11.1K Views
•
10:08 min
•
November 5th, 2019
DOI :
November 5th, 2019
•0:04
Title
3:30
Preparation of GI Tissues for Histology
5:50
FISH Staining in GI Tract Tissues
9:17
Conclusion
1:28
Gastrointestinal Colonization of Mice with C. albicans Using Oral Gavage
8:22
Results: FISH-stained C. albicans In Vitro and in Different Gut Compartments
Transcript
Detta protokoll har gett några av de bästa insikterna vi har hittills i hur Candida albicans bebor däggdjurs-mag-tarmkanalen. Till exempel, tills nyligen, vi visste inte riktigt var Candida är lokaliserad i tarmen eller vilken av dess många morfologiska former den antar inom denna nisch. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter en att visualisera Candida inom sin naturliga miljö utan att störa de tredimensionella interaktioner svampen har med värdstrukturer eller med bakterier i mikrobiotan.
Eftersom tarmen är en komplex miljö, det är mycket svårt att modellera i laboratoriet och därför har det varit mycket tillfredsställande att hitta ett sätt att sond Candida biologi direkt i en värdmodell. Vissa komponenter i tarmfloran inklusive Candida albicans misstänks spela roller i sjukdomar som inflammatorisk tarmsjukdom. Denna teknik kan potentiellt användas för att diagnostisera förekomsten av specifika mikroorganismer i biopsi exemplar som erhållits från patienter.
Behärsk av sondmatning tekniken och förmågan att dissekera gastrointestinala segment utan att riva organen är viktigt för att få optimala resultat. För att starta, sondmatning varje djur med den beräknade volymen av en given inokulat. Fäst en autoklaverad djur utfodring nål till en en milliliter spruta och fyll sprutan med en sondmatning volym se till att ta bort alla bubblor.
Placera sprutan på en steril yta. För att säkra djuret, håll den vid svansens bas med den dominerande handen och skjut den icke-dominerade handen upp djurets rygg mot den lösa huden precis bakom öronen. Samla ihop scruffen tätt med tummen och pekfingret.
Plocka upp djuret vid scruff, vänd den över och slinga det lilla fingret på samma hand runt svansen för att immobilisera djuret mot handflatan. Försiktigt förlänga djurets huvud så att det är i en rak linje med kroppen. Ta sedan upp sprutan med den dominerande handen och håll den vinkelrätt mot djuret med den böjda nålen pekande nedåt.
Använd nålens kula för att försiktigt krok en insidan hörnet av munnen och föra nålen längs sidan av munnen till baksidan av halsen, flytta sedan nålen till mitten. När nålens kula är på baksidan av djurets hals, luta nålen uppåt så att den är parallell med djurets kroppslinje och låta den glida smidigt ner i halsen. Om nålen inte glider smidigt ner i halsen, kan det hända att nålen inte är ordentligt placerad och bör dras tillbaka för att flytta och försöka igen.
Smidigt föra nålen gör det möjligt för djuret att svälja nålen tills endast några millimeter förblir synliga. Testa att nålens boll är i magen genom att försiktigt föra kolven framåt och om det inte finns något motstånd, fortsätt att leverera inokulatet. Dra långsamt tillbaka nålen när inokulat har administrerats och placera djuret i sin bur.
Fortsätt att övervaka djuret i fem till 10 minuter för tecken på ansträngd andning eller nöd och kontrollera att det återupptar normal aktivitet strax efter sondmatning. Om samma inokulat kommer att användas för nästa djur, rengör nålen med en alkohol torka. Om en annan inokulat kommer att användas, byt ut nålen.
Använd trubbiga-end tlyktor för att nypa en del av buken huden och incise huden och den underliggande fascia nära basen av bäckenet med sax. Förläng snittet i en U-form längs varje sida av peritoneal hålighet och upp till bröstkorgen, lyft sedan huden ur vägen. Använd trubbiga-ended tövänder för att försiktigt extrahera cecum från bukhålan med hjälp av sax för att bryta anslutningarna mellan cecum och de små och stora tarmarna.
Placera hela cecum i en histologi kassett så att den är untwisted och lägger platt. Placera den andra skumdynan ovanpå och stäng kassetten. Placera sedan kassetten i en skruvlock burk som innehåller methacarn.
Punktskatt den del av tjocktarmen som innehåller en till två fekal pellets och har en längd mindre än den i kassetten. Placera vävnaden i kassetten som håller den platt och otwisted. Överla den med den andra skumdynan, stäng kassetten och placera den i methacarn.
För varje avsnitt av tunntarmen som skall prov tas, punktskatt en en till två centimeter segment som innehåller vissa matsmältningsmaterial. Placera vävnaden i kassetten, överlägg med den andra skumdynan, stäng kassetten och lägg den i methacarn. När excising magen, bryta anslutningarna till matstrupen och tunntarmen.
Placera vävnaden i kassetten och placera kassetten i methacarn. Låt kassetterna vara kvar i mekarnlösningen i rumstemperatur i minst tre timmar men mindre än två veckor. Efter fixering, ta bort skumdynor och returnera varje intakt vävnad avsnitt i sin kassett.
Tvätta sedan vävnaderna två gånger i 35 minuter i 100%metanol, två gånger i 25 minuter i 100%etanol, och två gånger i 20 minuter i xylen. Klappa kassetterna torra på en pappershandduk och placera dem i en försmält paraffin vax i två timmar vid 70 grader Celsius i en hybridisering ugn. Ta sedan bort kassetterna från vaxet, låt överskottet vax att rinna av och förvara dem i rumstemperatur tills de är inbäddade i vaxblock.
De-vax paraffinen inbäddade histologiska sektioner genom att sätta in bilderna i en förvarad burk fylld med xylen. Låt burken vara i 60 grader Celsius i 10 minuter och kasta sedan xylentvätten. Häll färsk rumstemperaturxylen i burken och upprepa inkubationen.
Fyll sedan burken med 100%etanol och inkubera den i rumstemperatur i fem minuter. Efter inkubationen, ta bort objektglasen från burken och lufttorka dem. För att färga C.albicans med en fisk sond, börja med att rita en cirkel runt vävnaden avsnitt med hjälp av en Pat Pen.
Pipett 50 mikroliter av sond innehållande hybridiseringslösning på den fasta vävnaden och sprider den försiktigt med pipettspetsen. Överlägg vätskan med en hybridisering coverslip se till att förhindra bubblor. Sedan försegla diabilder i en vattentät hybridisering kammare och inkubera sektionerna i tre timmar vid 50 grader Celsius i en hybridisering ugn i mörkret.
Efter inkubationen, tillsätt tvättlösningen till en Coplin burk. Ta försiktigt bort täcket från objektglaset med tens och placera objektglaset i tvättlösningen. Täck burken med aluminiumfolie och inkubera den i 50 grader Celsius i 20 minuter.
Därefter tvättar du objektglasen genom att hälla av tvättlösningen och fylla på burken med PBS. Häll omedelbart av och fyll på med färsk PBS upprepa processen för totalt två tvättar. Wick bort PBS med en känslig uppgift torka och cirkel tarmvävnad avsnitt med en Pat Pen.
Placera objektglasen i en ogenomskinlig plastbehållare och tillsätt 50 mikroliter av mucinkärnor färgningslösning till vävnadssektionen. Täck behållaren med aluminiumfolie och inkubera den i fyra grader Celsius i 45 minuter. Efter inkubationen lägger du objektglasen i en Coplinburk och tvättar dem två gånger med PBS.
Knacka bort överskottet PBS på en pappershandduk och sedan transportera bort de sista dropparna med en vävnad. Placera en droppe monteringsmedium på varje sektion och överlägg den med ett glasöverdrag se till att förhindra bubblor. Låt monteringsmedium spridas under hela täcket.
Förankra täcket på plats med nagellack i hörnen och avbilda objektglasen med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. Detta protokoll kan användas för att fluorescerande etikett C.albicans in vitro och i värdvävnader. In vitro förökade hyfer, runda jästceller, tarmceller och ogenomskinliga celler var fasta, permeabilized och särskiljas med fluorescens och faskontrast mikroskopi.
Runda jäst och mycket långsträckt hyfer var avbildad i musen stora tarmar. Värd vävnader var färgas med C.albicans specifika sond eller panfungal sonden. C.albicans var märkt rött, värd cell kärnor blå, och slem lagret grönt.
C.albicans upptäcktes i olika segment av murine GI tarmkanalen inklusive regionerna omedelbart intill värd slemhinna och mer centrala regioner i gut lumen. För forskare som inte tidigare har utfört sondmatningstekniken är det viktigt att få specialiserad träning innan du försöker denna metod. Efter fisk färgning, immunofluorescerande tekniker kan användas för att fläcka ytterligare funktioner i värdslemhinnan.
Detta kan möjliggöra karakterisering av vävnadsskada eller immunsvar av värden. Denna teknik har gjort det möjligt för oss att karakterisera förhållandet mellan svamp cell morfologi av Candida albicans mutanter och överlevnad inom värden främja vår förståelse av Candida albicans biologi som kan tas tillvara när man utvecklar terapier.
Syftet med detta protokoll är att visualisera Candida albicans cell form och lokalisering i däggdjurs mag-tarmkanalen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved