Name: multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals
Uploaded: 2019-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) a C.P. C. P. è un chercheur-Boursier FRSQ. Ringraziamo anche il Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) per la produzione dei vettori virali utilizzati in questo studio.

Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con i Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California, San Diego, e la Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dall'Université Laval Animal Protection comitato.
1. Allineamento del percorso ottico tra la telecamera CMOS (semiconduttore di ossido di metallo complementare) e il cavo patch individuale o ramificato
<ol><li>Allenta tutte le viti sul traduttore...

<ol>
	<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Neural+Projection+Dynamics+Underlying+Social+Behavior.">Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior.</a> Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).</li><li>Proulx, C. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neural+Circuit+Mechanism+for+Encoding+Aversive+Stimuli+in+the+Mesolimbic+Dopamine+System.">A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System.</a> Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).</li><li>Lerner, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact-Brain+Analyses+Reveal+Distinct+Information+Carried+by+SNc+Dopamine+Subcircuits.">Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits.</a> Cell. 162 (3), 635-647 (2015).</li><li>Calipari, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+temporal+signature+of+D1+and+D2+medium+spiny+neurons+in+cocaine+reward.">In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Interplay+between+Orexin+Neurons+and+Eating.">Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating.</a> Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Barker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Preoptic+Control+of+the+Lateral+Habenula+through+Convergent+Glutamate+and+GABA+Transmission.">Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission.</a> Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).</li><li>Siciliano, C. A., Tye, K. 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T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+multi-fiber+photometry+for+studying+large-scale+brain+circuit+dynamics.">High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics.</a> Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).</li><li>Akam, T., Walton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pyPhotometry:+Open+source+Python+based+hardware+and+software+for+fiber+photometry+data+acquisition.">pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Stamatakis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Hypothalamic+Area+Glutamatergic+Neurons+and+Their+Projections+to+the+Lateral+Habenula+Regulate+Feeding+and+Reward.">Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).</li><li>Tervo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Amygdala+Somatostatin+Neurons+Gate+Passive+and+Active+Defensive+Behaviors.">Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).</li><li>Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+male+aggression-seeking+behavior.">Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomically+Defined+and+Functionally+Distinct+Dorsal+Raphe+Serotonin+Sub-systems.">Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems.</a> Cell. 175 (2), 472-487 (2018).</li><li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+GCaMP6m&#8217;s+Ca2+-dependent+change+in+fluorescence.">Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m&#8217;s Ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies,+Fish,+and+Mice.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+neuronal+imaging+of+dopamine+dynamics+with+designed+genetically+encoded+sensors.">Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors.</a> Science. 360 (6396), (2018).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+for+Rapid+and+Specific+In+Detection+of+Norepinephrine.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity.">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Wang, H., Jing, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+brain:+genetically+encoded+fluorescent+sensors+for+imaging+neurotransmitters+and+neuromodulators.">Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+optoelectronic+photometers+for+monitoring+neuronal+dynamics+in+the+deep+brain.">Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Hypothalamic+Network+Dynamics+for+Appetitive+and+Consummatory+Behaviors.">Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2014).</li></ol>

La fotometria in fibra è un approccio accessibile che consente ai ricercatori di registrare la dinamica del calcio sfuso da popolazioni neuronali definite in animali liberamente in movimento. Questo metodo può essere combinato con una vasta gamma di test comportamentali, tra cui attività "movimento pesante" come test di nuoto forzato2, paura-condizionamento18, interazioni sociali1,4, e altri7</s...

La capacità di correlare le risposte neurali con aspetti specifici del comportamento di un animale è fondamentale per comprendere il ruolo che un particolare gruppo di neuroni svolge nel dirigere o rispondere a un'azione o uno stimolo. Data la complessità del comportamento animale, con la miriade di stati interni e stimoli esterni che possono influenzare anche le azioni più semplici, la registrazione di un segnale con risoluzione a prova singola dota i ricercatori degli strumenti necessari per superare questi Limitazioni.
La fotometria in fibra è diventata la tecnica di scelta per molti ricercatori nel campo delle neuroscienze dei sistemi a causa della sua relativa semplicità rispetto ad altre tecniche di registrazione in vivo, il suo elevato rapporto segnale-rumore e la capacità di registrare in una varietà di paradigmi comportamentali1,2,3,4,5,6,7,8. A differenza dei metodi elettrofisiologici tradizionali, la fotometria è l'approccio ottico più comunemente usato in combinazione con indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI, la serie GCaMP)9. I CCIi cambiano la loro capacità di fluorescenza in base al fatto che siano legati o meno al calcio. Poiché la concentrazione interna di calcio nei neuroni è molto strettamente regolata e i canali di calcio legati alla tensione si aprono quando un neurone attiva un potenziale d'azione, aumenta la concentrazione interna di calcio, che si traduce in aumenti transitori capacità di un GECI di fluorescenza, può essere un buon proxy per la cottura neuronale9.
Con la fotometria in fibra, la luce di eccitazione viene diretta lungo una sottile fibra ottica multimodale nel cervello e un segnale di emissione viene raccolto attraverso la stessa fibra. Poiché queste fibre ottiche sono leggere e pieghevoli, un animale può muoversi in gran parte senza ostacoli, rendendo questa tecnica compatibile con una vasta gamma di test comportamentali e condizioni. Alcune condizioni, come i movimenti rapidi o la flessione del cavo patch in fibra ottica oltre il raggio in cui può mantenere la riflessione interna totale, possono introdurre artefatti del segnale. Per disambiguare il segnale dal rumore, possiamo sfruttare una proprietà di GCaMP nota come "punto isosbestico". In breve, con GCaMP, mentre la lunghezza d'onda della luce di eccitazione viene spostata a sinistra, la sua emissione nello stato legato al calcio diminuisce e l'emissione nello stato non legato al calcio aumenta marginalmente. Il punto in cui l'intensità relativa di queste due emissioni è uguale è definita punto isosbestico. Quando GCaMP è eccitato a questo punto, la sua emissione non è influenzata da cambiamenti nelle concentrazioni interne di calcio, e la varianza nel segnale è più spesso dovuta all'attenuazione del segnale da sovraccarico del cavo patch in fibra ottica o movimento del tessuto neurale rispetto alla fibra impiantata.
L'elettrofisiologia a unità singola è ancora il gold standard per le registrazioni in vivo liberamente in movimento grazie alla sua risoluzione a cella singola e a picco singolo. Tuttavia, può essere difficile individuare l'identità molecolare delle cellule registrate e l'analisi post-hoc può essere abbastanza laboriosa. Mentre la fotometria in fibra non ha la risoluzione a cella singola, permette ai ricercatori di porre domande impossibili da affrontare con tecniche tradizionali. Combinando strategie virali con animali transgenici, l'espressione delle GeCI può essere diretta a tipi neuronali geneticamente definiti per registrare l'attività neurale definita dalla popolazione o dalla proiezione, che può essere eseguita monitorando il segnale di calcio direttamente all'assone terminali10,11. Inoltre, impiantando più cannule in fibra ottica, è possibile monitorare contemporaneamente l'attività neurale da diverse regioni e percorsi del cervello nello stesso animale12,13.
In questo manoscritto, descriviamo una tecnica per la fotometria singola e multifibra, come correggere artefatti indipendenti dal calcio e dettagliamo come eseguire registrazioni mono e doppio colore. Forniamo anche esempi dei tipi di domande che consente di porre e dei loro livelli crescenti di complessità (vedere Figura 1). La configurazione della fotometria in fibra per le registrazioni multifibra descritte in questo protocollo può essere costruita utilizzando un elenco di materiali trovati allhttps://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figura 2).
È essenziale che il sistema sia equipaggiato sia per lunghezze d'onda di eccitazione di 410 e 470 nm per l'emissione di fluorescenza indipendente dal calcio e dal calcio da GCaMP6 o le sue varianti. Per le configurazioni personalizzate o se non c'è nessun software disponibile per eseguire il sistema, il programma open source gratuito Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) può essere utilizzato. In alternativa, la fotometria in fibra può essere eseguita attraverso MATLAB (ad esempio, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 o un altro linguaggio di programmazione14. Il software e l'hardware del sistema dovrebbero consentire la manipolazione di entrambi i LED da 410 nm e 470 nm e della telecamera, l'estrazione di immagini(Figura 2)e il calcolo dell'intensità media fluorescente nelle regioni di interesse (ROI) disegnate intorno alle fibre le immagini. L'output deve essere una tabella dei valori di intensità media registrati con i LED da 470 nm e 410 nm di ogni fibra nel cavo del cerotto. Quando si eseguono esperimenti multifibra, 400 m di fibre in bundle possono limitare il movimento dei topi. In questi casi, si consiglia di utilizzare cavi di patch da 200 m, che offrono maggiore flessibilità. Può anche essere possibile utilizzare cavi fittizi più piccoli durante l'allenamento dei topi.
È fondamentale essere in grado di estrarre i punti temporali per gli eventi di interesse durante l'acquisizione della fotometria in fibra. Se il sistema non fornisce facilmente un sistema integrato per integrare i TTL per eventi specifici, una strategia alternativa consiste nell'assegnare un timestamp ai singoli punti temporali registrati per allinearsi a orari ed eventi specifici durante l'esperimento. Il timestamp può essere fatto utilizzando l'orologio del computer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;m, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M59L01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Optical Post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Pedestal Post Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RMS20X</td>
			<td>#10 in Figure 2, #11 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td>#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_405</td>
			<td>#2 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB410-10</td>
			<td>#5 in Figure 2; #7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>465 nm. LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_465</td>
			<td>#1 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>#4 in Figure 2; #6 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-560/14-25</td>
			<td>#5 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_560</td>
			<td>#1 in Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-axis kinematic Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>K5X1</td>
			<td>#11 in Figure 2, #12 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A-ML</td>
			<td>#7 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for 405 collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD11F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for ajustable collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD127-F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CF125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual 493/574 dichroic</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF493/574-Di01-25x36</td>
			<td>#10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for GCaMP6</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-535/22-25</td>
			<td>#6 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enclosure with Black Hardboard Panels</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Externally SM1-Threaded End Cap for Machining</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1CP2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1QP</td>
			<td>#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Collimator for 405 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F671SMA-405</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed collimator for 470 and 560 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F240SMA-532</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-520/35-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC3260M</td>
			<td>#13 in Figure 2, #15 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light beam splitter</td>
			<td>Neurophotometrics</td>
			<td>SPLIT</td>
			<td>#14 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP425R</td>
			<td>#8 in Figure 2, #9 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03</td>
			<td>#9 in Figure 2, #8 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabond dental cement</td>
			<td>C&#38;B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 - M8 cable</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>Cable_M8-M8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber cannulas</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber Patchcords</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-600/37-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 LabJack</td>
			<td>LabJack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-cube LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CAB-DCU-T3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals

Registrare l'attività di un gruppo di neuroni in un animale liberamente mobile è un'impresa impegnativa. Inoltre, poiché il cervello viene sezionato in sottogruppi funzionali sempre più piccoli, diventa fondamentale registrare da proiezioni e/o sottopopolazioni geneticamente definite di neuroni. La fotometria in fibra è un approccio accessibile e potente in grado di superare queste sfide. Combinando metodologie ottiche e genetiche, l'attività neurale può essere misurata in strutture cerebrali profonde esprimendo indicatori di calcio codificati geneticamente, che traducono l'attività neurale in un segnale ottico che può essere facilmente misurato. Il protocollo attuale descrive in dettaglio i componenti di un sistema di fotometria multifibra, come accedere alle strutture cerebrali profonde per fornire e raccogliere la luce, un metodo per tenere conto degli artefatti di movimento e come elaborare e analizzare i segnali fluorescenti. Il protocollo descrive in dettaglio le considerazioni sperimentali quando si esegue l'imaging a singolo e doppio colore, da fibre ottiche impiantate singole o multiple.

Correlazioni neurali delle risposte comportamentali possono variare a seconda di una varietà di fattori. In questo esempio, abbiamo usato la fotometria in fibra in vivo per misurare l'attività dei terminali assoni dall'area ipotalamica laterale (LHA) che terminano nell'habenula laterale (LHb). I topi selvatici sono stati iniettati con un virus adeno-associato (AAV) codifica GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) nella LHA e una fibra ottica è stata impiantata con la punta immediatamente sopra la LHb (Figura 4...

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Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare ed eseguire registrazioni di fotometria multifibra, come correggere gli artefatti indipendenti dal calcio e considerazioni importanti per l'imaging di fotometria a doppio colore.

Fotometria multifibra per registrare l'attività neurale in animali liberamente

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

L'imaging CSOM in fotometria in fibra combina indicatori personalizzati geneticamente codificati e fibre ottiche per monitorare l'attività neurale in animali che si muovono liberamente. Che è fondamentale per capire come uno specifico gruppo di neuroni gioca nel dirigere o rispondere a un'azione o uno stimolo. Questa tecnica è un modo accessibile per registrare da specifiche regioni cerebrali che sono definite dalla loro connessione o profili genetici, con il controllo incorporato per separare il segnale al rumore.A dimostrare il processore sarà, Ekaterina Martianova, una studentessa laureata nel mio laboratorio. Inizia allentando tutte le viti sul traduttore a cinque assi. Avvitare il cavo patch all'adattatore apposto sul traduttore a cinque assi.Quindi accendere la luce di eccitazione di 470 nanometri a bassa potenza e posizionare la punta della fibra indicando uno scivolo di plastica auto fluorescente. Prossimo record dal semiconduttore di ossido di metallo gratuito o dalla fotocamera CMOS in modalità live. Aumentare il guadagno o regolare la tabella di ricerca fino a quando l'immagine non è visibile nel punto focale dell'obiettivo.Avanzare il traduttore a cinque assi verso l'obiettivo garantendo che la luce di 470 nanometri sia centrata sulla fibra all'estremità SMA o FC del cavo patch, fino a quando un'immagine può essere risolta sulla fotocamera. Infine, regolate gli assi X e Y fino a quando l'immagine non è centrata e ben risolta. Visualizza la luce emessa dall'estremità variola del cordone patch, in quanto dovrebbe apparire come un cerchio isotropo.Inizia accendendo tutte le luci di eccitazione per visualizzare meglio le fibre. E regolare la fotocamera guadagna in modo che nessun pixel sia saturo, e un'immagine chiara delle fibre sono presenti. Quindi scatta un'immagine preliminare.Disegna regioni di interesse o ROIS intorno alle fibre. E conservarli per la misurazione dei valori di intensità medi durante le registrazioni. Per più registrazioni in fibra, testare gli indipendenti registrando dal vivo da tutte le fibre.Puntare una fibra verso una sorgente luminosa e toccare con un dito. Osservare le fluttuazioni nel canale. Quindi applicare il nastro colorato all'estremità delle fibre per etichettare quale ROI corrisponde a quale fibra.Infine, impostare l'area di registrazione appendendo il cavo patch sopra l'arena utilizzando supporti, morsetti e supporti. Infine, assicurati che l'animale non sia limitato nel movimento dalla lunghezza della fibra e possa muoversi liberamente in tutta l'arena. Inizia ispezionando l'estremità distale delle fibre del cordone oculare e con un mini microscopio in fibra.Se la superficie delle fibre è graffiata, ri-lucidare le fibre utilizzando pellicola di lucidatura in fibra con grana fine. Quindi pulire le estremità distali del cavo patch con il 70% di etanolo e un applicatore a punta di cotone. Pulire le cannule in fibra ottica utilizzando il 70% di etanolo e un applicatore a punta di cotone.Collegare l'estremità variola del cavo patch alla fibra impiantata utilizzando una manica divisa in ceramica coperta da un tubo termoretraibile nero. Durante la connessione, assicurarsi che la manica sia stretta. Lasciare che l'animale si riprenda per alcuni minuti.Quindi inizia a registrare il segnale ottico ed esegui l'esperimento. Durante la registrazione tieni d'occhio la traccia dal vivo per garantire registrazioni di qualità. E guarda eventuali salti nel segnale, indicando che la manica non è abbastanza stretta.Per le registrazioni a doppio colore, aggiungere un LED da 516 nanometri al sistema di fotometria per eccitare il sensore di calcio fluorescente rosso e adeguati specchi e filtri dicroici. Quindi aggiungi uno splitter di immagini tra l'obiettivo e la fotocamera CMOS per separare le lunghezze delle onde di emissione verdi e rosse. Infine, disegna ROIS intorno a tutte le fibre in entrambi i colori, rosso e verde.Assicurati di identificare chiaramente ogni ROI con la fibra e il canale corrispondenti. Attiva l'eccitazione simultanea con LED da 470 nanometri e 560 nanometri e alternali a un LED da 410 nanometri. I risultati indicano che la fluorescenza misurata è aumentata significativamente in concomitanza con la somministrazione di sbuffi d'aria per topi con attivazione della via LHA-LHB.Tuttavia, nei topi che esprimono proteine fluorescenti verdi o GFP, non è stato rilevato alcun cambiamento nel segnale durante la somministrazione di sbuffi d'aria. Questa tecnica consente ai ricercatori di registrare ragionevolmente da specifici tipi di cellule in diverse regioni cerebrali. Mentre un animale si comporta liberamente.Questo ulteriormente la capacità di sezionare le funzioni di queste regioni cerebrali in relazione al comportamento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Le registrazioni EEG ad alta densità dei Topi muoversi liberamente utilizzando Polyimide a base di microelettrodi

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Ricerca

Neuroscienze

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Progettazione e assemblaggio di un ultraleggero motorizzato per Microdrive croniche Recordings neurali in animali di piccola taglia

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

Registrazione di potenziali d&#39;azione singoli neuroni &#39;di muoversi liberamente Piccioni attraverso tre fasi di apprendimento

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Registrazione di EEG nei ratti neonatali liberamente in movimento utilizzando un metodo novello

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Registrazioni simultanee di potenziali di campo locale corticale, elettrocardiogramma, elettromiogramma e respirazione ritmo da un ratto liberamente commovente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Registrazioni di EEG non invadente da muoversi liberamente suinetti

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

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Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...