Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Duitse Onderzoeksraad via het collaboratief onderzoekscentrum SFB 889 "mechanismen van sensorische verwerking" en de onderzoekseenheid voor 2705 "dissectie van een hersen circuit: structuur, plasticiteit en Gedragsfunctie van de Drosophila paddestoel lichaam ".

1. transgene vruchten vliegen, Drosophila melanogaster
<ol><li>Kruis vrouwelijke Maagd en mannelijke vliegen (verhoogd bij 25 °C in 60% relatieve vochtigheid op een 12 h licht/donkere cyclus) dragen van de gewenste Gal4 en UAS constructies25, respectievelijk, om vliegen te produceren waarin specifieke neuronen van belang Express een genetisch gecodeerde calcium indicator.</li>
	<li>Leeftijd de vrouwelijke nakomelingen van het bovenstaande Kruis totdat ze in het bereik van 3-6 dagen na ...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

De dissectie van de neurale circuits onderliggende leren en geheugen is een prominente doel op het gebied van de neurowetenschappen. De genetische bereikbaarheid van Drosophila en de breedte en het gemak van gedragstesten maken dit een ideaal instrument om dergelijke verschijnselen te onderzoeken. Hier wordt een methode gepresenteerd waarmee het mogelijk is om binnen individuele vliegen de modulatie te visualiseren die optreedt op een subcellulair niveau als gevolg van olfactorische conditionering. Door het uitv...

Ontcijferen waar en hoe de informatie wordt verworven in de hersenen door te leren en vervolgens opgeslagen als geheugen vormt een van de meest uitdagende taken in neurowetenschappen1. Neurowetenschappelijk onderzoek heeft geleid tot het concept van een verandering in de synaptische transmissie als de neuronale substraat dat ten grondslag ligt aan leren en Geheugenvorming2,3. Het is veronderstelde dat, tijdens het leren, synaptische verbindingen tussen neuronale ensembles die actief zijn tijdens de perceptie van een stimulus zodanig worden gewijzigd dat hun gecombineerde activiteit patroon kan worden opgehaald tijdens geheugen terugroepen, waardoor het instrueren toekomstige gedrags actie4. Deze "engram cellen" en hun synapsen zijn vaak verdeeld over hersengebieden en niveaus van verwerking, waardoor het moeilijk is om waargenomen veranderingen in synaptische transmissie toe te wijzen aan het leren van een taak of een stimulus. Om te lokaliseren en visualiseren van die synaptische veranderingen die causaal gekoppeld aan een specifieke leer taak men moet een juiste modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het nauwkeurig beperken van die synapsen.
Voor een dergelijke inspanning is Drosophila melanogaster bijzonder geschikt omdat het relatieve hersen eenvoud, gedrags rijkdom en experimentele toegankelijkheid combineert. Onder de gevestigde model organismen, Drosophila is gelegen tussen de nematode C. elegans en genetisch Tractable zoogdieren zoals muizen in termen van neuronale complexiteit. Het type aantal neuronen (~ 300) en het beperkte gedrags repertoire wordt waargenomen bij C. elegans. Zoogdieren, aan de andere kant, hebben miljoenen neuronen en duizelingwekkende gedrags complexiteit. De hersenen van de fruitvlieg is, met zijn ~ 100.000, neuronen aanzienlijk kleiner dan de hersenen van de meeste gewervelde dieren, en veel van de neuronen zijn individueel identificeerbaar5. Toch toont Drosophila een breed spectrum van complexe gedragingen, waaronder een vermogen om robuuste associatieve olfactorische leer-en Geheugenvorming te vertonen, die voor het eerst werd beschreven 40 jaar geleden6. In de loop van deze klassieke conditionerings procedure worden groepen vliegen onderworpen aan een geur als de geconditioneerde stimulus (CS+) terwijl ze een punierende elektrische schok krijgen als de ongeconditioneerde STIMULUS (VS). Een tweede geur (CS-) wordt dan gepresenteerd zonder straf. Daardoor leren de dieren om de geur geassocieerd met de straf te vermijden, die kan worden getest in een latere keuze situatie tussen de twee geuren, CS+ en CS-. Werk aan het ontleden van de neuronale substraat onderliggende dit gedrag in Drosophila heeft de paddestoel lichamen geïdentificeerd (MB) als de primaire site van de "engram"7,8,9,10 en daarom, de circuits van dit hersengebied was en is het onderwerp van intens onderzoek om de logica te achterhalen waarmee een geheugen-engram wordt verworven en opgeslagen (onlangs beoordeeld in11,12).
De Drosophila MB bestaat uit ~ 2.000 intrinsieke neuronen (Kenyon cellen) per halfrond, georganiseerd in parallelle axonale projecties13. Axonen van olfactorische projectie neuronen worden uitgebreid naar de laterale protocerebra en naar de MB calyces, de belangrijkste dendritische ingangs plaats van de MB en ontvangen olfactorische input van antennal lobben. De lange, parallelle axonen-bundel van Kenyon-cellen vormen de bloem en de lobben. De meeste Kenyon-cellen vormen horizontale β/β'-lobben door een onderpand uit te breiden naar de middenlijn van de hersenen, en de verticale α/α'-lobben door het uitbreiden van tweede onderpand dat projecteren in de dorsale-anterieure richting. De andere groep van Kenyon cellen vormt de horizontale γ-lobben13 van de MB waar het leerproces en de daaropvolgende korte-termijn Geheugenvorming zou kunnen worden gelokaliseerd10. De MB-lobben krijgen een afferente input en zorgen voor een efferente output, die beide meestal beperkt zijn tot verschillende compartimentele subregio's langs de Kenyon Cell axonen14,15,16. In het bijzonder is aangetoond dat de afferente Dopaminerge MB-input neuronen bemiddel op waarde gebaseerde, bijvoorbeeld, punitieve, versterkende effecten in associatieve reuk Learning15,17. Stereotypic en individueel identificeerbare efferente MB-output neuronen uit de paddestoel Body lobben integreren informatie over grote aantallen Kenyon cellen, richten diverse hersengebieden en dragen gedrag-leerzame eetlust of aversieve informatie15 . Deze neuronale architectuur heeft geleid tot een concept van de organisatie van het associatieve engram. Geuren zijn relatief nauwkeurig gecodeerd door dun geactiveerde ensembles van Kenyon-cellen. De samenvallen activiteit van deze Kenyon celensembles en het vrijkomen van dopamine-opgeroepen door het straffen van stimuli-moduleert transmissie van Kenyon Cell presynapses op MB uitgangs neuronen zodanig dat de dieren vervolgens deze bijzondere geur zal vermijden10 ,12. We gebruiken dit nogal nauwkeurig gedefinieerde en gelokaliseerde engram als een paradigmatische zaak om te illustreren hoe deze leer afhankelijke veranderingen in synaptische activiteit kunnen worden bepaald en gemonitord.
De waarde van Drosophila als modelsysteem is sterk afhankelijk van de ongeëvenaarde genetische Toolbox die het mogelijk maakt om transgenen te uiten voor het identificeren, bewaken en beheersen van enkele neuronen binnen complexe circuits18. De opkomst van technieken voor Neuronale activiteit monitoring-zoals calcium Imaging, hier besproken-hebben toegestaan voor de bepaling van de neuronale activiteit patronen in reactie op een specifieke stimulans. Door het combineren van specifieke Gal4-driven expressie van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) met olfactorische stimulatie, kan men visualiseren de geur-opgeroepen calcium dynamiek van neuronen van belang19. In dit protocol wordt aangetoond dat door deze techniek verder te koppelen aan een klassiek conditionerings paradigma, het mogelijk is om deze olfactorische responsen in de context van leren te onderzoeken. Leer-geïnduceerde plasticiteit kan verder worden ontleed met behulp van GECIs die niet alleen gelokaliseerd zijn op één specifiek neuron, maar ook op specifieke subcompartimenten van een neuron. Pech et al.20 heeft een selectie van tools opgezet die dit precies mogelijk maken. Door zich te richten op GCaMP321 op de pre-of postsynapse-via-koppeling naar het gewervelde Syntophysin of dHomer, respectievelijk20-de differentiële modulatie van deze sites kan worden onderscheiden. Deze lokalisatie verleent in dit verband een voordeel ten opzichte van de meeste GECIs die alomtegenwoordig aanwezig zijn in de cytosol-bijvoorbeeld GCaMP22, GCaMP321of GCaMP623 -omdat dit betekent dat pre-en postsynaptische transiënten kunnen worden onderscheiden van de totale geïntegreerde calcium instroom die optreedt als gevolg van neuron activatie. Dit kan aanwijzingen geven over de locatie en de soorten plasticiteit die optreden als gevolg van of die leiden tot leren en Geheugenvorming. Als voorbeeld toont het protocol dat hier wordt geleverd de waarde van dit hulpmiddel bij het ontcijferen van de modulatie van MB-uitgangs neuronen tijdens olfactorische associatief leren door de expressie van de calcium sensor te richten op alleen de postsynapse. Door te monitoren, binnen een individuele vlieg, geur-Evoked activiteit voor en na olfactorische conditionering een directe vergelijking kan worden getrokken tussen een naïeve geur respons en een geleerde geur respons. Terwijl ze in dezelfde Imaging kamer zijn bevestigd, worden vliegen blootgesteld aan een selectie van geuren. Vervolgens krijgen ze een aversief associatief conditionerings protocol waarin een van deze geuren is gekoppeld aan elektrische schokken (de CS+) en een andere geur wordt gepresenteerd zonder versterking (de CS-). Ten slotte worden de vliegen weer blootgesteld aan dezelfde geuren als in de eerste stap. Calcium dynamica wordt waargenomen met behulp van twee-photon microscopie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

Decennia van onderzoek in veel model organismen hebben geleid tot het huidige concept van synaptische plasticiteit onderliggende leren en Geheugenvorming. Learning-geïnduceerde veranderingen in de synaptische transmissie zijn vaak verdeeld over vele neuronen en niveaus van verwerking in de hersenen. Daarom, methoden voor het visualiseren van leer afhankelijke synaptische plasticiteit over neuronen nodig zijn. De fruitvlieg Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een bijzonder gunstig modelorganisme om neuronale circuits onderliggende leren te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerd toont een manier waarop de processen die aan de vorming van associatieve reuk geheugens, dat wil zeggen, synaptische activiteit en hun veranderingen, kunnen worden gemonitord in vivo. Met behulp van de brede waaier van genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila, is het mogelijk om genetisch gecodeerde calcium indicatoren expliciet uit te drukken in bepaalde celpopulaties en zelfs enkelvoudige cellen. Door het bevestigen van een vlieg op zijn plaats, en het openen van de hoofd capsule, is het mogelijk om de calcium dynamica in deze cellen te visualiseren terwijl olfactorische stimuli worden gegeven. Daarnaast demonstreren we een set-up waarin de vlieg gelijktijdig kan worden blootgesteld aan elektrische schokken aan het lichaam. Dit biedt een systeem waarin vliegen klassieke olfactorische conditionering kan ondergaan-waarbij een eerder naïeve geur wordt geleerd te worden geassocieerd met elektrische schok straf-op hetzelfde moment als de representatie van deze geur (en andere ongetrainde geuren) is waargenomen in de hersenen via twee-photon microscopie. Ons laboratorium heeft eerder de generatie van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren gerapporteerd, waardoor men de fluorescerende calcium signalen kan beperken tot pre-of postsynaptische compartimenten. Two-photon microscopie biedt een manier om ruimtelijke structuren op te lossen. We illustreren dit door te focussen op neuronen die informatie van het paddestoel lichaam integreren, een hoger-orde centrum van het insecten brein. Over het algemeen, dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van de synaptische verbindingen tussen neuronen waarvan de activiteit wordt gemoduleerd als gevolg van reuk leren.

Een voorbeeld van afbeeldingen die met het bovenstaande protocol zijn verkregen, is te zien in Figuur 2. d Homer-GCaMP3 wordt uitgedrukt in een MB-output neuron waarvan dendrites innervate het compartiment 1 van de MB γ-kwbe (het neuron wordt genoemd MVP228,29) en is genetisch gericht met behulp van de split-Gal4 lijn MB112C16. Ook, gedemonstreerd is het verschil in d...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Deze techniek vergemakkelijkt de observatie in real time van synaptische calciumactiviteit als fysiologische parameter voor de cellulaire processen die ten grondslag liggen aan leren en geheugenvorming in drosophila melanogaster. Door neuronale reacties op geuren voor en na associatieve training te vergelijken, kunnen we directe correlaties trekken tussen synaptische activiteit en de vorming van het geheugenspoor bij individuele fruitvliegjes. Voor de productie van transgene fruitvliegjes waarin specifieke neuronen van belang uitdrukken een genetisch gecodeerde calcium indicator kruis vrouw-maagd en mannelijke vliegen die de gewenste GAL4 en UAS constructies, en leeftijd van de vrouwelijke nakomelingen tot drie tot zes dagen na de sluiting.Om een vlieg voor te bereiden op beeldvorming, gebruik maken van fijne tangen om een ijs verdoofd vliegen plaats in een aangepaste voorbereide beeldvorming kamer. Met behulp van een ontledenmicroscoop om de thorax en benen in contact te brengen met de elektrische draden aan de onderkant van de kamer, en met het hoofd plat liggen. Bevestig de vlieg op zijn plaats met duidelijke plakband, en gebruik een chirurgische scalpel mes om een raam in de tape rond het hoofd te snijden, waardoor de antenne bedekt en alleen de voorste meeste deel van de thorax blootgesteld.Gebruik een insectenspeld die door concave-convexe kaken wordt vastgehouden om de zijkanten en achterkant van het hoofd zorgvuldig te omringen met blauw licht uithardingslijm. En gebruik een blauw licht uitzendende LED-lamp om de lijm in te stellen. Wanneer de lijm volledig is ingesteld, moet u alle resterende ongeharde lijm van het dorsale oppervlak van de vliegkop wissen en de blootgestelde cuticula van het hoofd bedekken met een druppel oplossing van Ringer.Met behulp van een zeer fijnbladig steekmes, dwars door de cuticula over het achterste van het hoofd, te beginnen bij de ocelli en het snijden van elke kant mediaal aan de ogen om een flap van de cuticula die gemakkelijk kan worden afgescheurd met behulp van tangen te vormen. Verwijder elke overtollige cuticula die het hersengebied van belang kan blokkeren en gebruik fijne tangen om het rugoppervlak van een luchtpijp zorgvuldig te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat verstoring van het hersenweefsel zelf wordt voorkomen. Verwijder en vernieuw de oplossing van de Ringer indien nodig om het gebied van weefselresten te verwijderen.En plaats een injectienaald van hypodermische geur op ongeveer een centimeter van het hoofd van de vlieg, waarbij u ervoor zorgt dat er niets is dat de geurtoevoer naar de antenne kan belemmeren. Sluit vervolgens de beeldkamer aan op het geurtoevoersysteem via de injectienaald van de hypodermische geur. En laat de vlieg 10 minuten om te herstellen van de anesthesie en chirurgie.Voor visualisatie van de GFP gebaseerde calcium indicatoren, tune de laser van een multi-foton microscoop uitgerust met een infrarood laser en een water onderdompeling doelstelling geïnstalleerd op een trilling geïsoleerde tafel om een excitatie golflengte van 920 nanometer en installeer een GFP bandpass filter. Met behulp van de cursus Z aanpassing knop, scannen door de Z-as van de hersenen om de hersenen gebied van belang te lokaliseren. Gebruik de bijsnijdfunctie om het scannen alleen op het interessegebied te richten, om de scantijd te minimaliseren.En draai de scan weergave zodanig dat de voorste van het hoofd naar beneden wordt gericht. Pas vervolgens de framegrootte aan op 512 bij 512 pixels en selecteer het gebied dat moet worden gescand. Rekening houdend met de berekende scantijd voor elk frame, om een framesnelheid van ten minste vier hertz te bereiken.Voor geur-opgeroepen calcium voorbijgaande visualisatie, initiëren van een voorgeprogrammeerde macro-pakket in staat van het koppelen van de beeldverwerving software en de geur levering programma en beginnen met de meting in de microscoop software voor 6,25 seconden om een F0 baseline waarde vast te stellen. In de geur levering systeem, leveren een 2,5 seconden geur stimulus hier aangegeven door verlichting van LED's geactiveerd door het openen en sluiten van specifieke geur beker kleppen. Gevolgd door 12,5 seconden van de opname aan het einde van geur offset.Herhaal vervolgens de levering voor een tweede en derde geurstof op dezelfde manier. Om associatieve conditionering uit te voeren in deze setup, gebruik maken van de computer gecontroleerde geur levering systeem om de geconditioneerde stimulus-plus-geur presenteren voor 60 seconden naast 12 90 volt elektrische schokken. Na een pauze van 60 seconden presenteren de geconditioneerde stimulus-minus-geur alleen voor 60 seconden zonder elektrische schok.Meet de post training geur opgeroepen calcium vergankelijkheid opnieuw door het herhalen van de pre training geur stimulatie protocol drie minuten na het beëindigen van de trainingsfase. Sla vervolgens de beeldvormende bestanden op in een geschikte indeling voor latere beeldanalyse. Hier representatieve paddestoel lichaam output neuron beelden, verworven zoals aangetoond kan worden waargenomen.De specifieke gecompartimenteerde expressie van de dHomer-GCaMP3 sensor, die niet wordt uitgedrukt in de axonnale compartimenten van het neuron, toont een onderbroken signaal in het dendritische compartiment. Duidelijk hoewel lagere amplitude geur reacties kunnen worden waargenomen bij vliegen uitdrukken dHomer-GCaMp3, in vergelijking met vliegen uitdrukken cytosolic GCaMP6f. Hier, representatieve calcium sporen van een individuele vlieg toont verschillen in het geluidsniveau en amplitude die kunnen worden verkregen tussen individuele preparaten.Deze techniek heeft de mogelijkheid geopend om te visualiseren op subcellulair niveau, hoe reukvoorstellingen worden gemoduleerd en hoe geheugenfasen worden gevormd door conditionering. Dergelijke experimenten zullen van vitaal belang zijn om ons begrip van complexe hersenstructuren zoals het paddenstoellichaam uit te breiden en om te karakteriseren hoe associatieve herinneringen worden opgeslagen over gedistribueerde populaties van neuronen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-geïnduceerde aanmaakhout muismodel

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

3D Modellering van Dendritische stekels met synaptische plasticiteit

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...