Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
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이 작품은 공동 연구 센터 SFB 889 "감각 처리의 메커니즘"과 2705 "뇌 회로의 해부 : 구조, 가소성 및 행동 기능의 연구 단위를 통해 독일 연구위원회에 의해 지원되었다 초파리 버섯 몸".

1. 형질전환 과일 파리, 초파리 멜라노가스터
<ol><li>교차 여성 처녀와 수컷 파리 (12 시간 빛 / 어두운 주기에 60 % 상대 습도에서 25 °C에서 제기) 원하는 Gal4 및 UAS 구성25를운반, 관심의 특정 뉴런이 유전적으로 코딩 을 표현하는 파리를 생산하기 위해 각각 칼슘 표시기.</li>
	<li>그들은 3-6 일 후 에클로션의 범위에때까지 위의 십자가의 여성 자손을 나이. 암컷 파리는 약간 ?...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

학습 및 메모리의 기본 신경 회로의 해부는 신경 과학 분야에서 눈에 띄는 목표. Drosophila의 유전 적 접근성과 행동 테스트의 폭과 용이성은 이러한 현상을 조사하기에 이상적인 도구입니다. 여기서, 후각 컨디셔닝의 결과로 세포 내 수준에서 발생하는 변조, 개별 파리 내에서 시각화 할 수있는 방법이 제시된다. 우리 그룹17에의해 처음 확립 된 악취 유발 칼슘 역학의 사전 ...

학습을 통해 뇌에서 정보를 획득하고 메모리로 저장하는 위치와 방법을 해독하는 것은 신경과학1에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 신경과학 연구는 학습과 기억 형성의 기초가 되는 신경 기질로서 시냅스 전송의 변화의 개념을 주도하고 있다2,3. 그것은 가설, 학습 하는 동안, 자극의 인식 동안 활성화 되는 신경 앙상블 간의 시 냅 스 연결 메모리 회수 하는 동안 그들의 결합 된 활동 패턴을 검색할 수 있도록 수정 될, 따라서 지시 향후 행동 행동4. 이러한 "engram 세포" 그리고 그들의 시 냅 스는 종종 뇌 영역 및 처리의 수준에 걸쳐 배포, 작업 또는 자극의 학습에 시 냅 스 전송에 관찰 된 변화를 할당 하기 어려운. 특정 학습 작업에 인가적으로 연결된 시냅스 변화를 지역화하고 시각화하려면 시냅스를 정확하게 제한하는 적절한 모델 시스템이 필요합니다.
이러한 노력을 위해, Drosophila 멜라노가스터는 상대적인 두뇌 단순성, 행동 풍요로움 및 실험적 접근성을 결합하기 때문에 특히 적합합니다. 잘 확립 된 모델 유기체 중, Drosophila는 선충 C. 예쁜 꼬마와 신경 복잡성의 관점에서 마우스와 같은 유전적으로 견인 포유 동물 사이에 위치하고 있습니다. 뉴런 (~300)과 제한된 행동 레퍼토리의 입체 수는 C. elegans에서 관찰됩니다. 포유류는, 다른 한편으로는, 뉴런의 수백만있고 엄청난 행동 복잡성이 있습니다. 과일 파리의 뇌는 ~ 100,000, 대부분의 척추 동물의 뇌보다 훨씬 작은 뉴런, 그리고 뉴런의 대부분은 개별적으로 식별 할 수있습니다 5. 그러나, Drosophila는 40 년 전에 처음 기술된 강력한 연관 후각 학습 및 기억 형성을 전시하는 기능을 포함하여 복잡한 행동의 넓은 스펙트럼을 보여줍니다6. 이 고전적인 컨디셔닝 절차의 과정에서, 파리의 그룹은 조건부 자극 (CS+)으로냄새를 받게되고 무조건 자극 (미국)으로 처벌 전기 충격을받습니다. 두 번째 냄새 (CS- )는 어떤 처벌없이 제시된다. 이에 의해, 동물들은 처벌과 관련된 악취를 피하는 법을 배워, 이는 두 냄새,CS+및 CS-사이의후속 선택 상황에서 시험될 수 있다. Drosophila에서 이 행동의 밑에 있는 신경 기질해저에 대한 연구는 버섯 바디 (MB)를 "engram"7,8,9,10의 1차 부위로 확인했습니다 따라서, 이 뇌 영역의 회로는 메모리 엔그램이 획득되고 저장되는 논리를 밝히기 위해 강렬한 연구의 대상이되고 있다 (최근11,12에서검토).
Drosophila MB는 반구당 ~2,000개의 본질적인 뉴런(Kenyon cells)으로 구성되어 있으며, 축삭돌출부 13으로구성된다. 후각 프로젝션 뉴런의 축삭은 MB의 주요 수지상 입력 부위인 MB 칼릭스및 안테나 로브로부터 후각 입력을 수신하는 측면 프로토세레브라 및 MB 칼리세스로 확장된다. 케년 세포의 길고 평행한 축삭 번들은 페던클과 로브를 구성한다. 대부분의 케년 세포는 수평 β/β'-로브를 형성하여 뇌의 중간선쪽으로 하나의 부수적인 것을 확장하고, 등쪽 전방 방향으로 두 번째 부수적 인 투영을 연장시킴으로써 수직 α/α'-로브를 형성합니다. 케년 세포의 다른 그룹은 학습 과정 및 후속 단기 기억 형성이 국소화 될 수있는 MB의 수평 γ-로브(13)를 형성한다 10. MB 로브는 구심성 입력을 수신하고 원심성 출력을 제공하며, 둘 다 일반적으로 케니언 셀 축삭14,15,16을따라 뚜렷한 구획 하위 영역으로 제한된다. 특히, 구심성 도파민성 MB 입력 뉴런은 부가가치 기반, 예를 들어, 연관후각 학습에서 징벌적, 강화 효과를 중재하는 것으로 나타났다15,17. 버섯 체외로부터 의기질적이고 개별적으로 식별 가능한 원추형 MB 출력 뉴런은 많은 수의 케니언 세포에 걸쳐 정보를 통합하고, 다양한 뇌 영역을 표적으로 하며, 행동-유익한 식욕 또는 비열한 정보를 지니고있습니다 15 . 이러한 뉴런 아키텍처는 연관 엔그램의 조직에 대한 개념으로 이어졌다. 냄새는 상대적으로 정확하게 케니언 세포의 드물게 활성화 앙상블에 의해 인코딩된다. 이러한 케니언 세포 앙상블의 일치 활성 및 도파민의 방출 - 자극을 처벌하여 불러일으킨 - 케년 세포 프리시냅스에서 MB 출력 뉴런으로의 전염을 조절하여 동물이 이후에 이 특정 한 냄새를 피할 수 있도록10 ,12. 우리는 시냅스 활동에 있는 이 학습 의존적인 변경이 어떻게 결정되고 감시될 수 있는지 설명하기 위하여 패러다임 사례로 오히려 정확하게 정의되고 현지화된 engram를 이용합니다.
모델 시스템으로 Drosophila의 가치는 복잡한 회로18내의 단일 뉴런을 식별, 모니터링 및 제어하기 위한 트랜스유전자를 표현할 수 있는 타의 추종을 불허하는 유전 적 도구 상자에 강하게 의존합니다. 여기에서 논의된 칼슘 이미징과 같은 신경 활동 모니터링을 위한 기술의 출현은 특정 자극에 반응하여 신경 활동 패턴의 측정을 허용했습니다. 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs)의 특정 Gal4 구동 식과 후각 자극을 결합함으로써, 관심 있는 뉴런의 악취유발 칼슘 역학을 시각화할 수 있다19. 이 프로토콜에서는 이 기술을 고전적인 컨디셔닝 패러다임과 추가로 결합함으로써 학습의 맥락에서 이러한 후각 반응을 검사할 수 있음을 보여준다. 학습 유도 가소성은 단일 특정 뉴런뿐만 아니라 뉴런의 특정 하위 구획에 국한되는 GECI를 사용하여 추가로 해부 될 수 있습니다. Pech 등20 정확히 이것을 허용하는 도구의 선택을 설립했다. GCaMP321을 척추동물 시냅토피신 또는 d호머에 대한 연계를 통해 사전 또는 후시냅스를 대상으로 함으로써, 각각20-이들부위의 차등 변조를 구별할 수 있다. 이러한 국소화는 시토솔 전체에 걸쳐 유비쿼터스적으로 존재하는 대부분의 GEC에 비해 이점이 있습니다 -예를 들어, GCaMP22,GCaMP321,또는 GCaMP623 - 사전 및 사후 내시 과도가 될 수 있음을 의미하기 때문에 신경 활성화의 결과로 발생하는 전반적인 통합 칼슘 유입과 구별됩니다. 이 결과 발생 하거나 학습 및 메모리 형성을 일으키는 원인이 되는 가소성의 위치와 종류에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 일례로, 여기에 제공된 프로토콜은 후각 연관 학습 동안 MB 출력 뉴런의 변조를 해독하는 데 있어서 이 도구의 가치를 나타낸다. 모니터링함으로써, 개별 비행 내에서, 후각 컨디셔닝 전후의 악취 유발 활동은 순진한 냄새 반응과 학습된 냄새 반응 사이에 직접적인 비교를 그릴 수 있습니다. 동일한 이미징 챔버에 고정되어 있는 동안 파리는 다양한 냄새에 노출됩니다. 그런 다음, 이러한 악취 중 하나가 감전과 짝을 이루는 비동기 연관 컨디셔닝프로토콜을 수신하고 (CS +가됨) 또 다른 냄새가 보강없이 제시됩니다(CS가됨 -). 마지막으로, 파리는 첫 번째 단계에서와 같은 냄새에 다시 노출됩니다. 칼슘 역학은 2 광자 현미경 검사법을 사용하여 관찰됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

많은 모형 유기체에 있는 연구의 십년간은 시냅스가 소성의 현재 개념 기초적인 학습 및 기억 형성으로 이끌어 냈습니다. 시 냅 스 전송에 학습 유발 된 변화는 종종 많은 뉴런및 뇌의 처리 수준에 걸쳐 배포. 따라서, 뉴런에 걸쳐 학습 의존 시 냅 스가 소성을 시각화 하는 방법이 필요 하다. 열매 파리 드로소필라 멜라노가스터는 학습의 기초가 되는 뉴런 회로를 연구하는 데 특히 유리한 모델 유기체를 나타낸다. 여기에 제시된 프로토콜은 연관 후각 기억, 즉 시냅스 활성 및 그 변화의 형성의 기초가되는 프로세스가 생체 내에서 모니터링 될 수있는 방법을 보여줍니다. Drosophila에서유효한 유전 공구의 광범위한 배열을 사용하여, 결정된 세포 인구 및 단 하나 세포에 있는 유전으로 부호 매겨진 칼슘 표시기를 구체적으로 표현하는 것이 가능합니다. 제자리에 비행을 고정하고 헤드 캡슐을 열어, 후각 자극을 전달하는 동안 이러한 세포에서 칼슘 역학을 시각화 할 수있다. 또한, 우리는 비행이 신체에 감전을 동시에 실시 할 수있는 설정을 보여줍니다. 이것은 파리가 고전적인 후각 컨디셔닝을 겪을 수있는 시스템을 제공합니다 - 이전에 순진한 냄새가 감전 처벌과 관련이 있는 것으로 배운다 - 동시에이 냄새 (및 기타 훈련되지 않은 냄새)의 표현과 함께 두 광자 현미경 검사를 통해 뇌에서 관찰. 우리 실험실은 이전에 형광 칼슘 신호를 사전 또는 후시 내피 구획에 제한 할 수있는 합성 국소 칼슘 센서의 생성을보고했습니다. 2 광자 현미경 검사법은 공간적으로 미세 한 구조를 해결하는 방법을 제공합니다. 우리는 버섯 몸에서 정보를 통합 하는 뉴런에 초점을 맞추고이 예시, 곤충 두뇌의 높은 순서 센터. 전반적으로, 이 프로토콜은 후각 학습의 결과로 활동이 조절되는 뉴런 간의 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공한다.

위의 프로토콜로 획득한 이미지의 예는 그림 2에서볼 수 있습니다. d 호머-GCaMP3는 MB γ-로브의 구획 1을 내면화하는 MB 출력 뉴런으로 발현되며(뉴런은MVP2,29라고하며) 분할-Gal4 라인 MB112C16을사용하여 유전적으로 표적화된다. 또한, 세포순환 및 사후 공조 국소 칼슘 지표의 세포외 국?...

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In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

이 기술은 drosophila 멜라노가스터에서 학습 및 메모리 형성의 기본 학습 및 메모리 형성을 위한 생리적 매개 변수로서 시냅스 칼슘 활성의 실시간으로 관찰을 용이하게 한다. 연관 훈련 전후의 냄새에 대한 신경 반응을 비교함으로써 시냅스 활동과 개별 과일 파리의 메모리 추적 형성 사이의 직접적인 상관 관계를 그릴 수 있습니다. 관심의 특정 뉴런이 원하는 GAL4 와 UAS 구조를 운반하는 여성 처녀와 남성 파리를 교차 하는 유전으로 인코딩 된 칼슘 표시기를 표현하는 형질 전환 과일을 생산하기 위해 3 ~ 6 일 후에 여성 자손나이.이미징을 위한 비행을 준비하려면 미세 한 집게를 사용하여 얼음 마취 비행을 사용자 정의 준비 된 이미징 챔버에 배치하십시오. 해부 현미경을 사용하여 흉부와 다리를 챔버 의 하단에있는 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 누워 있습니다. 투명한 접착 테이프로 비행을 고정하고 외과 용 메스 블레이드를 사용하여 머리 주위의 테이프의 창을 잘라 안테나가 덮여 있고 흉부의 앞쪽 부분만 노출됩니다.오목한 볼록한 턱이 들고 있는 곤충 핀을 사용하여 파란색 광 경화 접착제로 머리의 측면과 뒷면을 조심스럽게 둘러싸습니다. 그리고 접착제를 설정하는 LED 램프를 방출 하는 파란색 빛을 사용 하 여. 접착제가 완전히 설정되면 플라이 헤드의 등대 표면에서 잔류되지 않은 접착제를 지우고 링거 용액을 한 방울로 머리의 노출된 큐티클을 덮습니다.매우 미세한 칼날을 사용하여, 코엘리에서 시작하여 각 측면 내측을 눈으로 자르기 시작하여 집게를 사용하여 쉽게 찢어질 수 있는 큐티클의 플랩을 형성하기 위해 머리 뒤쪽을 가로질러 큐티클을 잘라냅니다. 관심의 뇌 영역을 차단하 고 신중 하 게 어떤 기관의 등대 표면을 취소 하는 좋은 집게를 사용 하 여 어떤 과잉 큐티클을 제거, 뇌 조직 자체의 중단을 피하기 위해 주의. 조직 파편 영역을 지우기 위해 필요에 따라 링거의 용액을 제거하고 새로 고칩니다.그리고 피하 악취 전달 바늘을 플라이의 머리로부터 약 1센티미터 떨어진 곳에 놓고, 안테나에 악취 전달을 방해할 수 있는 것은 아무것도 없다. 그런 다음 피하 악취 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 악취 전달 시스템에 연결합니다. 그리고 비행이 마취 및 수술에서 회복 10 분 허용합니다.GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 적외선 레이저가 장착된 다광 현미경의 레이저와 진동 격리 테이블에 설치된 수분 침지 목표를 920 나노미터의 난루 파장에 조정하고 GFP 밴드패스 필터를 설치합니다. 코스 Z 조정 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하여 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간을 최소화하기 위해 관심 영역에만 스캐닝에 초점을 맞춥니다.그리고 헤드의 전방이 아래쪽을 향하고 있도록 스캔 뷰를 회전합니다. 그런 다음 프레임 크기를 512x512픽셀로 조정하고 스캔할 영역을 선택합니다. 각 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4개의 hertz의 프레임 속도를 달성합니다.악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 미리 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 6.25초 동안 현미경 소프트웨어에서 측정을 시작하여 F0 기준값을 설정합니다. 악취 전달 시스템에서는, 특정 악취 컵 밸브의 개폐에 의해 트리거된 LED의 조명에 의해 여기에 표시된 2.5 초 악취 자극을 전달합니다. 냄새 오프셋의 끝에 기록의 12.5 초 뒤에.그런 다음 동일한 방식으로 두 번째 및 세 번째 냄새에 대한 배달을 반복합니다. 이 설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 12 90 볼트 감전과 함께 60초 동안 조절된 자극-플러스 냄새를 제시합니다. 60초 의 휴식 후 감전없이 60 초 동안 조건부 자극 - 마이너스 - 냄새만 제시한다.훈련 후 3분 후 사전 훈련 악취 자극 프로토콜을 반복하여 칼슘 과일성을 다시 측정한다. 그런 다음 이미징 파일을 나중에 이미지 분석을 위한 적절한 형식으로 저장합니다. 여기서 대표적인 버섯 체출력 뉴런 이미지는, 입증된 바와 같이 획득하여 관찰될 수 있다.뉴런의 축축구에서 발현되지 않는 dHomer-GCaMP3 센서의 특이적 구획식 발현은 수지상 구획에서 정점 신호를 나타낸다. 명확한 진폭 냄새 반응은 세포성 GCaMP6f를 표현하는 파리에 비해 dHomer-GCaMp3을 표현하는 파리에서 관찰 될 수 있습니다. 여기서, 한 개별 비행의 대표적인 칼슘 흔적은 개별적인 준비 사이에서 얻을 수 있는 소음 수준 및 진폭의 차이를 보여줍니다.이 기술은 하위 셀룰러 수준에서 시각화의 가능성을 열었습니다, 후각 표현이 변조되는 방법 및 컨디셔닝을 통해 메모리 단계가 형성되는 방법. 이러한 실험은 버섯 몸과 같은 복잡한 뇌 구조에 대한 우리의 이해를 확장하고, 연관 기억이 뉴런의 분산 된 인구에 걸쳐 저장하는 방법을 특성화하는 것이 중요 할 것이다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

연구

신경과학

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole 유도 점화 마우스 모델

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

시냅스 가소성을 가진 수지상 척추의 3D 모델링

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...