Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho alemão de pesquisa através do centro de pesquisa colaborativa SFB 889 "mecanismos de processamento sensorial" e da unidade de pesquisa para 2705 "dissecção de um circuito cerebral: estrutura, plasticidade e função comportamental do Corpo de cogumelo Drosophila ".

1. moscas transgênicas de frutas, Drosophila melanogaster
<ol><li>A fêmea transversal do Virgin e do macho voa (levantado em 25 ° c na umidade relativa de 60% em um ciclo claro/escuro de 12 h) que carreg as construções desejadas de Gal4 e de UAS25, respectivamente, para produzir as moscas em que os neurônios específicos do interesse expressam um genetically codificado indicador de cálcio.</li>
	<li>Age a progêia feminina da Cruz acima até que estejam na faixa de 3-6 dias após...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

A dissecção dos circuitos neurais subjacentes à aprendizagem e à memória é um objetivo proeminente no campo da neurociência. A acessibilidade genética da Drosophila e a amplitude e facilidade de testes comportamentais fazem desta uma ferramenta ideal para investigar tais fenômenos. Aqui, um método é apresentado com o qual é possível visualizar, dentro de moscas individuais, a modulação que ocorre em um nível subcelular como resultado do condicionamento olfativo. Ao realizar o pré-treinamento e a...

Decifrar onde e como a informação é adquirida no cérebro através da aprendizagem e, posteriormente, armazenada como memória constitui uma das tarefas mais desafiadoras na neurociência1. A pesquisa neurocientífica levou ao conceito de mudança na transmissão sináptica como substrato neuronal que está subjacente à formação de aprendizagem e memória2,3. É supor que, durante a aprendizagem, as conexões sináptica entre os conjuntos neuronal que são ativos durante a percepção de um estímulo tornam-se modificados de modo que seu teste padrão combinado da atividade possa ser recuperado durante a recordação da memória, assim instruindo ação comportamental futura4. Estas "células Engram" e suas sinapses são muitas vezes distribuídas entre as regiões cerebrais e os níveis de processamento, o que dificulta a atribuição de alterações observadas na transmissão sináptica para a aprendizagem de uma tarefa ou um estímulo. Para localizar e Visualizar essas alterações sinápticas que são causalmente ligadas a uma tarefa de aprendizado específica, uma precisa de um sistema de modelo adequado que permita confinar precisamente essas sinapses.
Para tal empreendimento, a Drosophila melanogaster é particularmente adequada porque combina a simplicidade relativa do cérebro, a riqueza comportamental e a acessibilidade experimental. Entre os organismos modelo bem estabelecidos, a Drosophila está situada entre o nematódeo C. elegans e mamíferos geneticamente tratável como camundongos em termos de complexidade neuronal. O número estereotipado de neurônios (~ 300) e o repertório comportamental limitado é observado em C. elegans. Os mamíferos, por outro lado, têm milhões de neurônios e uma complexidade comportamental surpreendente. O cérebro da mosca da fruta é, com o seu ~ 100.000, neurônios significativamente menores do que os cérebros da maioria dos vertebrados, e muitos dos neurônios são individualmente identificáveis5. No entanto, a Drosophila demonstrar um amplo espectro de comportamentos complexos, incluindo uma capacidade de apresentar formação olfatória associativa robusta e de memória, descrita pela primeira vez há mais de 40 anos6. No decorrer deste procedimento de condicionamento clássico, grupos de moscas são submetidos a um odor como o estímulo condicionado (CS+), enquanto eles recebem um choque elétrico punindo como o estímulo não condicionado (EUA). Um segundo odor (CS-) é então apresentado sem qualquer punição. Assim, os animais aprendem a evitar o odor associado com a punição, que pode ser testado em uma situação de escolha subsequente entre os dois odores, CS+ e cs-. O trabalho na dissecação do substrato neuronal subjacente a esse comportamento na Drosophila identificou os corpos de cogumelos (MB) como o local primário do "Engram"7,8,9,10 e, portanto, o circuito desta região cerebral foi e é objeto de intensa pesquisa, a fim de desvendar a lógica pela qual um engrama de memória é adquirido e armazenado (recentemente revisado em11,12).
A Drosophila MB consiste em ~ 2.000 neurônios intrínsecos (células de Kenyon) por hemisfério, organizados em projeções axonais paralelas13. Os axônios dos neurônios de projeção olfativa são estendidos ao protocerebra lateral e aos calyces do MB, o local de entrada dendrítico principal do MB e recebem a entrada olfactory dos lóbulos sensilas. O feixe longo, paralelo dos axônios de pilhas de Kenyon constituem o pedúnculo e os lóbulos. A maioria das células de Kenyon bifurcate formando β/β'-lóbulos horizontais, estendendo uma colateral para a linha média do cérebro, e os lobos verticais α/α'-por estender a segunda garantia projetando na direção dorsal-anterior. O outro grupo de células de Kenyon forma os γ-lóbulos horizontais13 do MB onde o processo de aprendizagem e a formação subseqüente da memória a curto prazo podiam ser localizados10. Os lóbulos MB recebem entrada aferente e proporcionam saída eferente, ambos tipicamente restritos a distintas sub-regiões compartimental ao longo dos axônios da célula de Kenyon14,15,16. Em particular, os neurônios de entrada de MB dopaminérgicos aferentes têm sido mostrados para mediar os efeitos baseados em valor, por exemplo, PUNITIVOS, reforçando na aprendizagem olfatória associativa15,17. Os neurônios de saída de MB eferentes estereotípicos e individualmente identificáveis dos lóbulos de corpo de cogumelo integram informações em um grande número de células Kenyon, segmentam diversas áreas cerebrais e carregam informações apetitoso ou aversivas de comportamento-instrutiva15 . Esta arquitetura neuronal conduziu a um conceito da organização do Engram associativo. Os odores são codificados relativamente precisamente por conjuntos escassamente ativados de células de Kenyon. A atividade coincidente destes conjuntos de células de Kenyon e liberação de dopamina-evocado por punindo estímulos-modula transmissão de células de Kenyon presynapses em MB neurônios de saída, de tal forma que os animais irão subsequentemente evitar este cheiro particular10 ,12. Nós usamos este engrama rather precisamente definido e localizado como um caso paradigmática para ilustrar como estas mudanças aprendizagem-dependentes na atividade sináptica podem ser determinadas e monitoradas.
O valor de Drosophila como um sistema modelo confia fortemente na caixa de ferramentas genética incomparável que permite que um expresse transgenes para identificar, monitorar, e controlar únicos neurônios dentro dos circuitos complexos18. O advento de técnicas de monitoramento de atividade neuronal-como a imagem de cálcio, discutido aqui-permitiu a determinação de padrões de atividade neuronal em resposta a um estímulo específico. Combinando a expressão Gal4-driven específica de indicadores genetically codificados do cálcio (GECIs) com estimulação olfactory, uma pode visualizar a dinâmica odor-evocada do cálcio dos neurônios do interesse19. Neste protocolo, mostra-se que, ao acoplar essa técnica com um paradigma de condicionamento clássico, é possível examinar essas respostas olfativas no contexto da aprendizagem. A plasticidade induzida pela aprendizagem pode ser mais dissecada usando GECIs que não são apenas localizadas a um único Neuron específico, mas também a subcompartimentos específicos de um Neuron. Pech et al.20 estabeleceram uma seleção de ferramentas que permitem exatamente isso. Alvejando o GCaMP321 ao pre-ou ao postsynapse-através da ligação ao vertebrados synaptophysin ou ao Homer de d, respectivamente20-a modulação diferencial destes locais pode ser distinguida. Esta localização confere, neste contexto, uma vantagem sobre a maioria dos GECIs que estão presentes em todo o citosol-por exemplo, GCaMP22, GCaMP321, ou GCaMP623 -porque significa que os transientes pré e pós-sinápticos podem ser distinto do influxo integrado geral do cálcio que ocorre em conseqüência da ativação do neurônio. Isso pode fornecer pistas sobre a localização e os tipos de plasticidade que ocorrem como resultado de ou que causam a formação de aprendizagem e memória. Como um exemplo, o protocolo fornecido aqui mostra o valor desta ferramenta em decifrar a modulação de neurônios de saída MB durante a aprendizagem associativa olfatória, direcionando a expressão do sensor de cálcio para apenas o postsynapse. Monitorando, dentro de uma mosca individual, atividade odor-evocada antes e depois do condicionamento olfactory uma comparação direta pode ser extraída entre uma resposta ingênua do odor e uma resposta aprendida do odor. Embora fixado na mesma Câmara de imagem, as moscas são expostas a uma seleção de odores. Em seguida, eles recebem um protocolo de condicionamento associativo aversivo em que um desses odores é emparelhado com choque elétrico (tornando-se o CS+) e outro odor é apresentado sem reforço (tornando-se o cs-). Finalmente, as moscas são novamente expostos aos mesmos odores como na primeira etapa. A dinâmica do cálcio é observada usando microscopia de dois fótons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

Décadas de pesquisa em muitos organismos modelo levaram ao conceito atual de plasticidade sináptica subjacente aprendizagem e formação de memória. Mudanças induzidas pela aprendizagem na transmissão sináptica são muitas vezes distribuídas em muitos neurônios e níveis de processamento no cérebro. Portanto, os métodos para visualizar a plasticidade sináptica dependente da aprendizagem através dos neurônios são necessários. A mosca de fruto Drosophila melanogaster representa um organismo modelo particularmente favorável para estudar os circuitos neuronais de aprendizagem subjacente. O protocolo aqui apresentado demonstra uma maneira em que os processos subjacentes à formação de memórias olfatório associativas, ou seja, atividade sináptica e suas mudanças, podem ser monitorados in vivo. Usando a ampla gama de ferramentas genéticas disponíveis na Drosophila, é possível expressar especificamente indicadores de cálcio geneticamente codificados em populações de células determinadas e até mesmo células individuais. Fixando uma mosca no lugar, e abrindo a cápsula principal, é possível visualizar a dinâmica do cálcio nestas pilhas ao entregar estímulos olfactory. Além disso, demonstramos uma set-up em que a mosca pode ser submetida, simultaneamente, a choques eléctricos para o corpo. Isto fornece um sistema em que as moscas podem submeter-se ao condicionamento olfactory clássico-por meio de que um odor previamente ingênuo é aprendido para ser associado com a punição de choque elétrico-ao mesmo tempo que a respresentação deste odor (e outros odores não treinados) é observada no cérebro através de microscopia de dois fótons. Nosso laboratório relatou previamente a geração de sensores synaptically localizados do cálcio, que permite que um confinar os sinais fluorescentes do cálcio aos compartimentos pre-ou pós-sináptica. A microscopia de dois fótons fornece uma maneira de resolver espacialmente estruturas finas. Nós exemplificamos isso, concentrando-se em neurônios integrando informações do corpo do cogumelo, um centro de ordem superior do cérebro do inseto. Globalmente, este protocolo fornece um método para examinar as conexões sinápticas entre os neurônios cuja atividade é modulada como resultado do aprendizado olfativo.

Um exemplo de imagens adquiridas com o protocolo acima pode ser observado na Figura 2. d Homer-GCaMP3 é expressado em um neurônio da saída do MB cujos os dendritos inervam o compartimento 1 do MB γ-lóbulo (o neurônio é denominado MVP228,29) e é visado genetically usando a linha Split-Gal4 MB112C16. Também, demonstrado é a diferença na localização subcelula...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Esta técnica facilita a observação em tempo real da atividade sináptica de cálcio como parâmetro fisiológico para os processos celulares subjacentes à aprendizagem e formação da memória em drosophila melanogaster. Comparando respostas neuronais com odores antes e depois do treinamento associativo, podemos desenhar correlações diretas entre a atividade sináptica e a formação do traço de memória em moscas de frutas individuais. Para produzir moscas de frutas transgênicas em que neurônios específicos de interesse expressam um indicador de cálcio geneticamente codificado cruzam moscas fêmeas e machos carregando as construções GAL4 e UAS desejadas, e envelhecem a progêneria feminina até três a seis dias após a eclosão.Para preparar uma mosca para a imagem, use fórceps finos para colocar uma mosca anesthetizada de gelo em uma câmara de imagem personalizada. Usando um microscópio dissecando para posicionar o tórax e as pernas em contato com os fios elétricos na parte inferior da câmara, e com a cabeça deitada plana. Fixar a mosca no lugar com fita adesiva clara, e use uma lâmina de bisturi cirúrgica para cortar uma janela na fita ao redor da cabeça, deixando a antena coberta e apenas a parte anterior da parte mais do tórax exposta.Use um pino de inseto segurado por mandíbulas côncavas-convexas para cercar cuidadosamente os lados e a parte de trás da cabeça com cola de cura de luz azul. E use uma lâmpada LED emissora de luz azul para definir a cola. Quando a cola estiver completamente definida, limpe qualquer cola residual não hardened da superfície dorsal da cabeça de mosca e cubra a cutícula exposta da cabeça com uma gota da solução de Ringer.Usando uma faca de faca de lâmina muito fina, corte a cutícula através da parte posterior da cabeça, começando no ocelli e cortando cada lado medial para os olhos para formar um retalho da cutícula que pode ser facilmente arrancado usando fórceps. Remova qualquer cutícula em excesso que possa bloquear a região do cérebro de interesse e use fórceps finos para limpar cuidadosamente a superfície dorsal de qualquer traqueia, tomando cuidado para evitar a ruptura do próprio tecido cerebral. Remova e atualize a solução do Ringer conforme necessário para limpar a área dos detritos teciduais.E coloque uma agulha de entrega de odor hipodérmico a aproximadamente um centímetro da cabeça da mosca, tomando cuidado não há nada que possa obstruir a entrega de odor na antena. Em seguida, conecte a câmara de imagem ao sistema de distribuição de odor através da agulha de entrega de odor hipodérmico. E deixe a mosca 10 minutos para se recuperar da anestesia e da cirurgia.Para visualização dos indicadores de cálcio baseados em GFP, sintonize o laser de um microscópio multifóton equipado com um laser infravermelho e um objetivo de imersão de água instalado em uma mesa isolada de vibração a um comprimento de onda de 920 nanômetros e instale um filtro de bandpass GFP. Usando o botão de ajuste Z do curso, escaneie através do eixo Z do cérebro para localizar a região cerebral de interesse. Use a função crop para focar a digitalização apenas na área de interesse, para minimizar o tempo de varredura.E gire a visão de varredura de tal forma que o anterior da cabeça está voltado para baixo. Em seguida, ajuste o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels e selecione a região a ser digitalizada. Levando em conta o tempo de varredura calculado para cada quadro, para alcançar uma taxa de quadro de pelo menos quatro hertz.Para visualização transitória de cálcio evocada pelo odor, inicie um pacote macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagens e o programa de entrega de odor e inicie a medição no software de microscópio por 6,25 segundos para estabelecer um valor de linha de base F0. No sistema de entrega de odor, entregue um estímulo de odor de 2,5 segundos indicado aqui pela iluminação dos LED's acionados pela abertura e fechamento de válvulas específicas de copo de odor. Seguido por 12,5 segundos de gravação no final do deslocamento do odor.Em seguida, repita a entrega para um segundo e terceiro odor da mesma maneira. Para realizar o condicionamento associativo nesta configuração, use o sistema de entrega de odor controlado pelo computador para apresentar o estímulo condicionado-mais-odor por 60 segundos ao lado de 12 choques elétricos de 90 volts. Após uma pausa de 60 segundos, apresentam o estímulo condicionado-menos-odor sozinho por 60 segundos sem choque elétrico.Meça o odor pós-treino evocando a transitoriedade do cálcio novamente, repetindo o protocolo de estimulação do odor pré-treino três minutos após o término da fase de treinamento. Em seguida, salve os arquivos de imagem em um formato apropriado para análise posterior de imagem. Aqui imagens representativas do neurônio de saída do corpo do cogumelo, adquiridas como demonstrado podem ser observadas.A expressão compartimentalizada específica do sensor dHomer-GCaMP3, que não é expressa nos compartimentos axonais do neurônio, demonstra um sinal pontuado no compartimento dendrrítico. Respostas claras, embora de menor amplitude, podem ser observadas em moscas expressando dHomer-GCaMp3, em comparação com moscas expressando GCaMP6f citosoúnica. Aqui, traços representativos de cálcio de uma mosca individual demonstram variâncias no nível de ruído e amplitude que podem ser obtidas entre as preparações individuais.Esta técnica abriu a possibilidade de visualização no nível subcelular, como as representações olfativas são moduladas e como as fases da memória são formadas através do condicionamento. Tais experimentos serão vitais para expandir nossa compreensão de estruturas cerebrais complexas, como o corpo de cogumelos, e para caracterizar como memórias associativas são armazenadas em populações distribuídas de neurônios.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Neurociência

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

Modelagem 3D de Espinhos Dendríticas com Plasticidade Sináptica

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...