ़ाइलों की दोनों श्रृंखलाओं का नाम बदलें। इमेजजे जैसे समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवियों को आयात करें। लेजर बंद के साथ ली गई छवियों में, औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता निर्धारित करने के लिए विश्लेषण और हिस्टोग्राम पर क्लिक करें।प्रक्रिया, गणित, और घटाना क्लिक करके बायोफिल्म छवियों से इस मूल्य घटाना। फिर दो इमेज सीरीज को दैम में आयात करें और सेगमेंट, ऑटोमैटिक सेगमेंटेशन और कस्टम थ्रेसहोल्ड पर क्लिक करके रेड चैनल इमेजेज की थ्रेसहोल्ड-बेस्ड सेगमेंटेशन करें । फंगल साइटोप्लाज्म की फ्लोरेसेंस तीव्रता और फंगल सेल दीवारों और बैक्टीरिया की तीव्रता के नीचे उच्च सीमा के ऊपर कम सीमा निर्धारित करें।इसके बाद सेगमेंट की इमेज सीरीज की ऑब्जेक्ट लेयर को सेगमेंट और ट्रांसफर ऑब्जेक्ट लेयर पर क्लिक करके ग्रीन चैनल इमेज सीरीज में ट्रांसफर करें। रेड और ग्रीन चैनल सीरीज में नॉन-ऑब्जेक्ट पिक्सल डिलीट करें। अब बायोफिल्म छवियों को बैक्टीरियल और फंगल कोशिकाओं से मंजूरी दी जाती है और उन्हें झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जा सकता है।इमेज सीरीज को वापस इमेजजे में आयात करें और लाल छवि श्रृंखला को खुद से विभाजित करें। फिर मूल छवि श्रृंखला द्वारा परिणाम को गुणा करें। परिणामस्वरूप छवि श्रृंखला मूल के समान है सिवाय सभी शून्य तीव्रता पिक्सल हटा दिए जाते हैं।हरी छवि श्रृंखला के साथ प्रक्रिया दोहराएं। इसके बाद, डिटेक्टर शोर की भरपाई के लिए दोनों छवि श्रृंखला पर मतलब फ़िल्टर का उपयोग करें। लाल छवि श्रृंखला है जो फिर सभी वस्तु पिक्सल के लिए हरे से लाल अनुपात पैदावार द्वारा हरे रंग विभाजित ।24 और 48 घंटे के बाद अच्छी प्लेटों में विकसित मजबूत क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म। फंगल हाइफा और बड़े इंट्रासेलुलर रिक्त स्थान के आसपास समूहित एस म्यूटन की एकल कोशिकाओं और श्रृंखलाओं ने भारी मैट्रिक्स की उपस्थिति का संकेत दिया। एक्सट्रासेलुलर स्पेस में पीएच को लुकअप टेबल का उपयोग करके कल्पना की गई थी।बायोफिल्म्स में एक्सट्रासेलुलर पीएच ग्लूकोज के संपर्क में आने के बाद पहले पांच मिनट में जल्दी से गिरा । इसके बाद, अम्लीकरण आमतौर पर 15 मिनट के बाद 5.5 से 5.8 के मूल्यों तक पहुंचने में धीमा हो गया। स्थानीय पीएच परिवर्तनों के कारण, बायोफिल्म्स में फ्लोरेसेंस तीव्रता समय के साथ बदल गई।छवि विभाजन के दौरान, बैक्टीरियल और फंगल कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए सभी क्षेत्रों को पर्याप्त रूप से खत्म करने के लिए उच्च और निम्न थ्रेसहोल्ड को चुना गया था। नीले और हरे रंग के क्षेत्रों को क्रमशः कम और उच्च थ्रेसहोल्ड द्वारा समाप्त कर दिया गया था । बैक्टीरियल कोशिकाओं, फंगल कोशिकाओं और बायोफिल्म मैट्रिक्स के बीच एक अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों का सावधानीपूर्वक विकल्प महत्वपूर्ण है।यदि क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स प्रवाह कोशिकाओं में उगाए जाते हैं, तो पीएच विकास को मौखिक गुहा में नकल करने वाले प्रवाह की स्थिति के तहत निगरानी की जा सकती है। विशेष रूप से कम पीएच, तथाकथित एसिडोजेनिक हॉटस्पॉट के साथ दंत बायोफिल्म्स में स्थानीय क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पीएच अनुपात मीटर को नियोजित किया गया है।

Research

JoVE Journal

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