इस प्रोटोकॉल ने हमारे पास अब तक की कुछ बेहतरीन अंतर्दृष्टि प्राप्त की है कि कैसे कैंडिडा एल्बिकान स्तनधारी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में रहता है। उदाहरण के लिए, हाल ही में जब तक, हमें वास्तव में नहीं पता था कि कैंडिडा आंत के भीतर स्थानीयकृत है या इसके कई रूपात्मक रूपों में से कौन सा यह इस जगह के भीतर मानता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक तीन आयामी बातचीत को बाधित किए बिना अपने प्राकृतिक वातावरण के भीतर कैंडिडा कल्पना करने की अनुमति देता है कवक मेजबान संरचनाओं के साथ या माइक्रोबायोटा में बैक्टीरिया के साथ है ।

क्योंकि आंत एक जटिल वातावरण है, प्रयोगशाला में मॉडल करना बहुत मुश्किल है और इसलिए एक मेजबान मॉडल में सीधे कैंडिडा जीव विज्ञान की जांच करने का तरीका खोजना बहुत संतोषजनक रहा है। कैंडिडा एल्बिकान सहित आंत माइक्रोबायोटा के कुछ घटकों को भड़काऊ आंत्र रोग जैसे रोगों में भूमिका निभाने की आशंका है । इस तकनीक का उपयोग संभावित रूप से रोगियों से प्राप्त बायोप्सी नमूनों में विशिष्ट सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति का निदान करने के लिए किया जा सकता है।

गैवेज तकनीक की महारत और अंगों को फाड़े बिना गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सेगमेंट को विच्छेदन करने की क्षमता इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, दिए गए इनोकुलम की गणना की गई मात्रा के साथ प्रत्येक जानवर को ̈वज करें। एक मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक ऑटोक्लेव पशु खिला सुई संलग्न करें और सभी बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करते हुए एक gavage मात्रा के साथ सिरिंज भरें ।

सिरिंज को बाँझ सतह पर रखें। जानवर को सुरक्षित करने के लिए, इसे प्रमुख हाथ से पूंछ के आधार पर पकड़ें और जानवर की पीठ को कानों के पीछे ढीली त्वचा पर पीछे स्लाइड करें। स्क्रफ को अंगूठे और तर्जनी के साथ कसकर इकट्ठा करें।

स्क्रफ द्वारा जानवर को उठाएं, इसे पलटें और हाथ की हथेली के खिलाफ जानवर को स्थिर करने के लिए पूंछ के चारों ओर एक ही हाथ की छोटी उंगली को लूप करें। धीरे-धीरे जानवर के सिर को बढ़ाएं ताकि वह शरीर के साथ एक सीधी रेखा में हो। फिर सिरिंज को प्रमुख हाथ से उठाएं और इसे घुमावदार सुई के साथ जानवर के लंबवत पकड़ें।

मुंह के एक अंदर के कोने को धीरे से हुक करने के लिए सुई की गेंद का उपयोग करें और मुंह के किनारे सुई को गले के पीछे तक ले जाएं, फिर सुई को केंद्र में ले जाएं। एक बार जब सुई की गेंद जानवर के गले के पीछे होती है, तो सुई को ऊपर झुकाएं ताकि यह जानवर के शरीर की रेखा के समानांतर हो और इसे गले के नीचे आसानी से स्लाइड करने की अनुमति दे। यदि सुई गले के नीचे सुचारू रूप से स्लाइड नहीं करती है, तो सुई ठीक से तैनात नहीं हो सकती है और इसे फिर से स्थान देने और फिर से प्रयास करने के लिए वापस लिया जाना चाहिए।

सुई को आसानी से आगे बढ़ाते हैं जिससे जानवर सुई निगल जाता है जब तक कि केवल कुछ मिलीमीटर दिखाई न दे। परीक्षण करें कि सुई की गेंद धीरे-धीरे प्लंजर को आगे बढ़ाते हुए पेट में है और यदि कोई प्रतिरोध नहीं है, तो इनोकुलम वितरित करना जारी रखें। धीरे-धीरे सुई वापस लेने के बाद एक बार इनोकुलम प्रशासित किया गया है और जानवर को अपने पिंजरे में रखें।

परिश्रम सांस लेने या संकट के संकेत के लिए पांच से 10 मिनट के लिए जानवर की निगरानी जारी रखें और सत्यापित करें कि यह gavage के तुरंत बाद सामान्य गतिविधि फिर से शुरू करता है। यदि अगले जानवर के लिए एक ही इनोकुलम का उपयोग किया जाएगा, तो सुई को अल्कोहल पोंछ के साथ साफ करें। यदि एक अलग इनोकुलम का उपयोग किया जाएगा, तो सुई को बदलें।

पेट की त्वचा के एक वर्ग को चुटकी लेने के लिए कुंद-समाप्त संदंश का उपयोग करें और कैंची का उपयोग करके श्रोणि के आधार के पास त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी को चीरना करें। पेरिटोनियल गुहा के प्रत्येक पक्ष के साथ एक यू-आकार में चीरा बढ़ाएं और रिबकेज तक, फिर त्वचा को रास्ते से बाहर उठाएं। सीकम और छोटी और बड़ी आंतों के बीच कनेक्शन तोड़ने के लिए कैंची का उपयोग करके पेरिटोनियल गुहा से धीरे-धीरे सीकम निकालने के लिए कुंद-समाप्त संदंश का उपयोग करें।

पूरे सीकम को हिस्टोलॉजी कैसेट में रखें ताकि वह अनटवेटेड हो और फ्लैट लेट जाए। दूसरा फोम पैड को ऊपर रखें और कैसेट बंद करें। फिर कैसेट को मेथाकारन युक्त स्क्रू कैप जार में रखें।

बड़ी आंतों के उस खंड को उत्पादित करें जिसमें एक से दो मल छर्रे होते हैं और कैसेट की तुलना में लंबाई कम होती है। ऊतक को सपाट और अनटिस्ट रखते हुए कैसेट में रखें। इसे दूसरे फोम पैड के साथ ओवरले करें, कैसेट को बंद करें और इसे मेथाकारन में रखें।

छोटी आंत के प्रत्येक खंड के लिए नमूना किया जाना है, एक से दो सेंटीमीटर खंड है कि कुछ पाचन सामग्री होते हैं आबकारी । ऊतक को कैसेट में रखें, दूसरे फोम पैड के साथ ओवरले करें, कैसेट को बंद करें और इसे मेथाकारन में डाल दें। पेट को उत्तेजित करते समय, घेघा और छोटी आंतों के कनेक्शन तोड़ दें।

टिश्यू को कैसेट में रखें और मेथाकारन में कैसेट रखें। कमरे के तापमान पर मेथाकार्न समाधान में कैसेट को कम से कम तीन घंटे लेकिन दो सप्ताह से कम छोड़ दें। निर्धारण के बाद, फोम पैड को हटा दें और प्रत्येक अक्षुण्ण ऊतक अनुभाग को अपने कैसेट में वापस करें।

फिर ऊतकों को 100% मेथनॉल में 35 मिनट के लिए दो बार धोएं, 100% इथेनॉल में 25 मिनट के लिए दो बार, और दो बार जाइलीन में 20 मिनट के लिए। एक कागज तौलिया पर कैसेट सूखी पैट और उन्हें एक संकरण ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए एक पूर्व पिघल पैराफिन मोम में जगह है। फिर मोम से कैसेट निकालें, अतिरिक्त मोम को नाली और उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करने की अनुमति दें जब तक कि वे मोम ब्लॉक में एम्बेडेड न हों।

जाइलीन से भरे प्री-गर्म जार में स्लाइड डालकर पैराफिन एम्बेडेड हिस्टोलॉजिकल सेक्शन को डी-वैक्स करें। जार को 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें, फिर जाइलीन वॉश को छोड़ दें। जार में ताजा कमरे के तापमान जाइलीन डालो और इनक्यूबेशन दोहराएं।

फिर जार को 100% इथेनॉल से भरें और इसे पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, जार से स्लाइड निकालें और हवा उन्हें सूखी। मछली की जांच के साथ सी एल्बिकान को दाग देने के लिए, पैट पेन का उपयोग करके ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक सर्कल खींचकर शुरू करें।

पिपेट 50 माइक्रोलीटर की जांच जिसमें हाइब्रिडाइजेशन समाधान होता है और धीरे-धीरे इसे पिपेट टिप के साथ फैलाया जाता है। तरल को संकरण कवर्लिप के साथ ओवरले करें जिससे बुलबुले को रोकना सुनिश्चित हो। फिर स्लाइडों को पानी तंग संकरण कक्ष में सील करें और अंधेरे में एक संकरण ओवन में 50 डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें।

इनक्यूबेशन के बाद, एक कोप्लिन जार में धोने का समाधान जोड़ें। सावधानी से स्लाइड से कवरस्लिप को संदंश के साथ हटा दें और स्लाइड को वाशिंग सॉल्यूशन में रखें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ जार को कवर और 20 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर यह इनक्यूबेट ।

आगे की स्लाइड्स में देखें वॉशिंग सॉल्यूशन को डालकर पीबीएस के साथ जार को रिफिल करके। तुरंत बंद डालो और ताजा PBS के साथ फिर से भरना दो वॉश की कुल के लिए प्रक्रिया दोहरा । एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ PBS दूर बातें और एक पैट कलम के साथ आंतों के ऊतक अनुभाग सर्कल ।

स्लाइड्स में एक अपारदर्शी प्लास्टिक कंटेनर में रखें और टिश्यू सेक्शन में म्यूसिन न्यूक्लियी स्टेनिंग सॉल्यूशन के 50 माइक्रोलीटर डालें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कंटेनर को कवर करें और इसे 45 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, स्लाइड्स को एक कॉपलिन जार में डाल दें और उन्हें पीबीएस के साथ दो बार धोएं।

एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त PBS दूर नल और फिर दूर एक ऊतक के साथ अंतिम बूंदों बाती । प्रत्येक खंड पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और बुलबुले को रोकने के लिए सुनिश्चित करने के लिए एक ग्लास कवरलिप के साथ ओवरले करें। पूरे कवरस्लिप के तहत बढ़ते माध्यम को फैलने दें।

कोनों पर नेल पॉलिश के साथ जगह में कवरलिप लंगर और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड छवि । इस प्रोटोकॉल का उपयोग फ्लोरोसेंटली लेबल सी एल्बिकान इन विट्रो और मेजबान ऊतकों में किया जा सकता है। इन विट्रो प्रचारित हाइफा, गोल खमीर कोशिकाओं, आंत कोशिकाओं, और अपारदर्शी कोशिकाओं को तय किया गया था, परमीलित, और फ्लोरेसेंस और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ प्रतिष्ठित किया गया था।

माउस बड़ी आंतों में गोल खमीर और अत्यधिक लम्बी हाइफाई को चित्रित किया गया था। मेजबान ऊतकों C.albicans विशिष्ट जांच या panfungal जांच के साथ दाग थे । C.albicans लाल, मेजबान सेल नाभिक नीला, और बलगम परत हरे रंग का लेबल था ।

सी एल्बिकान का पता मुरीन जीआई ट्रैक्ट के विभिन्न खंडों में लगाया गया था, जिसमें मेजबान म्यूकोसा और आंत के अधिक केंद्रीय क्षेत्रों से तुरंत सटे क्षेत्र शामिल थे। वैज्ञानिकों के लिए जिन्होंने पहले गैवेज तकनीक का प्रदर्शन नहीं किया है, इस विधि के प्रयास से पहले विशेष प्रशिक्षण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। मछली धुंधला होने के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंट तकनीकों का उपयोग मेजबान म्यूकोसा की अतिरिक्त विशेषताओं को दागने के लिए किया जा सकता है।

यह ऊतक क्षति या मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दे सकता है। इस तकनीक ने हमें कैंडिडा एल्बिकान म्यूटेंट के फंगल सेल आकृति विज्ञान और मेजबान के भीतर अस्तित्व के बीच संबंधों की विशेषता के लिए अनुमति दी है, जो कैंडिडा एल्बिकान जीव विज्ञान की हमारी समझ को आगे बढ़ा रहा है जिसे उपचार विकसित करते समय लाभ उठाया जा सकता है।

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