Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
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Anette Aakjær Thomsen e Javier E. Garcia são reconhecidos por excelente suporte técnico. Os autores agradecem a Rubens Spin-Neto por discussões frutíferas sobre análise de imagens.

O protocolo para coleta de saliva foi revisto e aprovado pelo Comitê de Ética do Condado de Aarhus (M-20100032).
1. Cultivo de Biofilmes transfronteiriços
<ol><li>Grow S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 em placas de agar de sangue a 37 °C em condições aeróbicas.</li>
	<li>Transfira colônias individuais de cada organismo para testar tubos preenchidos com 5 mL de infusão cardíaca cerebral (BHI). Cresça por 18 h em condições aeróbicas a 37 °C.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Diferentes protocolos para o cultivo de biofilmes transcionais envolvendo C. albicans e Streptococcus spp. foram descritos anteriormente9,22,23,24,25. No entanto, a configuração atual se concentra em condições simples de crescimento, um cronograma compatível com dias de trabalho regulares, uma composição de espécies equilibra...

Biofilmes entre reinos compostos por espécies fúngicas e bacterianas estão envolvidos em várias condições patológicas na cavidade oral. Candida spp. tem sido frequentemente isolada de infecções endodônticas1 e de lesões periodontais2,3. Em infecções mucosas, espécies estreptocócicas do grupo de áciculos têm sido mostradas para melhorar a formação fungal de biofilme, invasão de tecidos e disseminação nos modelos in vitro e murina4,5,6,7. Mais interessante, o transporte oral de Candida spp. tem sido comprovado estar associado à prevalência de cáios em crianças8. Como mostrado nos modelos de roedores, uma relação simbiótica entre mutanos streptococcus e candidas albicans aumenta a produção de polissacarídeos extracelulares e leva à formação de biofilmes mais grossos e cariogênicos9,10.
Em todas as condições acima mencionadas, as cárinas da primeira infância, em particular, o pH biofilme é importante para a progressão da doença, e o papel eminente da matriz biocinematográfica para o desenvolvimento de microambientes acidogênicos11 exige metodologias que permitam estudar mudanças de pH dentro de biofilmes transfronteiriços. Abordagens simples e precisas baseadas em microscopia confocal para monitorar pH dentro de biofilmes bacterianos12 e fúngicos13 foram desenvolvidas. Com o dye ratiométrico C-SNARF-4 e o pós-processamento de imagem baseado em limiares, o pH extracelular pode ser determinado em tempo real em todas as três dimensões de um biofilme14. Em comparação com outras técnicas publicadas para monitoramento de pH baseado em microscopia em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 é simples e barata, pois não requer a síntese de partículas ou compostos que incluem um tintura de referência15 ou o uso de excitação de dois fótons16. O uso de apenas um corante evita problemas com compartimentação de sondas, sangramento fluorescente e branqueamento seletivo16,17,18, enquanto ainda permite uma diferenciação confiável entre pH intra e extracelular. Finalmente, a incubação com o tintura é realizada após o crescimento do biofilme, que permite estudar tanto laboratório quanto em biofilmes cultivados no situ.
O objetivo do presente trabalho é ampliar o uso da ratiometria de pH e fornecer um método para estudar mudanças de pH em biofilmes inter-reinos. Como prova de conceito, o método é usado para monitorar pH em biofilmes de espécies duplas compostas por s. mutans e c. albicans expostos à glicose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Biofilmes transversais que consistem em células fúngicas e bacterianas estão envolvidos em uma variedade de doenças bucais, como infecções endodônticas, periodontite, infecções mucosas e, mais notavelmente, cárinos da primeira infância. Em todas essas condições, o pH na matriz biofilme impacta as interações microbe-hospedeiros e, portanto, a progressão da doença. O protocolo atual descreve um método confocal baseado em microscopia para monitorar a dinâmica do PH dentro de biofilmes entre reinos compostos por candida albicans e streptococcus mutans. O espectro de emissão dupla dependente de pH e as propriedades de coloração da sonda ratiométrica C-SNARF-4 são explorados para determinar quedas no pH em áreas extracelulares dos biofilmes. O uso de ratiometria pH com a sonda requer uma escolha meticulosa de parâmetros de imagem, uma calibração completa do tintura e pós-processamento cuidadoso e baseado em limiar dos dados de imagem. Quando utilizada corretamente, a técnica permite a rápida avaliação do pH extracelular em diferentes áreas de um biofilme e, portanto, o monitoramento de gradientes pH horizontais e verticais ao longo do tempo. Embora o uso de microscopia confocal limite o perfil z a biofilmes finos de 75 μm ou menos, o uso de ratiometria pH é idealmente adequado para o estudo não invasivo de um importante fator de virulência em biofilmes entre reinos.

Após 24h e 48 h, biofilmes robustos de cross-kingdom se desenvolveram nas placas de poço. Os albicanos mostraram diferentes graus de crescimento de filamentous, e os mutanos formaram aglomerados densos de até 35 μm de altura. Células únicas e correntes de s. mutanos agrupados em torno de hífofas fúngicas, e grandes espaços intercelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa (Figura S1).
A calibração do tye ratiométrico produz uma ...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.

Monitoramento de pH extracelular em biofilmes transversais usando microscopia confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

O protocolo apresenta um método fácil de executar para o cultivo de biofilmes entre reinos que consistem em StreptococcuS. mutans e Candida albicans. A proporção de pH baseada em microscopia confocal permite um monitoramento preciso dos desenvolvimentos de pH dentro da matriz extracelular desses biofilmes.A escolha cuidadosa dos parâmetros de aquisição de imagens é de extrema importância para obter dados de imagem com contraste suficiente para análise posterior. a proporção de pH é um método rápido, preciso e barato para estudar gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes entre reinos em tempo real. a proporção de pH também pode ser realizada em biofilmes puramente fúnicos e bacterianos.O método contribui para aumentar nossa compreensão do metabolismo microbiano em biofilmes. Demonstrando o procedimento para o crescimento do biofilme estará Anette Aakjaer Thomsen, técnica do meu laboratório. Cresça S.mutans e C.albicans em placas de ágar de sangue a 37 graus Celsius em condições aeróbicas.Em seguida, transfira colônias únicas de cada organismo para testar tubos cheios de cinco mililitros de infusão cerebral e cultivá-los por mais 18 horas. No dia seguinte, centrifugar as culturas a 1.200 vezes g por cinco minutos e descartar o supernaspe. Resuspend as células em soro fisiológico e ajuste o OD 550 para 0,5 tanto para C.albicans quanto S.mutans.Em seguida, diluir a suspensão S.mutans de 1 a 10 para alcançar concentrações equivalentes. Pipeta 50 microliters de solução salivar estéril nos poços de uma placa óptica de fundo 96-well para microscopia. Incubar a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius, depois lave a placa três vezes com 100 microliters de soro fisiológico estéril e esvazie os poços.Adicione 100 microliters de suspensão de C.albicans a cada poço, incubar a placa a 37 graus Celsius por 90 minutos e depois lavar o poço três vezes com soro fisiológico. Em seguida, adicione 100 microliters de soro bovino fetal inativado pelo calor a cada poço. Incubar a placa por duas horas e depois lavá-la três vezes com soro fisiológico.Esvazie os poços, mas deixe um reservatório de 20 microliteres para evitar forças excessivas de tesoura. Adicione 100 microliters de suspensão S.mutans e 150 microliters de BHI com 5% de sacarose para cada poço. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 horas ou mais.Ao cultivar biofilmes mais antigos, substitua o meio diariamente. No final da fase de crescimento entre reinos, lave a placa cinco vezes com soro fisiológico estéril. Para imagens de pH racionamento, use um microscópio de varredura a laser confocal invertido com uma lente de imersão de óleo ou água 63X, uma linha laser de 543 nanômetros e um sistema de imagem espectral.Use uma incubadora para aquecer o estágio do microscópio a 35 graus Celsius. Defina o detector para detecção simultânea de fluorescência verde de 576 a 608 nanômetros e fluorescência vermelha de 629 a 661 nanômetros. Em seguida, escolha um poder laser apropriado e ganhe para evitar mais e a subexposição.Ajuste o tamanho do orifício em uma unidade de ar ou uma fatia óptica de cerca de 0,8 micrômetros. Em seguida, defina o tamanho da imagem para 512 por 512 pixels e a velocidade de varredura para dois. Escolha uma média de linha de dois usando a opção média.Prepare 100 microliters de soro fisiológico estéril com 0,4% de glicose titulada ao pH sete. Em seguida, faça uma solução de estoque de C-SNARF-4 e adicione o corante a uma concentração final de 30 micromolar. Esvazie um dos poços com o biofilme transversal deixando um reservatório de 20 microliter e adicione o soro fisiológico com glicose e corante ratiométrico.Coloque a placa no estágio do microscópio e inicie a imagem. Prepare uma série de 50 milimões de tampão MES titulados para pH de quatro a 7,8 nos incrementos de 0,2 unidades de pH a 35 graus Celsius. Pipeta 150 microliters de cada solução tampão nos poços de uma placa de fundo óptico de 96 poços.Adicione o corante aos poços cheios de tampão a uma concentração de 30 micromolares e deixe equilibrar por cinco minutos. Aqueça o estágio do microscópio a 35 graus Celsius e escolha as mesmas configurações que as imagens de pH racionmétricas descritas anteriormente. Coloque a placa de 96 poços no estágio do microscópio e foque na parte inferior dos poços.Adquira imagens de canais verdes e vermelhos para todas as soluções tampão. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir o deslocamento do detector. Realize o experimento de calibração em triplicate e exporte todas as imagens como arquivos TIFF.Armazene as imagens verde e vermelha em pastas separadas e renomeie ambas as séries de arquivos com números sequenciais. Importe as imagens em softwares dedicados de análise de imagens, como imageJ. Nas imagens tiradas com o laser desligado, clique em analisar e histograma para determinar a intensidade média da fluorescência.Subtraia esse valor das imagens do biofilme clicando no processo, na matemática e na subtração. Em seguida, importe as duas séries de imagens em daime e realize uma segmentação baseada em limiar das imagens do canal vermelho clicando no segmento, segmentação automática e limiar personalizado. Defina o limiar baixo acima da intensidade de fluorescência do citoplasma fúngico e o alto limiar abaixo da intensidade das paredes celulares fúngicas e das bactérias.Em seguida, transfira a camada de objeto da série de imagens segmentadas para a série de imagens do canal verde clicando no segmento e na transferência da camada do objeto. Exclua pixels não-objeto na série de canais vermelho e verde. Agora, as imagens de biofilme são limpas de células bacterianas e fúngicas e podem ser exportadas como arquivos TIFF.Importe a série de imagens de volta para ImageJ e divida a série de imagens vermelhas por si só. Em seguida, multiplique o resultado pela série de imagens original. A série de imagens resultante é idêntica à original, exceto que todos os pixels de intensidade zero são removidos.Repita o processo com a série de imagens verdes. Em seguida, use o filtro médio em ambas as séries de imagens para compensar o ruído do detector. Divida o verde pela série de imagens vermelhas que, em seguida, rende a razão verde-vermelho para todos os pixels de objeto.Biofilmes robustos de cross-kingdom desenvolvidos nas placas do poço após 24 e 48 horas. Células únicas e cadeias de S.mutans agrupadas em torno de hifas fúngicas e grandes espaços intracelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa. O pH no espaço extracelular foi visualizado usando uma mesa de busca.O pH extracelular nos biofilmes caiu rapidamente nos primeiros cinco minutos após a exposição à glicose. Depois disso, a acidificação desacelerou tipicamente atingindo valores de 5,5 a 5,8 após 15 minutos. Devido às mudanças de pH locais, a intensidade da fluorescência nos biofilmes mudou com o tempo.Durante a segmentação de imagens, foram escolhidos limiares altos e baixos para eliminar adequadamente todas as áreas cobertas por células bacterianas e fúngicas. As áreas azul e verde foram eliminadas pelos limiares baixos e altos, respectivamente. A escolha cuidadosa dos parâmetros de aquisição de imagens é crucial para obter um bom contraste entre células bacterianas, células fúngicas e a matriz de biofilme.Se os biofilmes entre reinos forem cultivados em células de fluxo, os desenvolvimentos de pH podem ser monitorados sob condição de fluxo imitando aqueles na cavidade oral. a proporção de pH tem sido empregada para identificar áreas locais em biofilmes dentários com pH particularmente baixo, os chamados hotspots acidógênicos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

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