Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר גרמני באמצעות מרכז מחקר שיתופי SFB 889 "מנגנונים של עיבוד חושי" ואת יחידת המחקר עבור 2705 "חיתוך של מעגל המוח: מבנה, פלסטיות ותפקוד התנהגותי של ה דרוזופילה . גוף פטרייה

1. זבובי פירות טרנסגניים, דרוזופילה מלאנוסטר
<ol><li>צלב נקבה בתולה וזבובים גברים (הרים 25 ° צ' ב 60% לחות יחסית על מחזור 12 h אור/כהה) נשיאת Gal4 ובונה UAS הרצוי25, בהתאמה, כדי לייצר זבובים שבו נוירונים ספציפיים הריבית לבטא מקודד גנטית סידן אינדיקטור.</li>
	<li>גיל הצאצא הנשי של הצלב הנ ל ע?...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

הניתוח של המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה והזיכרון הוא מטרה בולטת בתחום מדעי המוח. הנגישות הגנטית של דרוזופילה והרוחב והקלות של בדיקות ההתנהגות הופכת את זה לכלי אידיאלי לחקור תופעות כאלה. כאן מוצגת שיטה שבה ניתן לדמיין, בתוך זבובים בודדים, האפנון המתרחשת ברמה תת-תאית כתוצאה ממיזוג הרי?...

פענוח היכן וכיצד המידע נרכש במוח באמצעות למידה ומאוחסן לאחר מכן כזיכרון מהווה את אחת המשימות המאתגרים ביותר במדעי המוח1. מחקרים נוירומדעיים הובילו למושג שינוי בשידור הסינפטית כמצע עצבי הנמצא ביסוד הלמידה והיווצרות הזיכרון2,3. זה שיערו כי, במהלך הלמידה, קשרים סינפטית בין ההרכבים עצבי כי הם פעילים במהלך התפיסה של גירוי להיות שונה כך דפוס הפעילות המשולבת שלהם ניתן לאחזר במהלך הזיכרון להיזכר, ובכך להדריך פעולה התנהגותית עתידית4. אלה "התאים engram" ואת הסינפסות שלהם מופצים לעתים קרובות על פני אזורי המוח רמות של עיבוד, מה שמקשה על הקצאת שינויים נצפו בשידורי סינפטית ללמידה של משימה או גירוי. כדי להתאים ולהמחיש את השינויים הסינפטית האלה כי הם מקושרים למשימה למידה ספציפית אחד צריך מערכת המודל המתאים המאפשר בדיוק מגבילה את הסינפסות.
עבור מאמץ כזה, דרוזופילה מלאנוסטר מתאים במיוחד משום שהוא משלב פשטות מוחית יחסית, עושר התנהגותי ונגישות ניסויית. בין האורגניזמים המבוססים היטב, דרוסופילה ממוקם בין ה-נמטודות C. אלגיה ויונקים מבחינה גנטית כמו עכברים במונחים של מורכבות עצבית. מספר סטריוטיפית של נוירונים (~ 300) ורפרטואר התנהגותי מוגבל נצפה בג. יונקים, לעומת זאת, יש מיליוני נוירונים. ומורכבות התנהגותית אדירה המוח של זבוב הפירות הוא, עם שלה ~ 100,000, הנוירונים קטנים באופן משמעותי מהמוח של רוב בעלי החוליות, ורבים הנוירונים הם לזיהוי באופן אינדיבידואלי5. ובכל זאת, דרוזופילה מפגין ספקטרום רחב של התנהגויות מורכבות, כולל יכולת להציג למידה איתנה של ריח והיווצרות זיכרון, המתואר לראשונה לפני 40 שנים לפני6. במהלך הליך התניה קלאסי, קבוצות של זבובים חשופים לריח כגירוי ממוזג (CS+) בעוד הם מקבלים הלם חשמלי מעניש כמו גירוי ממוזג (ארה ב). הריח השני (CS-) מוצג לאחר מכן ללא כל עונש. כך, בעלי החיים לומדים להימנע מהריח הקשור לעונש, שניתן לבחון במצב הבחירה הבא בין שתי הריחות, CS+ ו-cs-. העבודה על ניתוח המצע העצבי שבבסיס התנהגות זו בדרוזופילה זיהתה את גופי הפטריות (MB) כאתר הראשי של "engram"7,8,9,10 ולכן, המעגלים של אזור המוח הזה היה והוא הנושא של מחקר אינטנסיבי כדי לחשוף את ההיגיון שבו אנגרמה זיכרון נרכש ומאוחסן (שנבדקו לאחרונה בשנת11,12).
The drosophila ילה MB מורכב ~ 2,000 נוירונים פנימיים (תאים קניון) לכל חצי הכדור, מאורגן התחזיות סיבי מקבילי13. Axons של הקרנת הריח הנוירונים מורחבים החזייה לרוחב לאורך ו calyces MB, אתר הקלט הדנדריטי הראשי של MB ולקבל קלט החוש מן האונות האנטנה. צרור האקטונים הארוכים והמקבילים של תאי קניון מהווים את מדווש ואת האונות. רוב התאים קניון bifurcate להרכיב אופקי β/β'-האונות על ידי הארכת עירבון אחד כלפי קו האמצע של המוח, ו-α האנכי/α'-האונות על ידי הארכת העירבון השני מקרין בכיוון הקדמי הקדמית. הקבוצה השנייה של תאים קניון צורות γ אופקי-האונות13 של המגה בייט שבו תהליך הלמידה והיווצרות הזיכרון לטווח הקצר הבאים יכול להיות מקומי10. האונות MB לקבל קלט כלי לימפה ולספק פלט efferent, שניהם מוגבלים בדרך כלל compartmental sub-אזורים נפרדים לאורך אקסונים תא קניון14,15,16. בפרט, הקלט של הנוירונים במגה-בתים של כלי לימפה בנפח MB הוכחו לתווך ערך מבוסס, למשל, ענישה, חיזוק השפעות הריח למידה אסוציאטיבית15,17. Stereotypic ובאופן אינדיבידואלי efferent MB פלט הנוירונים מתוך האונות בגוף פטריות לשלב מידע על פני מספר גדול של תאים קניון, יעד אזורי המוח מגוונות התנהגות דוב-מידע מספק מאוד או מאוד מספק15 . הארכיטקטורה העצבית הזאת הובילה. למושג של ארגון האנגרמה האסוציאטיבית ריחות מקודדים במדויק על ידי הרכבים המופעל בדלילות של תאים קניון. האירוע מגזר המקרה של אלה הרכבים תא הקניון ושחרורו של דופמין-עורר על ידי הענשת גירויים-העברת מודולים מתא קניון מראש לתוך הנוירונים הפלט מגה בייט כגון בעלי החיים לאחר מכן למנוע את הריח הזה מסוים10 ,12. אנו משתמשים זו אנגרמה מוגדר למדי בדיוק מקומי כמו במקרה פרדיגמטי כדי להמחיש כיצד אלה תלויי למידה שינויים בפעילות סינפטית ניתן לקבוע ופיקוח.
הערך של דרוזוהילה כמערכת מודל מסתמך בחוזקה על ארגז הכלים הגנטי ללא תחרות המאפשר לאחד לבטא טרנסגנים לזיהוי, ניטור ושליטה על נוירונים בודדים בתוך מעגלים מורכבים18. הופעתו של טכניקות לניטור הפעילות העצבית-כגון הדמיה סידן, דנו כאן-הרשו לקביעת דפוסי הפעילות העצבית בתגובה לגירוי מסוים. על-ידי שילוב ביטוי מGal4 ספציפי של מחווני סידן מקודדים גנטית (סמארה) עם גירוי ריח, אפשר לדמיין את הדינמיקה המועוררה של הסידן של נוירונים בריבית19. בפרוטוקול זה מראים כי על ידי צימוד טכניקה זו עם פרדיגמה מיזוג קלאסית, ניתן לבחון את תגובות הריח הזה בהקשר של למידה. פלסטיות המושרה למידה ניתן לגזור עוד באמצעות הסמזה כי הם לא רק מקומי לעצב מסוים אחד, אלא גם לתאי משנה ספציפיים של תא העצב. Pech ואח '20 הקים מבחר כלים המאפשרים בדיוק את זה. על-ידי התמקדות GCaMP321 אל מקדם או פוסטסינפסה באמצעות הצמדה בעלי החוליות Synaptophysin או dהומר, בהתאמה20-האפנון הדיפרנציאלי של אתרים אלה ניתן להבחין. לוקליזציה זו מהווה, בהקשר זה, יתרון על רוב הגנוטים היא כי הם במצב אוביקווילי לאורך הציטוסול-למשל, GCaMP22, GCaMP321, או GCaMP623 -כי זה אומר הארעיות טרום ופוסט סינפטית יכול להיות נבדל מזרם הסידן המשולב הכולל המתרחש כתוצאה של הפעלת תא העצב. הדבר יכול לספק רמזים לגבי המיקום והסוגים של הפלסטיות המתרחשים כתוצאה או הגורם ללמידה וליצירת זיכרון. כדוגמה, הפרוטוקול המסופק כאן מציג את הערך של כלי זה בפענוח האפנון של הנוירונים פלט MB במהלך הלמידה אסוציאטיבית הריח על ידי מיקוד הביטוי של חיישן הסידן רק postסינפסה. על-ידי ניטור, בתוך לטוס בודד, מעורר ריח פעילות לפני ואחרי המיזוג ריח השוואה ישירה ניתן להסיק בין תגובת ריח נאיבי ותגובת ריח למדה. בעוד קבוע באותו חדר הדמיה, זבובים חשופים מבחר של ריחות. לאחר מכן, הם מקבלים פרוטוקול התניה אסוציאטיבית, שבו אחת מריחות אלה מזווג עם הלם חשמלי (להיות CS+) ועוד ריח מוצג ללא חיזוק (להיות cs-). לבסוף, הזבובים נחשפים שוב לריחות כמו בשלב הראשון. השתמשו בסידן מיקרוסקופית. שתי פוטון

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

עשרות שנים של מחקר אורגניזמים רבים במודל הובילו את המושג הנוכחי של הפלסטיות הסינפטית הבסיסית למידה והיווצרות זיכרון. שינויים המושרה למידה בשידורי סינפטית מופצים לעתים קרובות על פני הרבה נוירונים ורמות של עיבוד במוח. לכן, יש צורך להמחיש את הפלסטיות הסינפטית התלויות בלמידה ברחבי הנוירונים. זבוב הפירות מלאנוגסטר מייצג אורגניזם מודל נוח במיוחד לחקר המעגלים העצביים שבבסיס הלמידה. הפרוטוקול המוצג כאן מדגים דרך שבה התהליכים המשמשים את היווצרות זיכרונות הריח האסוציאטיבית, כלומר, פעילות סינפטית והשינויים שלהם, ניתן לפקח בvivo. באמצעות מגוון רחב של כלים גנטיים הזמינים ב Drosophila ילה, ניתן לבטא במפורש מחווני סידן מקודדים גנטית באוכלוסיות תאים ואפילו תאים בודדים. על ידי תיקון זבוב במקום, ופתיחת קפסולת הראש, ניתן להמחיש את דינמיקת הסידן בתאים אלה תוך מתן גירוי ריח. בנוסף, אנו מדגימים הערכה שבה הזבוב יכול להיות נתון, במקביל, לזעזועים חשמליים לגוף. זה מספק מערכת שבה זבובים יכולים לעבור מיזוג הריח הקלאסי-לפיו ריח נאיבי בעבר הוא למד להיות קשור לעונש הלם חשמלי-באותו זמן כמו ייצוג של ריח זה (וריחות לא מאומן אחרים) הוא שנצפתה במוח באמצעות שתי פוטון מיקרוסקופ. המעבדה שלנו דיווחה בעבר על הדור של חיישני סידן synaptically מקומי, אשר מאפשר לאחד להגביל את אותות הסידן פלורסנט לתאי טרום או פוסט סינפטית. מיקרוסקופ 2-פוטון מספק דרך. לפתור מבנים משובחים אנו מדגימה זאת על ידי התמקדות בנוירונים המשלבים מידע מהגוף הפטרייה, מרכז מסדר גבוה יותר של מוח החרק. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה לבחון את הקשרים סינפטית בין הנוירונים אשר הפעילות מאופנן כתוצאה של לימוד ריח.

באיור 2ניתן לראות דוגמה לתמונות שנרכשו באמצעות הפרוטוקול הנ ל. ד הומר-GCaMP3 מתבטא בעצב הפלט במגה בייט, אשר הדנדטים innervate תא 1 של האונה הγ-mb (תא העצב הוא כינה MVP228,29) והוא ממוקד גנטית באמצעות קו מפוצל-Gal4 MB112C16. כמו ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

טכניקה זו מקלה על התצפית בזמן אמת של פעילות סידן סינפטית כ פרמטר פיזיולוגי לתהליכים התאיים שבבסיס היווצרות הלמידה והזיכרון במלנוגסטר דרוסופילה. על ידי השוואת תגובות עצביות לריחות לפני ואחרי אימון אסוציאטיבי, אנו יכולים לצייר קשרים ישירים בין פעילות סינפטית לבין היווצרות עקבות הזיכרון בזבובי פירות בודדים. כדי לייצר זבובי פירות מהונדסים שבהם נוירונים ספציפיים של עניין מבטאים מחוון סידן מקודד גנטית חוצה זבובים נקביים-בתוליים וזכריים הנושאים את המבנים הרצויים של GAL4 ו- UAS, ומזדקנים את צאצאי הנקבה עד שלושה עד שישה ימים לאחר האקלוסיה.כדי להכין זבוב להדמיה, השתמש במטסים עדינים כדי למקם זבוב הרדמה קרח לתוך תא הדמיה מוכן בהתאמה אישית. שימוש במיקרוסקופ מנתח כדי למקם את בית החזה והרגליים במגע עם חוטי החשמל בתחתית התא, ועם הראש שוכב שטוח. לתקן את הזבוב במקום עם סרט דבק ברור, ולהשתמש בלהב אזמל כירורגי לחתוך חלון בקלטת סביב הראש, משאיר את האנטנה מכוסה ורק את החלק הקדמי ביותר של בית החזה חשוף.השתמש סיכת חרק מוחזק על ידי לסתות קעורות כדי להקיף בזהירות את הצדדים ואת החלק האחורי של הראש עם דבק ריפוי אור כחול. ולהשתמש באור כחול פולט מנורת LED כדי להגדיר את הדבק. כאשר הדבק מוגדר לחלוטין, לנקות כל דבק שאריות ללא פגע מפני השטח הגביים של ראש הזבוב ולכסות את קוטיקל חשוף של הראש עם טיפה של הפתרון של רינגר.באמצעות סכין דקירה עדין מאוד להב, לחתוך דרך cuticle על פני האחורי של הראש, החל ocelli וחיתוך כל צד מתווך לעיניים כדי ליצור דש של קוטיקל כי ניתן לקרוע בקלות באמצעות מדפים. הסר כל קוטיקל עודף שעלול לחסום את אזור המוח של עניין ולהשתמש מדחפים עדין כדי לנקות בזהירות את פני הגב של כל קנה הנשימה, דואג למנוע הפרעה של רקמת המוח עצמה. הסר ורענן את הפתרון של הצלצול לפי הצורך כדי לנקות את האזור של פסולת רקמות.ולמקם מחט מסירת ריח hypodermic כ סנטימטר אחד מראש הזבוב, דואג אין שום דבר שיכול לחסום את מסירת ריח לאנטנה. לאחר מכן חבר את תא ההדמיה למערכת מסירת הריח באמצעות מחט מסירת הריח ההיפודרמי. ולאפשר לטוס 10 דקות להתאושש מההרדמה והניתוח.להדמיה של מחווני הסידן מבוססי GFP, כווננו את הלייזר של מיקרוסקופ רב-פוטוני המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים המותקנת על שולחן מבודד רטט לאורך גל עירור של 920 ננומטר והתקינו מסנן פס GFP. באמצעות כפתור ההתאמה של Z כמובן, לסרוק דרך ציר Z של המוח כדי לאתר את אזור המוח של עניין. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה רק באזור העניין, כדי למזער את זמן הסריקה.ולסובב את תצוגת הסריקה כך הקדמי של הראש פונה כלפי מטה. לאחר מכן התאימו את גודל המסגרת ל- 512 על 512 פיקסלים ובחרו את האזור לסריקה. אם לוקחים בחשבון את זמן הסריקה המחושב עבור כל מסגרת, כדי להשיג קצב מסגרות של לפחות ארבעה הרץ.עבור הדמיה ארעית של סידן מעורר ריח, ליזום חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר את התוכנה לרכישת תמונה ואת תוכנית אספקת הריח ולהתחיל את המדידה בתוכנת המיקרוסקופ למשך 6.25 שניות כדי ליצור ערך בסיסי F0. במערכת אספקת הריח, לספק גירוי ריח 2.5 שניות המצוין כאן על ידי תאורה של LED מופעלות על ידי פתיחה וסגירה של שסתומי ריח ספציפיים. לאחר מכן 12.5 שניות של הקלטה בסוף היסט הריח.לאחר מכן חזור על המשלוח עבור ריח שני ושלישי באותו אופן. כדי לבצע מיזוג אסוציאטיבי בהתקנה זו, השתמש במערכת אספקת הריח הנשלטת על-ידי המחשב כדי להציג את הגירוי המותנה בתוספת ריח למשך 60 שניות לצד 12 90 וולט חשמליים. לאחר הפסקה של 60 שניות, מציגים את הגירוי המותנה במינוס ריח לבדו למשך 60 שניות ללא הלם חשמלי.למדוד את ריח לאחר אימון עורר ארעיות סידן שוב על ידי חזרה על פרוטוקול גירוי ריח טרום אימון שלוש דקות לאחר סיום שלב האימון. לאחר מכן שמרו את קבצי ההדמיה בתבנית המתאימה לניתוח תמונה מאוחר יותר. כאן ייצוגית גוף פטריות גוף תמונות נוירון, שנרכשו כפי שהודגם ניתן לראות.הביטוי המואר הספציפי של חיישן dHomer-GCaMP3, אשר אינו בא לידי ביטוי בתאים האקסוניים של הנוירון, מדגים אות מנוקד בתא הדנדריטי. ברור אם כי תגובות ריח משרעת נמוכה ניתן לראות זבובים המבטאים dHomer-GCaMp3, לעומת זבובים המבטאים GCaMP6f ציטוסולי. כאן, עקבות סידן מייצגים טיסה בודדת אחת מדגימה שונות ברמת הרעש משרעת שניתן להשיג בין הכנות בודדות.טכניקה זו פתחה את האפשרות של הדמיה ברמה התת-תאית, כיצד ייצוגי חוש הריח מאופננים וכיצד שלבים בזיכרון נוצרים באמצעות מיזוג. ניסויים כאלה יהיו חיוניים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של מבנים מוחיים מורכבים כגון גוף הפטריות, ולאפיין כיצד זיכרונות אסוציאטיביים מאוחסנים על פני אוכלוסיות מבוזרות של נוירונים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

מידול תלת-מיוד של קוצים דנדריטיים עם פלסטיות סינפטית

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...