Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث ألماني من خلال مركز البحوث التعاونية SFB 889 "أليات المعالجة الحسية" ووحده البحوث ل 2705 "تشريح حلبه الدماغ: هيكل, اللدونة والوظيفة السلوكية لل جسم فطر دروفيا ".

1- ذبابه الفاكهة المحورة وراثيا
<ol><li>عبور الإناث العذراء والذباب الذكور (التي أثيرت في 25 درجه مئوية في 60 ٪ الرطوبة النسبية علي 12 ساعة الضوء/الظلام) تحمل المطلوب Gal4 و UAS يبني25، علي التوالي ، لإنتاج الذباب التي الخلايا العصبية محدده من الفائدة التعبير عن المشفرة وراثيا مؤشر ...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم والذاكرة هو هدف بارز في مجال علم الأعصاب. ان امكانيه الحصول علي الجينات الوراثية واتساع الاختبارات السلوكية وسهولتها يجعلها أداه مثاليه للتحقيق في هذه الظواهر. هنا ، يتم تقديم طريقه التي من الممكن ان تصور ، داخل الذباب الفردية ، والتحوير الذ...

فك رموز أين وكيف يتم الحصول علي المعلومات في الدماغ من خلال التعلم وتخزينها فيما بعد كذاكره تشكل واحده من المهام الأكثر تحديا في علم الأعصاب1. [نيوروسكينتيفيك] البحوث قد أدت إلى مفهوم التغيير في انتقال متشابك كما الركيزة العصبية التي تكمن وراء التعلم وتكوين الذاكرة2,3. ومن المفترض انه ، اثناء التعلم ، والاتصالات متشابك بين الفرق العصبية التي تنشط خلال التصور من التحفيز يصبح تعديلها بحيث يمكن استردادها نمط النشاط مجتمعه خلال استدعاء الذاكرة ، التالي يامر العمل السلوكي في المستقبل4. وغالبا ما يتم توزيع هذه "الخلايا engram" والمشابك العصبية الخاصة بهم عبر مناطق الدماغ ومستويات المعالجة ، مما يجعل من الصعب تعيين التغييرات الملحوظة في الإرسال المتشابك إلى تعلم مهمة أو محفز. لتعريب وتصور تلك التغييرات متشابك التي ترتبط بشكل سببي لمهمة تعليمية معينه واحده يحتاج إلى نظام النموذج المناسب الذي يسمح لحصر تلك الاشتباكات العصبية بدقه.
ولمثل هذا المسعى ، فان الوحمة الصباغية هي مناسبه بشكل خاص لأنها تجمع بين البساطة النسبية للدماغ ، والثراء السلوكي ، وامكانيه الوصول التجريبية. ومن بين الكائنات الحية النموذجية الراسخة ، تقع دروفيبيلا بين الديدان الخيطية c. ايلينيسيس والثدييات العريكته وراثيا مثل الفئران من حيث تعقيد الخلايا العصبية. لوحظ عدد نمطي من الخلايا العصبية (~ 300) والذخيرة السلوكية محدوده في c. اليجنس. الثدييات ، من ناحية أخرى ، لديها الملايين من الخلايا العصبية والتعقيد السلوكي المذهل. الدماغ من ذبابه الفاكهة هو ، مع لها ~ 100,000 ، الخلايا العصبية أصغر بكثير من أدمغه معظم الفقاريات ، والعديد من الخلايا العصبية التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي5. ومع ذلك ، تعرض دروفيسيلا طيفا واسعا من السلوكيات المعقدة ، بما في ذلك القدرة علي إظهار التعلم الشمي النقابي القوي وتكوين الذاكرة ، والتي تم وصفها لأول مره منذ 40 سنه6. في سياق هذا الاجراء تكييف الكلاسيكية ، وتخضع مجموعات من الذباب إلى رائحة كما التحفيز المشروط (CS +) في حين انها تتلقي صدمه كهربائيه معاقبه كحافز غير مشروط (الولايات الامريكيه). ثم تعرض الرائحة الثانية (CS-) دون اي عقاب. التالي ، تعلم الحيوانية لتجنب رائحة المرتبطة العقاب ، والتي يمكن اختبارها في حاله اختيار اللاحقة بين الروائح اثنين ،cs + و cs-. العمل علي تشريح الركيزة العصبية الكامنة وراء هذا السلوك في دروكوفيلا وقد حددت جثث الفطر (MB) كموقع الرئيسي لل "engram"7,8,9,10 ولذلك ، كانت دوائر هذه المنطقة الدماغ وهو موضوع البحوث المكثفة من أجل الكشف عن المنطق الذي يتم الحصول علي الذاكرة انغرام وتخزينها (استعرضت مؤخرا في11،12).
تتكون المكونات من الخلايا العصبية الذاتية من 2,000 تقريبا (كريات كينيون) في نصف الكره الارضيه ، ويتم تنظيمها بالتوازي مع إسقاطات محواري13. يتم توسيع axons من الخلايا العصبية الإسقاط حاسة الشم إلى البروتوسيريبرا الجانبية والي calyces ميغابايت, موقع الإدخال الرئيسية الشجيرية من ميغابايت وتلقي المدخلات حاسة الشم من الفصوص الهوائية. تشكل المجموعة الطويلة والمتوازية من خلايا كينيون العم المتجول والفصوص. معظم خلايا كينيون تشكيل الأفقي β/الفصوص من خلال تمديد ضمان واحد نحو خط الوسط من الدماغ ، والعمودي α/α'-فصوص عن طريق تمديد الجانبية الثانية إسقاط في الاتجاه الظهري الامامي. يشكل الأخرى مجموعه من [كينيون] خلايا ال [γ-فصوص] أفقيه13 من ال [مب] حيث ال يعلم عمليه ولاحقه [شورت-ترم] ذاكره تشكيل استطاع كنت مترجمه10. الفصوص ميغابايت تلقي المدخلات الزبائ وتوفير الناتج افيرينت ، وكلاهما يقتصر عاده علي المناطق الفرعية مجزا متميزة علي طول الخلية كينيون محاور14،15،16. وعلي وجه الخصوص, وقد ثبت الخلايا العصبية الإدخال MB المدخلات التي تتوسط القيمة, علي سبيل المثال, العقابية, تعزيز الآثار في التعلم حاسة الشم النقابي15,17. نمطي والخلايا العصبية الناتجة افيرينت MB التي يمكن التعرف عليها بشكل فردي من فصوص الجسم الفطر دمج المعلومات عبر اعداد كبيره من الخلايا Kenyon ، واستهداف مناطق الدماغ المتنوعة وتحمل السلوك--مفيده المعلومات الايجابيه أو افئيه15 . وقد ادي هذا العمارة العصبية إلى مفهوم تنظيم engram النقابي. يتم ترميز الروائح بدقه نسبيا من قبل الفرق القليلة التنشيط من خلايا كينيون. النشاط المتزامن لهذه الفرق الخلية كينيون والإفراج عن الدوبامين التي اثارها معاقبه المحفزات-ينظم انتقال من الخلية كينيون presynapses علي الخلايا العصبية إخراج ميغابايت من هذا القبيل ان الكائنات سوف تجنب في وقت لاحق هذه الرائحة خاصه10 ،12. نحن نستخدم هذا بدقه محدده والمترجمة انغرام كحاله نموذجيه لتوضيح كيف يمكن تحديد هذه التغييرات المعتمدة علي التعلم في النشاط متشابك ورصدها.
تعتمد قيمه دروفيبيلا كنظام نموذجي بقوة علي الاداات الوراثية التي لا مثيل لها والتي تسمح لأحد بالتعبير عن الجينات للتعرف علي الخلايا العصبية الواحدة ومراقبتها والتحكم فيها داخل الدوائر المعقدة18. ظهور تقنيات لرصد نشاط الخلايا العصبية-مثل التصوير الكالسيوم ، وناقش هنا-وقد سمح لتحديد أنماط النشاط العصبية استجابه لتحفيز محدده. من خلال الجمع بين التعبير Gal4 محدده من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (جيكيس) مع التحفيز حاسة الشم ، يمكن للمرء ان تصور ديناميات الكالسيوم التي أثارت رائحة الخلايا العصبية من الفائدة19. في هذا البروتوكول ، يظهر انه من خلال اقتران هذه التقنية مع نموذج التكييف الكلاسيكي ، من الممكن فحص هذه الاستجابات الشميه في سياق التعلم. اللدونة التي يسببها التعلم يمكن تشريحها باستخدام جيكليس فقط المترجمة إلى الخلايا العصبية محدده واحده ، ولكن أيضا إلى مقصورات فرعيه معينه من الخلايا العصبية. Pech et al.20 إنشات مجموعه مختاره من الاداات التي تسمح بالبالضبط هذا. من خلال استهداف GCaMP321 اما قبل أو بعد المشبك-عن طريق الربط إلى فقاري سينابتوفيسين أو dهوميروس ، علي التوالي20-يمكن تمييز التحوير التفاضلي لهذه المواقع. هذا التعريب يضفي ، في هذا السياق ، ميزه علي معظم جيليس التي هي موجودة بشكل مطلق في جميع انحاء عصارة-علي سبيل المثال ، gcamp22، GCaMP321، أو GCaMP623 -لأنه يعني ان العابرين قبل و بوستسينابتيك يمكن ان يكون متميزة عن تدفق الكالسيوم المتكامل الشامل الذي يحدث نتيجة لتنشيط الخلايا العصبية. وهذا يمكن ان توفر أدله حول الموقع وأنواع اللدونة التي تحدث نتيجة أو التي تسبب التعلم وتكوين الذاكرة. علي سبيل المثال ، البروتوكول المقدم هنا يظهر قيمه هذه الاداه في فك رموز التحوير من الخلايا العصبية الناتج MB خلال التعلم النقابي حاسة الشم عن طريق استهداف التعبير من مستشعر الكالسيوم إلى ما بعد المشبك فقط. عن طريق الرصد ، داخل ذبابه الفردية ، والنشاط اثار رائحة قبل وبعد تكييف حاسة الشم يمكن رسمها مقارنه مباشره بين استجابه رائحة ساذجه واستجابه رائحة المستفادة. بينما الثابتة في نفس غرفه التصوير ، ويتعرض الذباب لمجموعه مختاره من الروائح. ثم ، فانها تتلقي بروتوكول تكييف النقابي مكره فيها واحده من هذه الروائح يقترن مع صدمه كهربائيه (تصبحcs +) ويتم تقديم رائحة أخرى دون تعزيز (تصبح cs-). وأخيرا ، يتعرض الذباب مره أخرى لنفس الروائح كما هو الحال في الخطوة الاولي. ويلاحظ ديناميات الكالسيوم باستخدام اثنين من الفوتون المجهري.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

عقود من البحوث في العديد من الكائنات الحية النموذجية أدت إلى المفهوم الحالي للدونة متشابك الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. وغالبا ما يتم توزيع التغييرات الناجمة عن التعلم في انتقال متشابك عبر العديد من الخلايا العصبية ومستويات المعالجة في الدماغ. ولذلك ، هناك حاجه إلى أساليب لتصور اللدونة متشابك تعتمد علي التعلم عبر الخلايا العصبية. وتمثل ذبابه الفاكهة الصباغية الحية نموذجا مناسبا لدراسة الدوائر العصبية الكامنة وراء التعلم. البروتوكول المعروض هنا يوضح الطريقة التي العمليات الكامنة وراء تشكيل الذكريات الشميه النقابية ، اي النشاط متشابك وتغييراتها ، يمكن رصدها في الجسم المجري. باستخدام المجموعة الواسعة من الاداات الجينية المتوفرة في دروفيسيلا، من الممكن التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا في مجموعات الخلايا المحددة وحتى الخلايا المفردة. من خلال إصلاح ذبابه في مكان ، وفتح كبسوله الراس ، فمن الممكن لتصور ديناميات الكالسيوم في هذه الخلايا في حين تقديم المحفزات حاسة الشم. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نثبت وجود اعداد يمكن ان يتعرض فيه الذبابة ، في الوقت نفسه ، للصدمات الكهربائية في الجسم. وهذا يوفر نظام الذباب التي يمكن ان تخضع لتكييف حاسة الشم الكلاسيكية-حيث يتم تعلم رائحة ساذجه سابقا ان تترافق مع عقوبة الصدمة الكهربائية-في نفس الوقت مثل تمثيل هذه الرائحة (وغيرها من الروائح غير المدربة) هو لوحظ في الدماغ عن طريق المجهر اثنين من الفوتون. وقد ابلغ مختبرنا في السابق عن توليد أجهزه استشعار الكالسيوم المترجمة بالمشبك ، والتي تمكن المرء من حصر إشارات الكالسيوم الفلورية في مقصورات ما قبل أو بعد المتشابك. يوفر المجهر ثنائي الفوتون وسيله لحل الهياكل الدقيقة مكانيا. ونحن مثال علي ذلك من خلال التركيز علي الخلايا العصبية دمج المعلومات من الجسم الفطر, مركز النظام اعلي من الدماغ الحشرات. عموما ، يوفر هذا البروتوكول طريقه لفحص الاتصالات متشابك بين الخلايا العصبية التي يتم التضمين نشاطها نتيجة للتعلم حاسة الشم.

ويمكن النظر إلى مثال علي الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول أعلاه في الشكل 2. د يتم التعبير عن GCaMP3 في الخلايا العصبية إخراج ميغابايت الذي تشعبات inعصبيه المقصورة 1 من ميغابايت γ (يسمي الخلايا العصبية MVP228,29) و?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

هذه التقنية يسهل الملاحظة في الوقت الحقيقي من نشاط الكالسيوم متشابك كمعلمة فسيولوجية للعمليات الخلوية الكامنة تحت التعلم وتكوين الذاكرة في drosophila الميلانوغاستر. من خلال مقارنة استجابات الخلايا العصبية للروائح قبل وبعد التدريب النقابي ، يمكننا رسم روابط مباشرة بين النشاط المتشابك وتشكيل تتبع الذاكرة في ذباب الفاكهة الفردي. لإنتاج ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا التي الخلايا العصبية المحددة من الفائدة التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا عبر الإناث عذراء والذكور الذباب تحمل GAL4 المطلوب و UAS يبني، وعمر ذرية الإناث حتى ثلاثة إلى ستة أيام بعد eclosion.لإعداد ذبابة للتصوير ، استخدم ملقطًا جيدًا لوضع ذبابة مُجَبَّنة في غرفة تصوير مخصصة. باستخدام مجهر تشريح لوضع الصدر والساقين في اتصال مع الأسلاك الكهربائية في الجزء السفلي من الغرفة، ومع الرأس ملقاة شقة. إصلاح ذبابة في مكان مع شريط لاصق واضح، واستخدام شفرة مشرط الجراحية لقطع نافذة في الشريط حول الرأس، وترك الهوائي مغطاة وفقط الجزء الأمامي معظم الصدر المكشوفة.استخدام دبوس حشرة التي عقدت من قبل الفكين مقعر محدب لإحاطة بعناية الجانبين والظهر من الرأس مع الضوء الأزرق علاج الغراء. واستخدام الضوء الأزرق الباعثة مصباح LED لضبط الغراء. عندما يتم ضبط الغراء تمامًا ، قم بمسح أي غراء غير مُتَرَق من السطح الظهري لرأس الذبابة وغطّي بشرة الرأس المكشوفة مع قطرة من محلول Ringer.باستخدام سكين طعنة مشفرة جدا، وقطع من خلال بشرة عبر الجزء الخلفي من الرأس، بدءا من ocelli وقطع كل ميديل الجانب إلى العينين لتشكيل رفرف من بشرة التي يمكن أن تمزق بسهولة باستخدام ملقط. إزالة أي بشرة الزائدة التي قد تمنع منطقة الدماغ من الفائدة واستخدام ملقط غرامة لمسح بعناية سطح الظهر من أي القصبة الهوائية، مع الحرص على تجنب اضطراب أنسجة الدماغ نفسها. إزالة وتحديث الحل Ringer 'ق حسب الضرورة لمسح المنطقة من الحطام الأنسجة.ووضع حقنة تحت الجلد تسليم إبرة ما يقرب من سنتيمتر واحد من رأس الذبابة، مع الحرص لا يوجد شيء يمكن أن تعوق تسليم رائحة إلى الهوائي. ثم قم بتوصيل غرفة التصوير بنظام توصيل الرائحة عبر إبرة توصيل الرائحة تحت الجلد. وتسمح للذبابة 10 دقائق للتعافي من التخدير والجراحة.للتصور من مؤشرات الكالسيوم GFP القائمة، ضبط ليزر من مجهر متعدد الفوتون مجهزة ليزر الأشعة تحت الحمراء وهدف الغمر المياه المثبتة على جدول اهتزاز معزولة إلى الطول الموجي إثارة من 920 نانومتر وتثبيت مرشح شريط النطاق GFP. باستخدام مسار Z مقبض التكيف، والمسح الضوئي من خلال Z-محور الدماغ لتحديد موقع منطقة الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة المحاصيل لتركيز المسح على المنطقة ذات الاهتمام فقط ، لتقليل وقت المسح الضوئي.وتدوير عرض المسح الضوئي بحيث تواجه الأمامي من الرأس إلى أسفل. ثم اضبط حجم الإطار إلى 512 بكسل في 512 وحدد المنطقة المراد مسحها ضوئيًا. مع الأخذ في الاعتبار الوقت المسح المحسوب لكل إطار، لتحقيق معدل الإطار من أربعة هرتز على الأقل.للتصور العابر للكالسيوم الذي يثير الرائحة ، ابدأ حزمة ماكرو مبرمجة مسبقًا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصور وبرنامج تسليم الرائحة وتبدأ القياس في برنامج المجهر لمدة 6.25 ثانية لإنشاء قيمة خط أساس F0. في نظام تسليم الرائحة، وتقديم 2.5 ثانية من التحفيز رائحة المشار إليها هنا من خلال إضاءة LED التي أثارها فتح وإغلاق صمامات كأس رائحة محددة. تليها 12.5 ثانية من تسجيل في نهاية إزاحة رائحة.ثم كرر التسليم لرائحة ثانية وثالثة بنفس الطريقة. لتنفيذ تكييف النقابي في هذا الإعداد، استخدم نظام تسليم رائحة الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتقديم التحفيز مشروطة زائد رائحة لمدة 60 ثانية جنبا إلى جنب مع 12 90 فولت الصدمات الكهربائية. بعد 60 ثانية كسر الحالي التحفيز مشروطة ناقص رائحة وحدها لمدة 60 ثانية دون صدمة كهربائية.قياس رائحة ما بعد التدريب أثار الترانليس الكالسيوم مرة أخرى عن طريق تكرار بروتوكول التحفيز قبل التدريب رائحة ثلاث دقائق بعد الانتهاء من مرحلة التدريب. ثم احفظ ملفات التصوير في تنسيق مناسب لتحليل الصورة لاحقًا. هنا فطر تمثيلية الجسم إخراج صور الخلايا العصبية, المكتسبة كما هو موضح يمكن ملاحظتها.التعبير المجزأ المحدد لاستشعار dHomer-GCaMP3، الذي لا يعبر عنه في مقصورات محور عصبي من الخلايا العصبية، يدل على إشارة متخللة في المقصورة التشعب. يمكن ملاحظة ردود واضحة على الرغم من انخفاض رائحة السعة في الذباب التعبير عن dHomer-GCaMp3، مقارنة بالذباب الذي يعبر عن cytosolic GCaMP6f. هنا، آثار الكالسيوم التمثيلية من ذبابة فردية واحدة يوضح التباينات في مستوى الضوضاء والسعة التي يمكن الحصول عليها بين الاستعدادات الفردية.وقد فتحت هذه التقنية إمكانية تصور على المستوى الفرعي الخلوي، وكيف يتم تعديل التمثيلات الشمية وكيف يتم تشكيل مراحل الذاكرة من خلال تكييف. وستكون مثل هذه التجارب حيوية لتوسيع فهمنا لهياكل الدماغ المعقدة مثل جسم الفطر، وتوصيف كيفية تخزين الذكريات النقابية عبر مجموعات الخلايا العصبية الموزعة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

في التصور المجراة من الحويصلات متشابك ضمن محاور عصبية ذبابة الفاكهة القطاعي اليرقات

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

تحليل متشابك التحوير من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

نموذج الماوس إشعال الناجمة عن بينتيلينيتيترازولي

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

3D النمذجة من العمود الفقري Dendritic مع اللدونة متشابك

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...