Name: multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals
Uploaded: 2019-10-20T14:30:00
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Ces travaux ont été appuyés par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG : RGPIN-2017-06131) à C.P. C. P. est un chercheur-boursier frSQ. Nous remercions également la Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) pour la production des vecteurs viraux utilisés dans cette étude.

Toutes les expériences ont été faites conformément aux comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie à San Diego et au Guide canadien pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par l'Université Laval Protection des animaux. comité.
1. Alignement de la trajectoire optique entre la caméra CMOS (semi-conducteur d'oxyde métallique complémentaire) et le cordon de patch individuel ou ramifié
<ol><li>R...

<ol>
	<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Neural+Projection+Dynamics+Underlying+Social+Behavior.">Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior.</a> Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).</li><li>Proulx, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+pathway+controlling+motivation+to+exert+effort.">A neural pathway controlling motivation to exert effort.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).</li><li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Fiber+Photometry+Reveals+Signature+of+Future+Stress+Susceptibility+in+Nucleus+Accumbens.">In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+shapes+the+aversion+and+reward+responses+of+lateral+habenula+neurons.">Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>de Jong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neural+Circuit+Mechanism+for+Encoding+Aversive+Stimuli+in+the+Mesolimbic+Dopamine+System.">A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System.</a> Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).</li><li>Lerner, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact-Brain+Analyses+Reveal+Distinct+Information+Carried+by+SNc+Dopamine+Subcircuits.">Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits.</a> Cell. 162 (3), 635-647 (2015).</li><li>Calipari, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+temporal+signature+of+D1+and+D2+medium+spiny+neurons+in+cocaine+reward.">In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Interplay+between+Orexin+Neurons+and+Eating.">Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating.</a> Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Barker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Preoptic+Control+of+the+Lateral+Habenula+through+Convergent+Glutamate+and+GABA+Transmission.">Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission.</a> Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).</li><li>Siciliano, C. A., Tye, K. 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T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+multi-fiber+photometry+for+studying+large-scale+brain+circuit+dynamics.">High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics.</a> Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).</li><li>Akam, T., Walton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pyPhotometry:+Open+source+Python+based+hardware+and+software+for+fiber+photometry+data+acquisition.">pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Stamatakis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Hypothalamic+Area+Glutamatergic+Neurons+and+Their+Projections+to+the+Lateral+Habenula+Regulate+Feeding+and+Reward.">Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).</li><li>Tervo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Amygdala+Somatostatin+Neurons+Gate+Passive+and+Active+Defensive+Behaviors.">Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).</li><li>Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+male+aggression-seeking+behavior.">Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomically+Defined+and+Functionally+Distinct+Dorsal+Raphe+Serotonin+Sub-systems.">Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems.</a> Cell. 175 (2), 472-487 (2018).</li><li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+GCaMP6m&#8217;s+Ca2+-dependent+change+in+fluorescence.">Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m&#8217;s Ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies,+Fish,+and+Mice.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+neuronal+imaging+of+dopamine+dynamics+with+designed+genetically+encoded+sensors.">Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors.</a> Science. 360 (6396), (2018).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+for+Rapid+and+Specific+In+Detection+of+Norepinephrine.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity.">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Wang, H., Jing, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+brain:+genetically+encoded+fluorescent+sensors+for+imaging+neurotransmitters+and+neuromodulators.">Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+optoelectronic+photometers+for+monitoring+neuronal+dynamics+in+the+deep+brain.">Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Hypothalamic+Network+Dynamics+for+Appetitive+and+Consummatory+Behaviors.">Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2014).</li></ol>

La photométrie par fibre est une approche accessible qui permet aux chercheurs d'enregistrer la dynamique du calcium en vrac à partir de populations neuronales définies chez les animaux en mouvement libre. Cette méthode peut être combinée avec un large éventail de tests comportementaux, y compris "mouvement lourd" tâches telles que les tests de natation forcée2, la peur conditionnement18, interactions sociales1,4...

La capacité de corréler les réponses neuronales avec des aspects spécifiques du comportement d'un animal est essentielle pour comprendre le rôle qu'un groupe particulier de neurones joue dans la direction ou la réponse à une action ou un stimulus. Compte tenu de la complexité du comportement animal, avec la myriade d'états internes et de stimuli externes qui peuvent affecter même les actions les plus simples, l'enregistrement d'un signal avec une résolution d'essai unique équipe les chercheurs avec les outils nécessaires pour surmonter ces Limitations.
La photométrie de fibre est devenue la technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences de systèmes en raison de sa simplicité relative comparée à d'autres techniques d'enregistrement in vivo, de son rapport signal-bruit élevé, et de la capacité d'enregistrer dans une série de paradigmes comportementaux1,2,3,4,5,6,7,8. Contrairement aux méthodes électrophysiologiques traditionnelles, la photométrie est l'approche optique la plus couramment utilisée en conjonction avec des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIs, la série GCaMP)9. Les GECI modifient leur capacité à fluorer en fonction du fait qu'ils sont ou non liés au calcium. Parce que la concentration interne de calcium dans les neurones est très étroitement réglementée et les canaux de calcium à rayons de tension s'ouvrent lorsqu'un neurone déclenche un potentiel d'action, les augmentations transitoires de la concentration interne de calcium, qui se traduisent par des augmentations transitoires de la capacité d'un GECI à la fluorescence, peut être un bon proxy pour le tir neuronal9.
Avec la photométrie de fibre, la lumière d'excitation est dirigée vers le bas une fibre optique mince et multimode dans le cerveau, et un signal d'émission est rassemblé vers le haut par la même fibre. Parce que ces fibres optiques sont légères et pliables, un animal peut se déplacer en grande partie sans entrave, ce qui rend cette technique compatible avec un large éventail de tests et de conditions comportementales. Certaines conditions, telles que les mouvements rapides ou la flexion du cordon de patch de fibre optique au-delà du rayon auquel il peut maintenir la réflexion interne totale, peuvent introduire des artefacts de signal. Pour désambiguer le signal du bruit, nous pouvons exploiter une propriété de GCaMP connue sous le nom de « point isosbestique ». En bref, avec GCaMP, comme la longueur d'onde de la lumière d'excitation est décalée vers la gauche, son émission dans l'état de calcium-lié diminue et l'émission dans l'état de calcium-unbound augmente légèrement. Le point auquel l'intensité relative de ces deux émissions est égale est appelé le point isosbestic. Lorsque GCaMP est excité à ce stade, son émission n'est pas affectée par les changements dans les concentrations internes de calcium, et la variance dans le signal est le plus souvent due à l'atténuation du signal de la surflexion du cordon de patch de fibre optique ou le mouvement du tissu neural par rapport à la fibre implantée.
L'électrophysiologie d'une seule unité demeure l'étalon-or pour les enregistrements in vivo en mouvement libre en raison de sa résolution de niveau à cellule unique et à un seul pic. Cependant, il peut être difficile d'identifier l'identité moléculaire des cellules enregistrées, et l'analyse post-hoc peut être assez laborieuse. Bien que la photométrie en fibre n'ait pas de résolution unicellulaire, elle permet aux chercheurs de poser des questions impossibles à aborder avec les techniques traditionnelles. Combinant des stratégies virales avec des animaux transgéniques, l'expression des IGE peut être dirigée vers des types neuronaux génétiquement définis pour enregistrer l'activité neuronale définie par la population ou la projection, qui peut être effectuée en surveillant le signal calcique directement à l'axone terminaux10,11. En outre, en implantant de multiples canules à fibres optiques, il est possible de surveiller simultanément l'activité neuronale de plusieurs régions et voies du cerveau chez le même animal12,13.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une technique pour la photométrie simple et multi-fibre, comment corriger pour les artefacts calcium-indépendants, et détailler comment exécuter des enregistrements mono- et dual-color. Nous fournissons également des exemples des types de questions qu'il permet de poser et de leur niveau croissant de complexité (voir la figure 1). La configuration de la photométrie en fibre pour les enregistrements multifibres détaillés dans ce protocole peut être construite à l'aide d'une liste de matériaux trouvés à https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figure 2).
Il est essentiel que le système soit équipé pour les longueurs d'onde d'excitation de 410 nm et 470 nm pour les émissions de fluorescence dépendantes du calcium et du calcium de GCaMP6 ou de ses variantes. Pour les configurations personnalisées ou s'il n'y a pas de logiciel disponible pour exécuter le système, le programme libre et open source Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) peut être utilisé. Alternativement, la photométrie en fibre peut être exécuté par MATLAB (par exemple, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 ou tout autre langage de programmation14. Le logiciel et le matériel du système devraient permettre la manipulation des LED de 410 nm et 470 nm et de la caméra, l'extraction d'images (figure 2), et le calcul de l'intensité fluorescente moyenne dans les régions d'intérêt (ROI) dessinées autour des fibres sur les images. La sortie devrait être un tableau des valeurs d'intensité moyennes enregistrées avec les LED de 470 nm et 410 nm de chaque fibre dans le cordon de correction. Lors de l'exécution d'expériences multifibres, les fibres groupées de 400 m peuvent limiter le mouvement des souris. Dans de tels cas, nous vous recommandons d'utiliser des cordons patch de 200 m, qui offrent plus de flexibilité. Il peut également être possible d'utiliser de plus petits câbles factices pendant la formation des souris.
Il est crucial d'être en mesure d'extraire des points de temps pour les événements d'intérêt lors de l'acquisition de la photométrie fibre. Si le système ne fournit pas facilement un système intégré pour intégrer les TTL pour des événements spécifiques, une autre stratégie consiste à attribuer un horodatage aux points de temps individuels enregistrés pour s'aligner sur des moments et des événements spécifiques au cours de l'expérience. L'estampage peut être fait à l'aide de l'horloge de l'ordinateur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;m, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M59L01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Optical Post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Pedestal Post Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RMS20X</td>
			<td>#10 in Figure 2, #11 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td>#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_405</td>
			<td>#2 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB410-10</td>
			<td>#5 in Figure 2; #7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>465 nm. LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_465</td>
			<td>#1 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>#4 in Figure 2; #6 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-560/14-25</td>
			<td>#5 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_560</td>
			<td>#1 in Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-axis kinematic Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>K5X1</td>
			<td>#11 in Figure 2, #12 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A-ML</td>
			<td>#7 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for 405 collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD11F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for ajustable collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD127-F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CF125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual 493/574 dichroic</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF493/574-Di01-25x36</td>
			<td>#10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for GCaMP6</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-535/22-25</td>
			<td>#6 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enclosure with Black Hardboard Panels</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Externally SM1-Threaded End Cap for Machining</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1CP2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1QP</td>
			<td>#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Collimator for 405 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F671SMA-405</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed collimator for 470 and 560 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F240SMA-532</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-520/35-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC3260M</td>
			<td>#13 in Figure 2, #15 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light beam splitter</td>
			<td>Neurophotometrics</td>
			<td>SPLIT</td>
			<td>#14 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP425R</td>
			<td>#8 in Figure 2, #9 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03</td>
			<td>#9 in Figure 2, #8 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabond dental cement</td>
			<td>C&#38;B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 - M8 cable</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>Cable_M8-M8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber cannulas</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber Patchcords</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-600/37-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 LabJack</td>
			<td>LabJack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-cube LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CAB-DCU-T3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals

Enregistrer l'activité d'un groupe de neurones chez un animal en mouvement libre est une entreprise difficile. En outre, comme le cerveau est disséqué en sous-groupes fonctionnels de plus en plus petits, il devient primordial d'enregistrer à partir de projections et/ ou de sous-populations génétiquement définies de neurones. La photométrie en fibre est une approche accessible et puissante qui peut surmonter ces défis. En combinant des méthodologies optiques et génétiques, l'activité neuronale peut être mesurée dans des structures cérébrales profondes en exprimant des indicateurs de calcium génétiquement codés, qui traduisent l'activité neuronale en un signal optique qui peut être facilement mesuré. Le protocole actuel détaille les composants d'un système de photométrie multifibres, comment accéder aux structures profondes du cerveau pour délivrer et recueillir la lumière, une méthode pour rendre compte des artefacts de mouvement, et comment traiter et analyser les signaux fluorescents. Le protocole détaille les considérations expérimentales lors de l'exécution de l'imagerie mono et double couleur, à partir de fibres optiques implantées simples ou multiples.

Les corrélations neuronales des réponses comportementales peuvent varier en fonction d'une variété de facteurs. Dans cet exemple, nous avons utilisé la photométrie in vivo de fibre pour mesurer l'activité des terminaux d'axone de la zone hypothalamic latérale (LHA) qui se terminent dans le habenula latéral (LHb). Des souris de type sauvage ont été injectées avec un virus adéno-associé (AAV) codant gCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) dans le LHA et une fibre optique a été implantée avec la pointe immédiatement au...

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Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Ce protocole détaille comment mettre en œuvre et exécuter des enregistrements de photométrie multifibres, comment corriger les artefacts indépendants du calcium et des considérations importantes pour l'imagerie photométrie bicolore.

Photométrie multifibres pour enregistrer l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

L’imagerie CSOM de photométrie de fibre combine l’indicateur personnalisé génétiquement codé et les fibres optiques pour surveiller l’activité neuronale chez l’animal librement mobile. Ce qui est essentiel pour comprendre comment un groupe spécifique de neurones jouent dans la réalisation ou la réponse à une action ou un stimulus. Cette technique est un moyen accessible d’enregistrer à partir de régions spécifiques du cerveau qui sont définies par leur connexion ou profils génétiques, avec le contrôle intégré pour séparer le signal au bruit.La démonstration du processeur sera, Ekaterina Martianova, une étudiante diplômée dans mon laboratoire. Commencez par desserrer toutes les vis sur le traducteur à cinq axes. Vissez le cordon de patch à l’adaptateur qui est fixé au traducteur à cinq axes.Allumez ensuite la lumière d’excitation de 470 nanomètres à basse puissance et placez la pointe de la fibre pointant vers une glissière en plastique fluorescent automatique. Prochain enregistrement de l’appareil semi-conducteur d’oxyde de métal gratuit ou caméra CMOS en mode live. Augmentez le gain ou ajustez la table de recherchez jusqu’à ce que l’image soit visible au point focal de l’objectif.Avancez le traducteur à cinq axes vers l’objectif en veillant à ce que la lumière de 470 nanomètres soit centrée sur la fibre à l’extrémité SMA ou FC du cordon de patch, jusqu’à ce qu’une image puisse être résolue sur la caméra. Enfin, ajustez les axes X et Y jusqu’à ce que l’image soit centrée et bien résolue. Visualisez la lumière émise par l’extrémité variole du cordon de patch, car elle devrait apparaître comme un cercle isotropique.Commencez par allumer toutes les lumières d’excitation pour mieux visualiser les fibres. Et ajuster les gains de la caméra de telle sorte qu’aucun pixel n’est saturé, et une image claire des fibres sont présents. Ensuite, prenez une image préliminaire.Dessinez les régions d’intérêt ou rois autour des fibres. Et gardez-les pour la mesure des valeurs moyennes d’intensité pendant les enregistrements. Pour plusieurs enregistrements de fibres, testez pour les indépendants par enregistrement en direct de toutes les fibres.Dirigez une fibre vers une source de lumière, et appuyez avec un doigt. Observez les fluctuations du chenal. Appliquez ensuite du ruban coloré à l’extrémité des fibres pour étiqueter quel retour sur investissement correspond à quelle fibre.Enfin, installez la zone d’enregistrement en accrochant le cordon de patch au-dessus de l’arène à l’aide de gradins, de pinces et de supports. Enfin, assurez-vous que l’animal ne sera pas limité dans le mouvement par la longueur de la fibre et peut librement se déplacer dans toute l’arène. Commencez par inspecter l’extrémité distale des fibres du cordon patch par œil, et avec un mini microscope à fibres.Si la surface des fibres est rayée, re polir les fibres à l’aide d’un film de polissage de fibres avec du gravier fin. Nettoyez ensuite les extrémités distales du cordon de patch avec 70% d’éthanol et un applicateur à pointe de coton. Nettoyez les canules à fibres optiques à l’aide de 70 % d’éthanol et d’un applicateur à pointe de coton.Connectez l’extrémité variole du cordon patch à la fibre implantée à l’aide d’un manchon fendu en céramique recouvert d’un tube de rétrécissement noir. Pendant la connexion, assurez-vous que la manche est serrée. Laissez l’animal récupérer pendant quelques minutes.Ensuite, commencez à enregistrer le signal optique, et exécutez l’expérience. Lors de l’enregistrement garder un œil attentif sur la trace en direct pour assurer des enregistrements de qualité. Et surveillez les sauts dans le signal, indiquant que la manche n’est pas assez serrée.Pour les enregistrements bicolores, ajoutez une LED de 516 nanomètres au système de photométrie pour exciter le capteur de calcium fluorescent rouge, et les miroirs et filtres dichroïques appropriés. Ajoutez ensuite un séparant d’image entre l’objectif et la caméra CMOS pour séparer les longueurs d’ondes d’émission vertes et rouges. Enfin, dessinez rois autour de toutes les fibres dans les deux couleurs, rouge et vert.Assurez-vous d’identifier clairement chaque retour sur investissement avec la fibre et le canal correspondants. Déclenchez l’excitation simultanée avec 470 nanomètres, et 560 LED de nanomètre, et alternez-les avec une LED de 410 nanomètres. Les résultats indiquent que la fluorescence mesurée a augmenté de façon significative en même temps que l’administration de bouffées d’air pour les souris avec activation de la voie LHA-LHB.Cependant, chez les souris exprimant la protéine fluorescente verte ou GFP, aucun changement dans le signal n’a été détecté pendant l’administration des bouffées d’air. Cette technique permet aux chercheurs d’enregistrer raisonnablement à partir de différents types de cellules dans différentes régions du cerveau. Alors qu’un animal se comporte librement.Cela fait avancer la capacité de disséquer les fonctions de ces régions du cerveau en ce qui concerne le comportement.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Haute densité enregistrements EEG des souris se déplacent librement à l&#39;aide à base de polyimide microélectrodes

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Recherche

Neurosciences

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Conception et montage d&#39;un Microdrive ultra-léger motorisé pour des enregistrements de neurones chroniques chez les petits animaux

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

L&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action unique neurones de se déplacer librement à travers Pigeons Trois étapes de l&#39;apprentissage

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Neural activité Propagation dans un hippocampe Préparation déplié avec un pénétrant Micro-réseau d&#39;électrodes

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A Novel Behavioral Assay d&#39;enquêter sur les réponses gustatifs de l&#39;individu, Librement-mobiles Bumble Bees (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Enregistrement d&#39;EEG dans des rats néonatals à déplacement libre à l&#39;aide d&#39;une nouvelle méthode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Enregistrements simultanés des potentiels corticaux champ Local, électrocardiogramme, électromyogramme et respiration rythmique d’un Rat librement mobile

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Enregistrements EEG non invasive de bouger librement des porcelets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...