Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi vill tacka professor Chris Jones för att ha bidragit till KNS42 cellinjer. Den Zeiss LSM880 konfokalmikroskopi Mikroskop med airyscan används i detta arbete är en del av Huddersfield innovation and inkubering Project (hiip) som finansieras genom Leeds City region Enterprise Partnership (LEP) tillväxt affär. Kredit för Mikroskop bild figur 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Microscopy@zeiss.com.

1. generering av Cellspheroids
Dag 1
<ol><li>Förbered det standard odlingsmedium som krävs av den cell linje som undersöks.</li>
	<li>Utför alla vävnadskulturer-associerade steg i en vävnad kultur huva med hjälp av steril hantering tekniker.</li>
	<li>Trypsinize och räkna cancerceller. Använd 20 mL cellsuspension per tallrik. Håll cell upphängningarna i tydligt märkta sterila Universalrör.</li>
	<li>Lägg till ett förutbestämt antal celler i varje brunn. Både...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

Ett nytt sätt att skapa cancer cell spheroids för identifiering av migrastatic drog aktivitet med högupplöst konfokalmikroskopi beskrivs. Användningen av låga anhängare plattor över andra tekniker, såsom hängande droppar15, har underlättat ett sätt att generera reproducerbara och enhetliga spheroids för användning i kollagen migration och invasions analyser. De kritiska punkterna i detta protokoll är avlägsnandet av odlingssubstrat från 96-brunn plattan före cellen sfäroid inbä...

Tredimensionell spheroidteknik för preklinisk läkemedels upptäckt och utveckling av potentiella cancerläkemedel gynnas alltmer över konventionella drog skärmar; Sålunda, det finns mer utveckling av migrastatic — migration och invasion förebygga — droger. Logiken bakom denna utveckling i cancerbehandling är tydliga: 3D sfäroid analyser utgör en mer realistisk metod för screening potentiella anti-cancerläkemedel som de härma 3D-tumör arkitektur mer troget än cell enskiktslager kulturer, recapitulate läkemedel-tumör interaktioner (kinetik) mer exakt, och tillåta karakterisering av drog aktivitet i en tumör-relaterad inställning. Dessutom, uppkomsten av resistens mot kemotoxiska läkemedel i många cancertyper och höga dödstalen bland cancerpatienter på grund av metastaser potentierad av förmågan hos cancerceller att migrera till avlägsna tumör platser stöder införandet av kemoterapeutiska medel inriktning på cancercellernas migrations potential som adjuvant behandling i framtida kliniska cancer prövningar1. Detta är särskilt fallet i mycket invasiva cancerformer, såsom höggradig glioblastomas (GBM). GBM Management omfattar kirurgi, strålbehandling, och kemoterapi. Men även med kombinationsbehandling, de flesta patienter återfall inom 1 år av initial diagnos med en median överlevnad av 11-15 månader2,3. Enorma framsteg inom 3D-teknik har gjorts under de senaste åren: Rotative system, microfabricerade strukturer och 3D ställningar, och andra enskilda analyser ständigt förbättras för att möjliggöra rutinmässig testning i stor skala4, 5,6,7. Resultaten från dessa analyser måste dock analyseras på ett meningsfullt sätt, eftersom data tolkningen ofta hindras av försök att analysera 3D-genererade data med 2D-bildanalyssystem.
Trots att föredra i termer av bild förvärvs hastighet och minskad fototoxicitet, de flesta wide-fält system förblir begränsad av resolution8. Således, bortsett från data läsa-outs om läkemedels effekt, detaljerade effekter av drog åtgärder på 3D cellulära strukturer av migrerande celler oundvikligen förloras om avbildas med hjälp av ett Wide-fält system. Omvänt, konfokalmikroskopi laserscanning mikroskopi (clsm) fångar hög kvalitet, optiskt sektionerade bilder som kan rekonstrueras och återges i 3D efter förvärvet med hjälp av datorprogram. Således är CLSM lätt tillämplig på Imaging komplexa 3D cellulära strukturer, vilket möjliggör förhör av effekterna av anti-migrastatic hämmare på 3D-strukturer och djupgående analyser av mekanismer cell migration. Detta kommer utan tvekan att vägleda framtida migrastatic läkemedelsutveckling. Här beskrivs ett kombinerat arbetsflöde av sfäroid-generering, läkemedelsbehandling, infärgnings protokoll och karakterisering av konfokalmikroskopi med hög upplösning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Drug discovery och utveckling inom cancerforskningen bygger alltmer på drog skärmar i 3D-format. Nya hämmare som riktar sig mot cancercellernas migrations-och invasiva potential, och därmed den metastaserande spridningen av sjukdomen, upptäcks och betraktas som kompletterande behandlingar i mycket invasiva cancerformer som gliom. Således krävs att generera data som möjliggör detaljerade analyser av celler i en 3D-miljö efter tillsats av ett läkemedel. Den metod som beskrivs här, som kombinerar sfäroid invasion analyser med högupplösta bildfångst och dataanalys av konfokalmikroskopi laserscanning mikroskopi (clsm), aktiverat detaljerad karakterisering av effekterna av den potentiella anti-flyttande hämmare MI-192 på gliom celler. Spheroids genererades från cellinjer för invasions analyser i låg anhängare 96-well tallrikar och sedan förberett för CLSM analys. Det beskrivna arbetsflödet var att föredra framför andra vanliga spheroid-genererande tekniker på grund av både lätthet och reproducerbarhet. Detta, kombinerat med den förbättrade bildupplösning som uppnåtts genom konfokalmikroskopi jämfört med konventionella bred fälts strategier, möjliggjorde identifiering och analys av distinkta morfologiska förändringar i flytt celler i en 3D-miljö efter behandling med den migrastatiska drogen MI-192.

Tredimensionell sfäroid teknologi främjar förståelsen av läkemedelsinteraktioner, eftersom det är mer representativt för den cancerspecifika miljön. Generering av spheroids kan uppnås på flera sätt; låg adherencen 96-brunn pläterar användes i detta protokoll. Efter att ha testat flera produkter från olika tillverkare, de plattor som används här valdes eftersom de genomgående presterade bäst när det gäller framgångsrik sfäroid produktion och enhetlighet. Ersättnings...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Effekterna av migrastatiska hämmare på gliom cancer cell migration i tredimensionella (3D) invasion analyser med hjälp av en Histon histondeacetylas (HDAC) hämmare kännetecknas av högupplöst konfokal mikroskopi.

Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Detta protokoll visar att vi nu kan bestämma effekten av migrastatiska hämmare i detalj i 3D-cancermodeller. Den största fördelen är den lätthet och allt-i-ett-tillvägagångssätt med vilken denna teknik kan utföras. Denna teknik gör bedömningen av migrastatic läkemedel i cancerforskning i en 3D-inställning, vilket möjliggör testning av läkemedel i en mer tumör miljö-relevant inställning.Denna metod kan tillämpas på testning av cytotoxiska läkemedel vid cancer eller till exempel för att bedöma strålningens effekt på cancerproliferation och cellmigration. Det är användbart att öva medellång borttagning steg och kollagen ersättning med vanliga 96-brunns plattor att bli säker. Dessutom är utbildning på ett konfokalmikroskop viktigt.Visuell demonstration av denna teknik är avgörande för forskare att förstå den nödvändiga känsliga hantering av sfäroider och deras användning i confocal mikroskopi. På den första dagen av experiment, har standard odlingsmedium, i detta fall, U251, redo för lämplig cellinje. I en vävnadskultur huva, tillsätt 0,5 milliliter trypsin i kulturen för att trypsinize cancercellerna.Räkna cancercellerna på en hemocytometer, och späd till en koncentration av fem gånger 10 till de tredje cellerna per milliliter. Håll cellupphängena i tydligt märkta, sterila universalrör. Resuspend cellerna genom mild inversion för att undvika cellklumpning.Använd en pipett för att lägga till 200 mikroliter av cellkulturen till varje brunn i en 96-brunnsplatta. Tillsätt 200 mikroliter av 1X PBS till varje tom brunn för att undvika avdunstning. Inkubera cellerna i en inkubator vid 37 grader Celsius.Efter 24 timmar, kontrollera cellerna genom ljusa fält mikroskopi. Cellinjer såsom glioma cancer cellinjer bildar sfäroider i botten av brunnen inom 24 timmar. Inkubera sfäroiderna i ytterligare 48 timmar för att tillåta en 3D-cellulär arkitektur att bildas.På den tredje dagen, placera kollagen, 5X kultur medium, en-molar natriumhydroxid, och en 20-milliliter rör på is. Tillsätt försiktigt och långsamt 10,4 milliliter kallt kollagen i det kylda odlingsröret. Undvik bubblor.Tillsätt sedan försiktigt 1,52 milliliter kallt sterilt 5X odlingsmedium. Undvik bubblor. Strax före användning, tillsätt försiktigt 72 mikroliter av kallsteril en-molar natriumhydroxid, och hålla lösningen på is.Blanda försiktigt genom att pipettera och undvika bubblor. Effektiv blandning leder till en färgförändring från röd till orange-röd i mediet. Låt blandningen stå på is tills den används.Nästa, för att ta bort 190 mikroliter av supernatant från 96-brunnsplattan förberedd på dag ett, använd en pipett i en vinkel mot sidan av brunnen. Var mycket noga med att inte störa de sfäroider som bildas i brunnens botten. Tillsätt försiktigt 100 mikroliter av kollagen mix till varje brunn, pipettering ner sidan av brunnen.Undvik bubblor och eventuell sfäroidstörning. Förvara eventuell kvarvarande kollagenblandning i 20-milliliterröret vid rumstemperatur för att bedöma polymerisationen. Inkubera plattan i inkubatorn i minst 10 minuter för att låta kollagenet polymerisera.När det överblivna kollagenet blir halvsampiga och svampliknande är sfäroiderna redo att behandlas med inhibitor. Tillsätt hämmarna vid 2X-koncentration till fem milliliter odlingsmedium. Pipett 100 mikroliter av mediet försiktigt ner på sidan av varje brunn för att undvika sfäroid störning.Observera och bild varje sfäroid av ljusa fält mikroskopi vid tider på noll timme, 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar för att bedöma läkemedelsaktivitet. Sedan, tillbaka plattan till inkubatorn. Nu, placera plattan i en vävnad kultur huva, och försiktigt ersätta supernatanten med 100 mikroliter av 1X PBS.Var noga med att inte störa sfäroiden, och undvik att vidröra kollagenet. Upprepa detta tvättsteg tre gånger till. Ta bort den slutliga tvätten i varje brunn, och ersätt med 100 mikroliter av 4%formaldehyd i 1X PBS.Placera 96-brunnsplattan på en labbbänk, täck med folie och låt 24 timmar vara rumstemperatur. Nästa dag, försiktigt ta bort formaldehyd, och ersätta med 1X PBS. Upprepa denna tvätt tre gånger till.Sedan byter du ut 1X PBS-tvätten mot 100 mikroliter av nyberedd Triton X-100-lösning. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur. Under tiden, förbereda blockeringslösningen med 50 milliliter 1X PBS och 05%skummjölkspulver i ett 50-milliliterrör, och blanda noggrant.Efter 30 minuter, ta bort Triton X-100, och tvätta tre gånger med 1X PBS. Tillsätt 100 mikroliter av blockeringslösningen till varje brunn, och inkubera i 15 minuter. Därefter späd anti-mus IgG acetylerad tubulinantikropp i blockerande buffert vid ett förhållande av ett till 100.Centrifugera den primära antikroppsblockerande buffertmixen i fem minuter vid 15, 682 gånger g. Ta försiktigt bort blockeringslösningen i varje brunn, och tillsätt 25 till 50 mikroliter av antikroppsblockeringsbufferten supernatant från röret. Inkubera i mörker i rumstemperatur i en timme.Ta sedan bort antikroppslösningen från varje brunn, och tvätta tre gånger med 100 mikroliter av 1X PBS. Späd sekundär antikropp i den blockerande bufferten vid den rekommenderade koncentrationen utöver eventuella ytterligare fluorescerande fläckar. Återigen centrifug den sekundära antikroppslösningen i fem minuter vid 15, 682 gånger g.Ta bort den blockerande lösningen från varje brunn, och tillsätt 25 till 50 mikroliter av den sekundära antikroppen supernatant. Inkubera i mörker i 1 1/2 timme i rumstemperatur. Ta bort den sekundära antikroppsfärgningslösningen, och tvätta tre gånger med 1X PBS, 100 mikroliter per brunn.Lyft försiktigt enskilda kollagenproppar genom att suga med en plast 200-mikroliterpipett på mitten av en glasrutschkana. Tillsätt en droppe av ett lämpligt fäste för att täcka kollagenpluggen. Placera ett täckskydd ovanpå provet, och förvara rutschkanan i rumstemperatur i mörker.Tredimensionell sfäroid teknik är att främja förståelsen av läkemedels-tumör interaktioner eftersom det är mer representativ för cancer-specifika miljön. I denna studie upptäcktes potentiella anti- eller pro-flyttande effekter. Detta är särskilt märkbart i KNS42 med till synes ingen migration i vare sig kontrollen eller behandlade sfäroider.Celldöd observerades vid den högsta inhibitorkoncentrationen på 10 mikromolar. Kärn- splittring och migrating celler var tydligt i U251 celler. U251 cell sfäroider hade spikar strålar bort från den ursprungliga sfäroid, med ökande cell avrundning i celler uppenbara med ökande hämmare koncentration.Kollapsade microtubules och nukleära fragmentering observerades i KNS42. Sheetlike utsprång med single cell spikes anger KNS42 migration. Vid den lägsta inhibitorkoncentrationen var denna fenotyp uttalad men förlorades med ökande inhibitorkoncentration.Det är avgörande att lämna alla reagenser på is tills de är klara. Annars börjar kollagen polymerisera innan det har alla lagts till sfäroiderna. Det finns utrymme att kvantifiera de bilder som genereras av konfokalmikroskopi för att bedöma effekterna av till exempel migrastatiska läkemedel på cellmorfologi.Det gjorde det möjligt för oss, för första gången, att bekräfta effekten av den migrastatiska hämmaren MI-192 på mikrotubuli acetylering nivåer och att utforska detta ytterligare i termer av cell migration. Extra försiktighet bör vidtas vid hantering av formaldehyd för fixeringssteget. De vanliga hälso- och säkerhetsriktlinjerna gäller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering av tumörceller med hjälp av en medicinsk tråd för att fånga cirkulerande tumörceller: en 3D strategi baserad på immunofluorescens och DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metod för att definiera effekterna av miljömässiga berikning på kolon mikrobiomet biologisk mångfald i en musmodell kolon tumör

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom sfäroid hud modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifiering, histologiska karakteriseringen och dissektion av mus prostata lober för i Vitro 3D sfäroid kultur modeller

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Helt mänsklig tumör-baserade Matrix i tredimensionell sfäroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som ett mer fysiologiskt system för cancer-associerade fibroblaster differentiering och invasion in vitro-studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...