Name: multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals
Uploaded: 2019-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) til CP C. P. er en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi takker også Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) for produksjon av viral vektorer som brukes i denne studien.

Alle eksperimenter ble gjort i samsvar med den institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved University of California, San Diego, og den kanadiske guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av Université Laval Animal Protection Komiteen.
1. justering av den optiske banen mellom CMOS (komplementær metalloksid halvleder) kamera og den enkelte eller forgrening patch ledningen
<ol><li>Løsne alle skruene på den 5-akse oversetteren (11, figur 2</strong...

<ol>
	<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Neural+Projection+Dynamics+Underlying+Social+Behavior.">Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior.</a> Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).</li><li>Proulx, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+pathway+controlling+motivation+to+exert+effort.">A neural pathway controlling motivation to exert effort.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).</li><li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Fiber+Photometry+Reveals+Signature+of+Future+Stress+Susceptibility+in+Nucleus+Accumbens.">In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+shapes+the+aversion+and+reward+responses+of+lateral+habenula+neurons.">Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>de Jong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neural+Circuit+Mechanism+for+Encoding+Aversive+Stimuli+in+the+Mesolimbic+Dopamine+System.">A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System.</a> Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).</li><li>Lerner, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact-Brain+Analyses+Reveal+Distinct+Information+Carried+by+SNc+Dopamine+Subcircuits.">Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits.</a> Cell. 162 (3), 635-647 (2015).</li><li>Calipari, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+temporal+signature+of+D1+and+D2+medium+spiny+neurons+in+cocaine+reward.">In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Interplay+between+Orexin+Neurons+and+Eating.">Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating.</a> Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Barker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Preoptic+Control+of+the+Lateral+Habenula+through+Convergent+Glutamate+and+GABA+Transmission.">Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission.</a> Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).</li><li>Siciliano, C. A., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+calcium+imaging+to+illuminate+circuit+dysfunction+in+addiction.">Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction.</a> Alcohol. 74, 47-63 (2018).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain.">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).</li><li>Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+multi-fiber+photometry+for+studying+large-scale+brain+circuit+dynamics.">High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics.</a> Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).</li><li>Akam, T., Walton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pyPhotometry:+Open+source+Python+based+hardware+and+software+for+fiber+photometry+data+acquisition.">pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).</li><li>Stamatakis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Hypothalamic+Area+Glutamatergic+Neurons+and+Their+Projections+to+the+Lateral+Habenula+Regulate+Feeding+and+Reward.">Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).</li><li>Tervo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons.">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Amygdala+Somatostatin+Neurons+Gate+Passive+and+Active+Defensive+Behaviors.">Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).</li><li>Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+male+aggression-seeking+behavior.">Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomically+Defined+and+Functionally+Distinct+Dorsal+Raphe+Serotonin+Sub-systems.">Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems.</a> Cell. 175 (2), 472-487 (2018).</li><li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+GCaMP6m&#8217;s+Ca2+-dependent+change+in+fluorescence.">Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m&#8217;s Ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies,+Fish,+and+Mice.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+neuronal+imaging+of+dopamine+dynamics+with+designed+genetically+encoded+sensors.">Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors.</a> Science. 360 (6396), (2018).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+for+Rapid+and+Specific+In+Detection+of+Norepinephrine.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity.">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Wang, H., Jing, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+brain:+genetically+encoded+fluorescent+sensors+for+imaging+neurotransmitters+and+neuromodulators.">Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+optoelectronic+photometers+for+monitoring+neuronal+dynamics+in+the+deep+brain.">Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Hypothalamic+Network+Dynamics+for+Appetitive+and+Consummatory+Behaviors.">Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2014).</li></ol>

Fiber fotometri er en tilgjengelig tilnærming som gjør at forskerne kan registrere bulk-kalsium dynamikk fra definerte neuronal populasjoner i fritt bevegelige dyr. Denne metoden kan kombineres med et bredt spekter av atferds tester, inkludert "Movement Heavy" oppgaver som tvang svømme tester2, frykt-condition18, sosiale interaksjoner1,4, og andre7, 8<sup...

Evnen til å koordinere nevrale reaksjoner med spesifikke aspekter av et dyrs atferd er avgjørende for å forstå rollen en bestemt gruppe neurons spiller i regi eller svare på en handling eller stimulans. Gitt kompleksiteten av animalsk atferd, med myriade av interne stater og eksterne stimuli som kan påvirke selv de enkleste av handlinger, innspilling et signal med én prøve oppløsning utstyrer forskere med de nødvendige verktøy for å overvinne disse Begrensninger.
Fiber fotometri har blitt den teknikken for valg for mange forskere innen systemer nevrovitenskap på grunn av sin relative enkelhet i forhold til andre in vivo opptaks teknikker, den høye signal-til-støy-forhold, og evnen til å spille inn i en rekke Behavioral paradigmer1,2,3,4,5,6,7,8. I motsetning til tradisjonelle elektrofysiologisk metoder, er fotometri den optiske tilnærmingen som oftest brukes sammen med genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs endre deres evne til å fluorescerer basert på om de er bundet til kalsium eller ikke. Fordi den interne konsentrasjonen av kalsium i neurons er svært tett regulert og spenning-gated kalsiumkanaler åpne når en Nevron branner en handling potensial, forbigående økning i indre kalsium konsentrasjon, noe som resulterer i forbigående økninger i evne til en GECI til fluorescens, kan være en god proxy for neuronal avfyring9.
Med fiber fotometri, eksitasjon lys er rettet ned en tynn, multimode optisk fiber inn i hjernen, og et utslipps signal er samlet tilbake opp gjennom samme fiber. Fordi disse optiske fibrene er lette og bøyelig, kan et dyr bevege seg stort sett uhindret, noe som gjør denne teknikken kompatibel med et bredt spekter av atferds tester og forhold. Noen forhold, for eksempel raske bevegelser eller bøying av fiberoptisk patch ledningen utover radius der den kan opprettholde total intern refleksjon, kan innføre signal artefakter. For å entydighetsoperatoren signal fra støy, kan vi utnytte en egenskap av GCaMP kjent som "isosbestic punkt." Kort, med GCaMP, som Bølgelengden av eksitasjon lyset er forskjøvet til venstre, dens utslipp i kalsium-bundet tilstand avtar og utslipp i kalsium-ubundet tilstand marginalt øker. Poenget der den relative intensiteten av disse to utslippene er likeverdige kalles isosbestic punktet. Når GCaMP er spent på dette punktet, er dens utslipp upåvirket av endringer i interne kalsium konsentrasjoner, og variasjonen i signalet er oftest på grunn av demping av signalet fra overbending av fiberoptisk patch ledningen eller bevegelse av nevrale vev i forhold til implantert fiber.
Single enhet elektrofysiologi er fortsatt gullstandarden for fritt-bevegelige in vivo innspillinger på grunn av sin single-celle og Single-Spike nivå oppløsning. Imidlertid, den kan vanskelig å finne det molekylær sammenfalle av cellene tilværelse registrert, og det stolpe-hoc analyse kan helt arbeidskrevende. Mens fiber fotometri ikke har en enkelt celle oppløsning, gjør det at forskerne å stille spørsmål umulig å ta opp med tradisjonelle teknikker. Kombinere viral strategier med transgene dyr, kan uttrykket av GECIs rettes til genetisk definerte neuronal typer til posten befolkning-eller projeksjon-definert neural aktivitet, som kan utføres ved å overvåke kalsium signal direkte på axon terminaler10,11. Videre, ved å implanting flere fiberoptiske kanyler, er det mulig å samtidig overvåke neural aktivitet fra flere hjerneregioner og stier i samme dyr12,13.
I dette manuskriptet beskriver vi en teknikk for single og multi-fiber fotometri, hvordan du korrigerer for kalsium-uavhengige artefakter, og detalj hvordan du utfører mono-og dual-Color innspillinger. Vi gir også eksempler på spørsmål som gjør det mulig for en å spørre og deres økende grad av kompleksitet (se figur 1). Fiber fotometri oppsett for multi-fiber innspillinger beskrevet i denne protokollen kan bygges ved hjelp av en liste over materialer som finnes på https://sites.google.com/view/multifp/hardware (figur 2).
Det er viktig at systemet er utstyrt for både 410 NM og 470 NM eksitasjon bølgelengder for kalsium-uavhengige og kalsium-avhengige fluorescens utslipp fra GCaMP6 eller dens varianter. For Custom-bygget oppsett eller hvis det ikke er tilgjengelig programvare for å kjøre systemet, gratis, åpen kildekode-program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) kan brukes. Alternativt kan fiber fotometri kjøres gjennom MATLAB (f. eks https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller andre programmeringsspråk14. Programvaren og maskinvaren i systemet bør tillate manipulering av både 410 NM og 470 NM lysdioder og kameraet, utvinning av bilder (figur 2), og beregning av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet i regionene av interesse (ROIs) trukket rundt fibrene på bildene. Utdataene bør være en tabell med gjennomsnittlig intensitet verdier registrert med 470 NM og 410 NM lysdioder fra hver fiber i patch ledningen. Når du utfører multi-fiber eksperimenter, kan 400 μm med følgende fibre begrense bevegelsen av mus. I slike tilfeller anbefaler vi å bruke 200 μm patch ledninger, som gir mer fleksibilitet. Det kan også være mulig å bruke mindre dummy kabler under trening av mus.
Det er avgjørende å kunne trekke ut tid poeng for hendelser av interesse under fiber fotometri oppkjøp. Hvis systemet ikke lett gir et innebygd system for å integrere TTLs for spesifikke hendelser, er en alternativ strategi å tildele en tidsangivelse til individuelle tidspunkt som er registrert for å samsvare med bestemte tider og hendelser under eksperimentet. Time stempling kan gjøres ved hjelp av datamaskinen klokken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;m, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M59L01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Optical Post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.7 mm Pedestal Post Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RMS20X</td>
			<td>#10 in Figure 2, #11 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-DCH/M</td>
			<td>#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_405</td>
			<td>#2 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB410-10</td>
			<td>#5 in Figure 2; #7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>465 nm. LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_465</td>
			<td>#1 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm bandpass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>#4 in Figure 2; #6 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-560/14-25</td>
			<td>#5 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm LED</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>CLED_560</td>
			<td>#1 in Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-axis kinematic Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>K5X1</td>
			<td>#11 in Figure 2, #12 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A-ML</td>
			<td>#7 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for 405 collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD11F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor for ajustable collimator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AD127-F</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CF125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CM1-CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual 493/574 dichroic</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF493/574-Di01-25x36</td>
			<td>#10 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter for GCaMP6</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-535/22-25</td>
			<td>#6 in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enclosure with Black Hardboard Panels</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Externally SM1-Threaded End Cap for Machining</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1CP2M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1QP</td>
			<td>#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Collimator for 405 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F671SMA-405</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed collimator for 470 and 560 nm light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>F240SMA-532</td>
			<td>#3 in Figure 2; #4 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-520/35-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC3260M</td>
			<td>#13 in Figure 2, #15 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light beam splitter</td>
			<td>Neurophotometrics</td>
			<td>SPLIT</td>
			<td>#14 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP425R</td>
			<td>#8 in Figure 2, #9 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03</td>
			<td>#9 in Figure 2, #8 in Figure 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabond dental cement</td>
			<td>C&#38;B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M8 - M8 cable</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>Cable_M8-M8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber cannulas</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber Patchcords</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td></td>
			<td>Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-600/37-25</td>
			<td>In light beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 LabJack</td>
			<td>LabJack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-cube LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CAB-DCU-T3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-fiber photometry to record neural activity in freely-moving animals

Registrering av aktiviteten til en gruppe neurons i et fritt bevegelig dyr er en utfordrende oppgave. Videre, ettersom hjernen er dissekert i mindre og mindre funksjonelle undergrupper, blir det avgjørende å ta opp fra anslag og/eller genetisk definerte subpopulasjoner av neurons. Fiber fotometri er en tilgjengelig og kraftfull tilnærming som kan overvinne disse utfordringene. Ved å kombinere optiske og genetiske metoder, kan neural aktivitet måles i dype hjernens strukturer ved å uttrykke genetisk kodet kalsium indikatorer, som oversetter nevrale aktivitet til et optisk signal som lett kan måles. Den nåværende protokollen detaljer komponentene i en multi-fiber fotometri system, hvordan få tilgang til dype hjernens strukturer for å levere og samle lys, en metode for å ta høyde for bevegelse artefakter, og hvordan å behandle og analysere fluorescerende signaler. Protokollen detaljer eksperimentelle betraktninger når du utfører enkel og dobbel farge Imaging, fra enten én eller flere implantert optiske fibre.

Neural relaterer av atferdsmessige responser kan variere avhengig av en rekke faktorer. I dette eksempelet, vi brukte in vivo fiber fotometri å måle aktiviteten av axon terminaler fra lateral hypothalamus området (LHA) som opphører i lateral habenula (LHb). Wild type mus ble injisert med en adeno-assosiert virus (AAV) koding GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) i LHA og en optisk fiber ble implantert med spissen umiddelbart over LHb (Figur 4A). GCaMP6s uttrykket er funnet i cellen...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals at JoVE.com

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Denne protokollen detaljer hvordan å implementere og utføre multi-fiber fotometri innspillinger, hvordan å korrigere for kalsium-uavhengige gjenstander, og viktige hensyn for dual-Color fotometri Imaging.

Multi-fiber fotometri å Record neural aktivitet i fritt bevegelige dyr

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Fiber fotometri CSOM imaging kombinerer genetisk kodet tilpasset indikator og optiske fibre for å overvåke nevrale aktivitet i fritt bevegelige dyr. Som er avgjørende for å forstå hvordan en bestemt gruppe nevroner spiller i å lede eller reagere på en handling eller en stimulans. Denne teknikken er en tilgjengelig måte å registrere fra bestemte hjerneregioner som er definert av deres tilkobling eller genetiske profiler, med innebygd kontroll for å skille signal til støy.Viser prosessoren vil være, Ekaterina Martianova, en utdannet student i laboratoriet mitt. Begynn med å løsne alle skruene på den femakseoversetteren. Skru inn plasterledningen til adapteren som er festet til den femakseoversetteren.Slå deretter på 470 nanometer eksitasjonslys ved lav effekt og plasser tuppen av fiberen som peker til en automatisk fluorescerende plastsklie. Neste post fra den kostnadsfrie metalloksid halvleder eller CMOS kamera i live-modus. Øk forsterkningen eller juster oppslagstabellen til bildet er synlig på fokuspunktet for målet.Gå frem den femakseoversetteren mot målet, slik at 470 nanometerlyset er sentrert på fiberen på SMA- eller FC-enden av patchledningen, til et bilde kan løses på kameraet. Til slutt justerer du X- og Y-aksene til bildet er sentrert og godt løst. Visualiser lyset som sendes ut fra variole enden av patch ledningen, som det skal vises som en isotropisk sirkel.Start med å slå på alle eksitasjonslysene for å bedre visualisere fibrene. Og juster kameragevinsten slik at ingen piksler er mettet, og et klart bilde av fibrene er tilstede. Deretter tar du et foreløpig bilde.Tegn områder av interesse eller rois rundt fibrene. Og hold dem for måling av gjennomsnittsintensitetsverdiene under opptak. For flere fiberopptak, test for uavhengige ved live opptak fra alle fibre.Pek en fiber mot en lyskilde, og trykk med en finger. Vær oppmerksom på svingninger i kanalen. Deretter påfør farget tape på enden av fibrene for å merke hvilken avkastning som tilsvarer hvilken fiber.Til slutt setter du opp opptaksområdet ved å henge patchledningen over arenaen ved hjelp av stativer, klemmer og holdere. Til slutt, sørg for at dyret ikke vil være begrenset i bevegelse av lengden på fiberen og kan fritt bevege seg gjennom hele arenaen. Begynn med å inspisere den distale enden av fibrene i patchledningen for øye, og med et minifibermikroskop.Hvis overflaten av fibrene er riper, re-polere fibrene ved hjelp av fiber polering film med fin grus. Rengjør deretter de distale endene av plasterledningen med 70 % etanol og en bomullsspissapplikator. Rengjør de fiberoptiske kanylene ved hjelp av 70% etanol og en bomullsspissapplikator.Koble variole enden av patch ledningen til implantert fiber ved hjelp av en keramisk delt hylse dekket med en svart krympe rør. Under tilkoblingen må du kontrollere at hylsen er tett. La dyret komme seg i noen minutter.Begynn deretter å ta opp det optiske signalet, og kjør eksperimentet. Mens opptak holde et forsiktig øye med live spor for å sikre kvalitet opptak. Og se etter eventuelle hopp i signal, noe som indikerer at ermet ikke er stramt nok.For de doble fargeopptakene legger du til en 516 nanometer LED til fotometrisystemet for å opphisse den røde fluorescerende kalsiumsensoren, og passende dichroic speil og filtre. Legg deretter til en bildesplitter mellom målet og CMOS-kameraet for å skille de grønne og røde utslippsbølgelengdene. Til slutt trekker du ROIS rundt alle fibrene i begge farger, røde og grønne.Sørg for å tydelig identifisere hver avkastning med tilsvarende fiber og kanal. Trigger samtidig eksitasjon med 470 nanometer og 560 nanometer lysdioder, og veksle dem med en 410 nanometer LED. Resultatene indikerer at den målte fluorescensen økte betydelig samtidig med administrering av luftpuss for mus med aktivering av LHA-LHB-banen.Men hos mus som uttrykker grønt fluorescerende protein eller GFP, ble det ikke oppdaget noen endring i signalet under administrering av luftpups. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å registrere fra spesifikk type celler i forskjellige hjerneregioner. Mens et dyr oppfører seg fritt.Dette videre evnen til å dissekere funksjonene til disse hjerneområdene når de forholder seg til atferd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enheten opptaket Metoder for å karakterisere nevrale aktiviteten i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretser

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

Opptak single nevroner &#39;aksjonspotensialer fra Fritt Moving Pigeons Across tre stadier av læring

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Neural aktivitet Formering i utfoldet hippocampus Forberedelse med en Penetrating Micro-elektrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A Novel Behavioral analyse for å undersøke Gustatory Responses av individuelle, Fritt bevegelige Bumble Bees (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

Registrering av EEG i fritt bevegelige neonatale rotter ved hjelp av en ny metode

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Samtidig opptak av kortikale lokale feltet potensialene, elektrokardiogram, eletromyografi og puste rytmen fra en fritt flyttende rotte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

Noninvasiv EEG opptak fra fritt flytte grisunger

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Microdialysis av eksitatoriske aminosyrer under EEG opptakene i fritt flytte rotter

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...