Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det tyske Forskningsråd gennem det kollaborative forsknings Center SFB 889 "mekanismer for sensorisk behandling" og Forskningsenheden FOR 2705 "dissektion af et hjerne kredsløb: struktur, plasticitet og adfærdsmæssige funktion af Drosophila champignon krop ".

1. transgene frugt fluer, Drosophila melanogaster
<ol><li>Cross kvindelig jomfru og mandlig fluer (hævet ved 25 ° c i 60% relativ fugtighed på en 12 h lys/mørk cyklus) transporterer den ønskede Gal4 og UAS Konstruer25, henholdsvis at producere fluer, hvor specifikke neuroner af interesse udtrykke en genetisk kodet calcium indikator.</li>
	<li>Alder den kvindelige afkom af ovenstående Kors, indtil de er i intervallet 3-6 dage post-eclosion. Kvindelige fluer er at foretrække på gr...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

Dissektion af neurale kredsløb underliggende læring og hukommelse er et fremtrædende mål inden for neurovidenskab. Den genetiske tilgængelighed af Drosophila og bredden og lethed af adfærdsmæssige test gør dette til et ideelt værktøj til at undersøge sådanne fænomener. Her præsenteres en metode, som det er muligt at visualisere, inden for individuelle fluer, den graduering, der opstår på et subcellulært niveau som følge af olfaktoriske conditioning. Ved at udføre både præ-uddannelse og efter...

Dechifrere hvor og hvordan oplysningerne er erhvervet i hjernen gennem læring og efterfølgende lagret som hukommelse udgør en af de mest udfordrende opgaver i neurovidenskab1. Neurovidenskabelig forskning har ført til begrebet en ændring i synaptisk transmission som neuronal substrat, der ligger til grund for indlæring og hukommelse dannelse2,3. Det er en hypotese, at under læring, synaptiske forbindelser mellem neuronal ensembler, der er aktive under opfattelsen af en stimulus bliver modificeret sådan, at deres kombinerede aktivitetsmønster kan hentes under hukommelsen tilbagekaldelse, og dermed instruerede fremtidig adfærdsmæssig handling4. Disse "engram celler" og deres synapser er ofte fordelt på tværs af hjernen regioner og niveauer af behandling, hvilket gør det vanskeligt at tildele observerede ændringer i synaptisk transmission til indlæring af en opgave eller en stimulus. At lokalisere og visualisere de synaptiske ændringer, der er kausalt knyttet til en bestemt lærings opgave man har brug for en passende model system, der giver mulighed for præcist at begrænse disse synapser.
For en sådan bestræbelse, Drosophila melanogaster er særligt velegnet, fordi det kombinerer relativ hjernens enkelhed, adfærdsmæssige rigdom, og eksperimentel tilgængelighed. Blandt de veletablerede model organismer, Drosophila er beliggende mellem fyrretræsnematoden C. elegans og genetisk Tractable pattedyr som mus i form af neuronal kompleksitet. Det stereotypiske antal af neuroner (~ 300) og begrænset adfærdsmæssige repertoire er observeret i C. elegans. Pattedyr, på den anden side, har millioner af neuroner og svimlende adfærdsmæssige kompleksitet. Hjernen af frugtflue er, med sin ~ 100.000, neuroner betydeligt mindre end hjernen hos de fleste hvirveldyr, og mange af neuronerne er individuelt identificerbare5. Endnu, Drosophila demonstrere et bredt spektrum af komplekse adfærd, herunder en evne til at udvise robust associative olfaktoriske læring og hukommelse dannelse, først beskrevet over 40 år siden6. I løbet af denne klassiske konditionerings procedure, er grupper af fluer udsat for en lugt som den konditionerede stimulus (CS+), mens de modtager en straffe elektrisk chok som den ukonditionerede STIMULUS (US). En anden lugt (CS-) er derefter præsenteret uden nogen straf. Derved lærer dyrene at undgå lugt i forbindelse med straffen, som kan testes i en efterfølgende valgsituation mellem de to lugte, CS+ og cs-. Arbejde på dissekere neuronal substrat underliggende denne adfærd i Drosophila har identificeret champignon organer (MB) som det primære sted for "engram"7,8,9,10 og derfor er kredsløbet af denne hjerneregion var og er genstand for intens forskning for at afdække den logik, hvormed en hukommelse engram er erhvervet og opbevaret (for nylig revideret i11,12).
Drosophila MB består af ~ 2.000 iboende neuroner (Kenyon celler) pr. halvkugle, organiseret i parallelle axonal projektioner13. Axoner af olfaktoriske projektion neuroner udvides til den laterale protocerebra og til MB calyces, den vigtigste dendritiske input site af MB og modtage olfaktoriske input fra antennal lobes. Den lange, parallelle axoner bundt af Kenyon celler udgør pedonkel og lobes. De fleste Kenyon celler bifurcate danner horisontale β/β'-lapper ved at udvide en sikkerhedsstillelse mod midterlinjen af hjernen, og den lodrette α/α'-lapper ved at forlænge anden sikkerhedsstillelse projicering i rygnings-forreste retning. Den anden gruppe af Kenyon celler danner den horisontale γ-lobes13 af MB, hvor læringsprocessen og efterfølgende korttidshukommelse dannelse kunne være lokaliseret10. MB lapper modtage afferent input og give efferent output, som begge er typisk begrænset til særskilte opdelte sub-regioner langs Kenyon Cell axoner14,15,16. Især, afferent dopaminerge MB input neuroner har vist sig at mægle værdi-baserede, f. eks, straffende, forstærkende effekter i associative olfaktoriske Learning15,17. Stereotypiske og individuelt identificerbare efferent MB output neuroner fra champignon kroppen lapper integrere oplysninger på tværs af et stort antal Kenyon celler, målrette forskellige hjerneområder og bære adfærd-lærerige appetitive eller aversive oplysninger15 . Denne neuronal arkitektur har ført til et koncept for organiseringen af associative engram. Lugte er relativt præcist kodet af tyndt aktiverede ensembler af Kenyon celler. Den coinci Dent aktivitet af disse Kenyon Cell ensembler og frigivelse af dopamin-fremkaldt ved at straffe stimuli-modulerer transmission fra Kenyon Cell presynapses på MB output neuroner sådan, at dyrene efterfølgende vil undgå denne særlige lugt10 ,12. Vi bruger denne ret præcist definerede og lokaliseret engram som et paradigmatisk tilfælde til at illustrere, hvordan disse indlærings afhængige ændringer i synaptisk aktivitet kan bestemmes og overvåges.
Værdien af Drosophila som model system er stærkt afhængig af den uovertrufne genetiske værktøjskasse, der gør det muligt at udtrykke transgener til identificering, overvågning og styring af enkelt neuroner i komplekse kredsløb18. Fremkomsten af teknikker til neuronal aktivitet overvågning-såsom calcium Imaging, diskuteret her-har tilladt til bestemmelse af neuronal aktivitet mønstre som reaktion på en specifik stimulus. Ved at kombinere specifikke Gal4-drevet udtryk af genetisk kodede calcium indikatorer (gecis) med olfaktoriske stimulation, kan man visualisere lugt-fremkaldte calcium dynamik af neuroner af interesse19. I denne protokol, er det vist, at ved yderligere at koble denne teknik med en klassisk konditionering paradigme, er det muligt at undersøge disse olfaktoriske svar i forbindelse med læring. Lærings induceret plasticitet kan yderligere dissekteres ved hjælp af GECIs, der ikke kun er lokaliseret til en enkelt specifik Neuron, men også til specifikke underafdelinger af en neuron. Pech et al.20 etableret et udvalg af værktøjer, der tillader netop dette. Ved at målrette GCaMP321 til enten præ-eller postsynapse-via-forbindelsen til hvirveldyr Synaptophysin eller dHomer, henholdsvis20-differentialmodulering af disse steder kan skelnes. Denne lokalisering giver i denne sammenhæng en fordel i forhold til de fleste GECIs, der allestedsnærværende er til stede i hele cytosol-fx GCaMP22, GCaMP321, eller GCaMP623 -fordi det betyder, at præ-og postsynaptiske transienter kan være adskiller sig fra den samlede integrerede calcium tilstrømning, der opstår som følge af neuron aktivering. Dette kan give fingerpeg om placeringen og typer af plasticitet, der opstår som følge af eller at forårsage indlæring og hukommelse dannelse. Som et eksempel, den protokol, der er angivet her viser værdien af dette værktøj i decifrere graduering af MB output neuroner under olfaktoriske associative Learning ved at målrette ekspression af calcium sensor til kun postsynapse. Ved at overvåge, inden for en individuel flyve, lugt-fremkaldt aktivitet før og efter olfaktoriske conditioning en direkte sammenligning kan trækkes mellem en naiv lugt respons og en lært lugt respons. Mens fast i samme billed kammer, fluer er udsat for et udvalg af lugte. Derefter, de modtager en aversive associative conditioning protokol, hvor en af disse lugte er parret med elektrisk stød (at blive CS+) og en anden lugt er præsenteret uden forstærkning (bliver cs-). Endelig er fluerne igen udsat for de samme lugte som i det første trin. Calcium dynamik observeres ved hjælp af to-foton mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

Årtier af forskning i mange model organismer har ført til den nuværende opfattelse af synaptisk plasticitet underliggende læring og hukommelse dannelse. Lærings-induceret ændringer i synaptisk transmission er ofte fordelt på tværs af mange neuroner og niveauer af behandling i hjernen. Derfor er der behov for metoder til at visualisere indlærings afhængig synaptisk plasticitet på tværs af neuroner. Frugtflue Drosophila melanogaster repræsenterer en særlig gunstig model organisme til at studere neuronal kredsløb underliggende læring. Den protokol, der præsenteres her, viser en måde, hvorpå de processer, der ligger til grund for dannelsen af associative olfaktoriske Memories, nemlig synaptisk aktivitet og deres ændringer, kan overvåges in vivo. Ved hjælp af den brede vifte af genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, er det muligt specifikt at udtrykke genetisk kodet calcium indikatorer i bestemte cellepopulationer og endda enkeltceller. Ved at fastsætte en flue på plads, og åbne hovedet kapsel, er det muligt at visualisere calcium dynamik i disse celler samtidig levere olfaktoriske stimuli. Derudover demonstrerer vi en opsætning, hvor flue kan udsættes for elektrisk stød på kroppen samtidig. Dette giver et system, hvor fluer kan gennemgå klassisk olfaktoriske conditioning-hvorved en tidligere naiv lugt er lært at være forbundet med elektrisk chok straf-på samme tid som repræsentationen af denne lugt (og andre utrænede lugte) er observeret i hjernen via to-foton mikroskopi. Vores laboratorium har tidligere rapporteret om generering af synaptisk lokaliserede calcium sensorer, som gør det muligt at begrænse de fluorescerende calcium signaler til præ-eller postsynaptiske rum. To-foton mikroskopi giver en måde at spatialt løse fine strukturer. Vi eksemplificere dette ved at fokusere på neuroner integrerer information fra champignon kroppen, en højere orden Center af insektet hjernen. Samlet, denne protokol giver en metode til at undersøge de synaptiske forbindelser mellem neuroner, hvis aktivitet er moduleret som følge af olfaktoriske Learning.

Et eksempel på billeder erhvervet med ovenstående protokol kan ses i figur 2. d Homer-GCaMP3 udtrykkes i en MB output Neuron, hvis dendritter inderverer rummet 1 af MB γ-lap (neuron kaldes MVP228,29) og er genetisk målrettet ved hjælp af Split-Gal4 linje MB112C16. Også, demonstreret er forskellen i den subcellulære lokalisering af en cytosolisk og post-synaptisk...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Her præsenterer vi en protokol med hvilken præ-og/eller postsynaptisk calcium kan visualiseres i forbindelse med Drosophila læring og hukommelse. In vivo calcium Imaging ved hjælp af synaptisk lokaliseret calcium sensorer kombineres med en klassisk olfaktoriske conditioning paradigme, således at den synaptiske plasticitet underliggende denne type associative læring kan bestemmes.

In vivo optisk calcium billeddannelse af indlærings induceret synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Denne teknik letter observation i realtid af synaptisk calcium aktivitet som en fysiologisk parameter for de cellulære processer underliggende læring og hukommelse dannelse i drosophila melanogaster. Ved at sammenligne neuronale reaktioner på lugte før og efter associativ træning, kan vi drage direkte sammenhænge mellem synaptisk aktivitet og dannelsen af hukommelse spor i de enkelte bananfluer. At producere transgene bananfluer, hvor specifikke neuroner af interesse udtrykke en genetisk kodet calcium indikator tværs hun-jomfru og mandlige fluer bærer den ønskede GAL4 og UAS konstruktioner, og alder det kvindelige afkom indtil tre til seks dage efter eclosion.For at forberede en flue til billedbehandling, skal du bruge fine kraftbeslag til at placere en is bedøvet flyve ind i en brugerdefineret forberedt billeddannelse kammer. Ved hjælp af et dissekerende mikroskop til at placere brystkassen og benene i kontakt med de elektriske ledninger i bunden af kammeret, og med hovedet liggende fladt. Fastgør fluen på plads med klar tape, og brug en kirurgisk skalpel klinge til at skære et vindue i båndet omkring hovedet, forlader antennen dækket og kun den forreste meste af brystkassen udsat.Brug en insektstift, der holdes af konkave-konvekse kæber, til omhyggeligt at omgive siderne og bagsiden af hovedet med blåt lys hærdning lim. Og brug en blåt lys udsender LED lampe til at indstille limen. Når limen er helt indstillet, skal du fjerne eventuel resterende uhærdet lim fra flyvehovedets dorsale overflade og dække hovedets eksponerede neglebånd med en dråbe Ringers opløsning.Ved hjælp af en meget fintbladet stikkniv, skæres gennem neglebånd på tværs af den bageste del af hovedet, der starter ved ocelli og skære op hver side mediale til øjnene til at danne en flap af neglebånd, der let kan rives af ved hjælp af sniver. Fjern overskydende neglebånd, der kan blokere hjernen region af interesse og bruge fine scelinned til omhyggeligt at rydde dorsale overfladen af enhver luftrør, idet man skal passe på at undgå afbrydelse af hjernevævet selv. Fjern og genopfrisk Ringers opløsning efter behov for at rydde området for vævsaffald.Og placere en hypodermisk lugt levering nål cirka en centimeter fra hovedet af fluen, at passe der er noget, der kunne hindre lugt levering til antennen. Derefter tilsluttes billeddannelse kammer til lugt levering system via hypodermisk lugt levering nål. Og lad fluen 10 minutter til at komme sig efter anæstesi og kirurgi.For visualisering af GFP baserede calcium indikatorer, tune laseren af en multi-foton mikroskop udstyret med en infrarød laser og en vand nedsænkning mål installeret på en vibration isoleret tabel til en excitation bølgelængde på 920 nanometer og installere en GFP bandpass filter. Brug kurset Z justering knop, scanne gennem Z-aksen i hjernen for at finde hjernen region af interesse. Brug beskæringsfunktionen til kun at fokusere scanningen på det område, der er af interesse, for at minimere scanningstiden.Og drej scanningen se sådan, at den forreste af hovedet vender nedad. Juster derefter rammestørrelsen til 512 gange 512 pixel, og vælg det område, der skal scannes. Under hensyntagen til den beregnede scanningstid for hver ramme, for at opnå en billedhastighed på mindst fire hertz.For lugt-fremkaldt calcium forbigående visualisering, indlede en forprogrammeret makro pakke i stand til at forbinde billedet erhvervelse software og lugt levering program og begynde målingen i mikroskop software i 6,25 sekunder til at etablere en F0 baseline værdi. I lugt leveringssystem, levere en 2,5 sekunder lugt stimulus angivet her ved belysning af LED's udløst af åbning og lukning af specifikke lugt kop ventiler. Efterfulgt af 12,5 sekunders optagelse i slutningen af lugt offset.Gentag derefter leveringen for en anden og tredje odorant på samme måde. For at udføre associative conditioning i denne opsætning, skal du bruge den computerstyrede lugt leveringssystem til at præsentere den konditionerede stimulus-plus-lugt i 60 sekunder sammen med 12 90 volt elektriske stød. Efter en 60 sekunders pause præsentere betinget stimulus-minus-lugt alene i 60 sekunder uden elektrisk stød.Mål post træning lugt fremkaldt calcium forgænsning igen ved at gentage pre uddannelse lugt stimulation protokol tre minutter efter afslutningen af uddannelsen fase. Gem derefter billedfilerne i et passende format til senere billedanalyse. Her repræsentative champignon krop output neuron billeder, erhvervet som påvist kan observeres.Det specifikke opdelte udtryk for dHomer-GCaMP3-sensoren, som ikke udtrykkes i neuronens aksonale rum, viser et punktligt signal i det dendritiske rum. Klar selvom lavere amplitude lugt reaktioner kan observeres i fluer udtrykke dHomer-GCaMp3, sammenlignet med fluer udtrykke cyklisk GCaMP6f. Her viser repræsentative calciumspor fra en enkelt flue forskelle i støjniveauet og amplituden, der kan opnås mellem de enkelte præparater.Denne teknik har åbnet mulighed for at visualisere på sub-cellulære niveau, hvordan olfaktoriske repræsentationer er moduleret, og hvordan hukommelse faser dannes gennem konditionering. Sådanne eksperimenter vil være afgørende for at udvide vores forståelse af komplekse hjernestrukturer såsom svampekroppen og karakterisere, hvordan associative erindringer lagres på tværs af distribuerede populationer af neuroner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyse Synaptic Graduering af<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer efter Udsættelse for Langvarig Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Skive Patch klemme teknik til at analysere læring-induceret plasticitet

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-induceret Kindling musemodel

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

3D-modellering af dendritiske pigge med synaptisk plasticitet

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...