Name: in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Bu çalışma Alman Araştırma Konseyi tarafından SFB 889 "Duyusal İşleme Mekanizmaları" ve 2705 "Beyin Devresinin Diseksiyonu: Yapı, Plastisite ve Davranışfonksiyonu" araştırma birimi aracılığıyla desteklenmiştir. Drosophila Mantar Vücut".

1. Transgenik meyve sinekleri, Drosophila melanogaster
<ol><li>Çapraz dişi bakire ve erkek sinekler (12 saat açık/karanlık bir döngüde %60 bağıl nemde 25 °C'de yükselir) istenilen Gal4'ü taşır ve UAS, belirli ilgi nöronlarının genetik olarak kodlanmış bir şekilde ifade ettiği sinekleri üretmek için sırasıyla25'iinşa eder. kalsiyum göstergesidir.</li>
	<li>Yaş onlar 3-6 gün post-klozyon aralığında olana kadar yukarıdaki haç kadın soyundan. Dişi sinekle...

<ol>
	<li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+memory?+The+present+state+of+the+engram.">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40 (2016).</li><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+memory:+an+evaluation+of+the+hypothesis.">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li><li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis:+encoding,+storage+and+persistence.">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li><li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Allocation:+Mechanisms+and+Function.">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li><li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning.">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li><li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies.">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li><li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engram+found?+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies.">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li><li>Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+memory+trace:+aversive+associative+olfactory+learning+and+short-term+memory+in+Drosophila.">Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila.</a> In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).</li><li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+the+right+thing:+neural+network+mechanisms+of+memory+formation,+expression+and+update+in+Drosophila.">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li><li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory.">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li><li>Aso, Y., Gr&#252;bel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers.">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li><li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution.">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Riemensperger, T., V&#246;ller, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain.">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noize+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies,+Drosophila+melanogaster.">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila.">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li><li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila.">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li></ol>

Öğrenme ve hafızanın altında yatan nöral devrelerin diseksiyonu nöroloji alanında önemli bir hedeftir. Drosophila genetik erişilebilirlik ve genişliği ve davranışsal test kolaylığı bu tür olayları araştırmak için ideal bir araç yapar. Burada, koku alma koşullandırması sonucunda hücre altı düzeyde meydana gelen modülasyonu tek tek sinekler içinde görselleştirmenin mümkün olduğu bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak17.grubumuz tarafından kurulan koku u...

Bilginin öğrenme yoluyla beyinde nereden ve nasıl elde edildiği ve daha sonra bellek olarak depolandığı deşifre etmek, nörolojinin en zorlu görevlerinden birini oluşturmaktadır1. Nörobilimsel araştırma öğrenme ve hafıza oluşumu 2 altında yatan nöronal substrat olarak sinaptik iletim bir değişiklik kavramına yol açmıştır2,3. Öğrenme sırasında, bir uyarıcının algılanması sırasında aktif olan nöronal topluluklar arasındaki sinaptik bağlantıların, bir leştirilmiş aktivite deseni hafıza hatırlama sırasında alınabilecek şekilde değiştirilebileceği ve bu nedenle gelecekteki davranışsal eylem4. Bu "engram hücreleri" ve onların sinapsları genellikle beyin bölgeleri ve işleme düzeyleri arasında dağıtılır, hangi zor bir görev veya uyarıcı öğrenme sinaptik iletim gözlenen değişiklikler atamak için yapar. Belirli bir öğrenme görevine nedensel olarak bağlı olan bu sinaptik değişiklikleri yerelleştirmek ve görselleştirmek için, bu sinapsların tam olarak sınırlandırılmasına olanak tanıyan uygun bir model sistemine ihtiyaç vardır.
Böyle bir çaba için, Drosophila melanogaster göreceli beyin basitliği, davranışsal zenginlik ve deneysel erişilebilirlik birleştirir çünkü özellikle uygundur. Köklü model organizmalar arasında, Drosophila nöronal karmaşıklık açısından fareler gibi nematod C. elegans ve genetik olarak çekilebilir memeliler arasında yer almaktadır. C. elegans'tastereotipik nöron sayısı (~300) ve sınırlı davranışsal repertoi gözlenir. Memelilerin ise milyonlarca nörona ve şaşırtıcı davranış sallabına sahiptir. Meyve sineğinin beyni, ~100.000'i ile, çoğu omurgalının beyninden önemli ölçüde daha küçük nöronlardır ve nöronların çoğu tek tek tanımlanabilir5. Ancak, Drosophila karmaşık davranışlarıgeniş bir yelpazede göstermek, sağlam bir bağdaştırıcı koku öğrenme ve hafıza oluşumu sergilemek için bir yetenek de dahil olmak üzere, ilk üzerinde açıklanan40yıl önce 6 . Bu klasik koşullandırma prosedürü sırasında, sinek grupları koşullu uyarıcı (CS+) olarak bir kokuya maruz kalırken, koşulsuz uyarıcı (ABD) olarak cezalandırıcı bir elektrik şoku alırlar. İkinci bir koku (CS-) sonra herhangi bir ceza olmadan sunulmaktadır. Bu nedenle, hayvanlar iki koku, CS+ ve CS arasında bir sonraki seçim durumunda test edilebilir ceza ile ilişkili koku önlemek için öğrenirler-. Drosophila bu davranışın altında yatan nöronal substrat diseksiyon çalışmaları mantar organları (MB) "engram"7,8,9,10 birincil site olarak belirlemiştir ve, bu nedenle, bu beyin bölgesinin devre ve bir bellek engram elde edilir ve saklanır mantığı ortaya çıkarmak için yoğun araştırma konusudur (son zamanlarda gözden11,12).
Drosophila MB oluşur ~ 2,000 içsel nöronlar (Kenyon hücreleri) yarımküre başına, paralel aksonal projeksiyonlar düzenlenen13. Koku projeksiyon nöronların aksonlar lateral protocerebra ve MB calyces, MB ana dendritik giriş sitesi ve anten lobları koku girişi almak uzatılır. Kenyon hücrelerinin uzun, paralel aksonlar demeti peduncle ve loblar oluşturmaktadır. Kenyon hücrelerinin çoğu, bir teminatı beynin orta çizgisine, dikey α/α'-lobları ise dorsal-anterior yönde ikinci kollateral projektifi genişleterek yatay β/β'-loblar oluşturur. Kenyon hücrelerinin diğer grup öğrenme süreci ve sonraki kısa süreli bellek oluşumu lokalize olabilir MB yatay γ-loblar13 oluşturur10. MB loblar afferent giriş almak ve efferent çıkış sağlamak, her ikisi de genellikle Kenyon hücre aksonları boyunca farklı bölümalt bölgeleri ile sınırlıdır14,15,16. Özellikle, afferent dopaminerjik MB giriş nöronların, örneğin, cezalandırıcı, uyarıcı koku öğrenme etkileri takviye değer tabanlı aracılık gösterilmiştir15,17. Mantar vücut loblarından stereotipik ve bireysel olarak tanımlanabilir efferent MB çıkış nöronlar Kenyon hücrelerinin çok sayıda arasında bilgi entegre, hedef çeşitli beyin alanları ve ayı davranış-öğretici iştah açıcı veya aversive bilgi15 . Bu nöronal mimari assosiyatif engram organizasyonu bir kavram yol açmıştır. Kokular nispeten hassas Kenyon hücrelerinin seyrek aktive topluluklar tarafından kodlanır. Bu Kenyon hücre topluluklarının tesadüfi aktivitesi ve dopamin salınımı - uyarıcıları cezalandırarak uyarılmış - Kenyon hücre presynapses mb çıkış nöronlar üzerine bulaşma modüle böylece hayvanlar daha sonra bu özel koku önlemek olacaktır10 ,12. Bu tam olarak tanımlanmış ve lokalize engramı, sinaptik aktivitedeki bu öğrenmeye bağımlı değişikliklerin nasıl belirlenip izlenebileceğini göstermek için paradigmatik bir olgu olarak kullanırız.
Bir model sistemi olarak Drosophila değeri güçlü bir tanımlamak için transgenler ifade sağlar eşsiz genetik araç kutusu dayanır, izleme, ve karmaşık devreler içinde tek nöronlar kontrol18. Nöronal aktivite izleme teknikleri gelişiyle - kalsiyum görüntüleme gibi, burada tartışılan - belirli bir uyarıcı yanıt olarak nöronal aktivite kalıplarının belirlenmesi için izin verdi. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (GECIs) spesifik Gal4 güdümlü ifadesini koku stimülasyonu ile birleştirerek, ilgi nöronların koku uyandıran kalsiyum dinamiklerini görselleştirebilirsiniz19. Bu protokolde, bu tekniği klasik koşullandırma paradigması ile daha fazla bağlayarak, bu koku alma yanıtlarını öğrenme bağlamında incelemenin mümkün olduğu gösterilmiştir. Öğrenme kaynaklı plastisite sadece tek bir spesifik nörona lokalize değil, aynı zamanda bir nöronun belirli alt bölümlerine gecis kullanılarak daha da kesilebilir. Pech ve ark.20 tam olarak bu izin araçları bir seçim kurdu. GCaMP321'i, omurgalı Synaptophysin veya dHomer'a bağlantı yoluyla, sırasıyla20-ön veya postsynapse'ye hedefleyerek, bu sitelerin diferansiyel modülasyonu ayırt edilebilir. Bu yerelleştirme, bu bağlamda, sitosol boyunca her yerde mevcut olan çoğu GECIs üzerinde bir avantaj confers - örneğin, GCaMP22, GCaMP321, veya GCaMP623 - bu önceden ve postsynaptic geçici olabilir anlamına gelir çünkü nöron aktivasyonu sonucu oluşan genel entegre kalsiyum akını ayırt. Bu, öğrenme ve hafıza oluşumuna neden olan veya bunun sonucu olarak ortaya çıkan plastisitenin konumu ve türleri hakkında ipuçları sağlayabilir. Örnek olarak, burada sağlanan protokol, kalsiyum sensörünün ekspresyonunu sadece postsynapse'ye doğru hedefleyerek koku alma sırasında MB çıkış nöronların modülasyonunu çözmede bu aracın değerini göstermektedir. İzleyerek, tek bir sinek içinde, koku kondisyon öncesi ve sonrası koku uyarılmış aktivite naif bir koku tepkisi ve öğrenilen bir koku tepkisi arasında doğrudan bir karşılaştırma çizilebilir. Aynı görüntüleme odasında sabit iken, sinekkokular bir seçim maruz kalır. Daha sonra, bu kokulardan birinin elektrik şokuyla eşleştirilmiş olduğu (CS+olma) ve başka bir kokunun takviye olmadan sunulduğu (CSolma - )bir önleyici bağdaştırıcı koşullandırma protokolü alırlar. Son olarak, sinekler yine ilk adımda olduğu gibi aynı kokulara maruz kalırlar. Kalsiyum dinamiği iki foton mikroskopi ile gözlenir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Octen-3-ol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>O5284</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Octanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>218405</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylcyclohexanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>153095</td>
			<td>Chemical used as odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear adhesive tape</td>
			<td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Standard claer adhesive tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave-convex jaws</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>10053-09</td>
			<td>Blade Holders with concave-convex jaws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>Forceps with tip 0.1 x 0.06mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td>
			<td>4665120</td>
			<td>1.20x40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kentoflow</td>
			<td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td>
			<td>953683</td>
			<td>Blue light-curing glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Used as diluent for odorants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2</td>
			<td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Tunable infrared femtosecond laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td>
			<td>421452-9900-000</td>
			<td>Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 20x/1.0 DIC M27 70mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stab knife</td>
			<td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td>
			<td>72-1551</td>
			<td>5.0mm Straight restricted blade depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0303</td>
			<td>Product No. 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel handle</td>
			<td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td>
			<td>0907</td>
			<td>Product No. 7S/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger 
			from the odor-delivery device and the electric shock 
			application device (power supply) to interact with the 
			ZEN software from Zeiss that controls the microscope.</td>
			<td>Custom-written and available upon request</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical calcium imaging of learning-induced synaptic plasticity in drosophila melanogaster

Birçok model organizmalarda onlarca yıllık araştırmalar, öğrenme ve hafıza oluşumunun altında yatan mevcut sinaptik plastisite kavramına yol açmıştır. Sinaptik iletim öğrenme kaynaklı değişiklikler genellikle birçok nöronlar ve beyinde işleme düzeyleri arasında dağıtılır. Bu nedenle, nöronlar arasında öğrenme bağımlı sinaptik plastisite görselleştirmek için yöntemler gereklidir. Meyve sinek Drosophila melanogaster öğrenme altında yatan nöronal devreleri incelemek için özellikle olumlu bir model organizma temsil eder. Burada sunulan protokol, ilişkiye giren koku hafızasının oluşumunun altında yatan süreçlerin, yani sinaptik aktivitenin ve bunların değişimlerinin in vivo olarak izlenebileceğini göstermektedir. Drosophilamevcut genetik araçların geniş bir yelpazede kullanarak , özellikle belirlenen hücre popülasyonları ve hatta tek hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade etmek mümkündür. Yerinde bir sinek sabitleme ve baş kapsülü açarak, koku uyaranları sunarken bu hücrelerde kalsiyum dinamikleri görselleştirmek mümkündür. Ayrıca, sineğin aynı anda vücuda elektrik şoklarına maruz kabileceği bir kurulum gösteriyoruz. Bu, sineklerin klasik koku alma kondisyonundan geçebildiği bir sistem sağlar - bu nedenle daha önce naif bir kokunun elektrik çarpması cezasıyla ilişkilendirildiği öğrenilir - aynı zamanda bu kokunun (ve diğer eğitimsiz kokuların) temsili olarak iki foton mikroskopisi ile beyinde gözlenir. Laboratuvarımız daha önce sinaptetik olarak lokalize kalsiyum sensörleri üretdiğini bildirmiştir, bu da floresan kalsiyum sinyallerini ön veya postsinaptik bölmelerle sınırlandırmanızı sağlar. İki fotonlu mikroskopi, ince yapıları mekansal olarak çözmenin bir yolunu sağlar. Bunu, böcek beyninin üst düzey bir merkezi olan mantar vücudundaki bilgileri birleştiren nöronlara odaklanarak örnek liyoruz. Genel olarak, bu protokol olan aktivite koku öğrenme sonucu modüle nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları incelemek için bir yöntem sağlar.

Yukarıdaki protokol ile elde edilen görüntülerin bir örneği Şekil 2'degörülebilir. d Homer-GCaMP3 olan dendritler MB γ-lob bölmesi 1 innervate bir MB çıkış nöron ifade edilir (nöron MVP2 denir28,29) ve genetik split-Gal4 hattı MB112C16kullanılarak hedeflenir . Ayrıca, gösterdi bir sitosolik ve post-synaptically lokalize kalsiyum indikatörü subsel...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster at JoVE.com

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Bu teknik, drosophila melanogaster öğrenme ve bellek oluşumu nun altında yatan hücresel süreçler için fizyolojik bir parametre olarak sinaptik kalsiyum aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemini kolaylaştırır. İlişkisel eğitimöncesi ve sonrası kokulara verilen nöronal tepkileri karşılaştırarak, sinaptik aktivite ile tek tek meyve sineklerinde hafıza izlerinin oluşumu arasında doğrudan korelasyonlar çizebiliriz. Hangi ilgi belirli nöronlar ifade transgenik meyve sinekleri üretmek için bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi çapraz kadın-bakire ve erkek istenilen GAL4 ve UAS yapıları taşıyan sinekler, ve yaş kadın soyundan kadar üç ila altı gün sonra eclosion.Görüntüleme için bir sinek hazırlamak için, özel hazırlanmış bir görüntüleme odasına bir buz anestezi sinek yerleştirmek için ince forseps kullanın. Toraks ve bacakları odanın altındaki elektrik telleriyle temas halinde ve başı düz bir şekilde konumlandırmak için bir kesme mikroskobu kullanmak. Net yapışkan bant ile yerinde sinek düzeltmek ve anten kapalı ve toraks sadece ön kısmı maruz bırakarak, baş ın etrafında bant bir pencere kesmek için bir cerrahi neşter bıçak kullanın.Dikkatle mavi ışık kür tutkal ile başın yanve arka çevreleyen içbükey-convex çeneler tarafından tutulan bir böcek pin kullanın. Ve tutkal ayarlamak için mavi ışık yayan LED lamba kullanın. Tutkal tamamen ayarlandığında, sinek kafasının sırt yüzeyinden sertleşmemiş tutkal artıklarını temizleyin ve başın açıkta kalan manikülünü bir damla Ringer çözeltisi ile kapatın.Çok ince bıçaklı bıçak bıçağı kullanarak, başın arka boyunca mitikül ile kesilmiş, ocelli başlayan ve kolayca forseps kullanılarak yırtılmış olabilir mite bir flep oluşturmak için gözlere her iki medial kesme. İlgi beyin bölgesini bloke edebilir herhangi bir aşırı mitikül çıkarın ve dikkatle herhangi bir trakea sırt yüzeyini temizlemek için ince çalgılar kullanmak, beyin dokusunun kendisi bozulmasını önlemek için özen. Doku enkaz alanını temizlemek için ringer çözeltisini gerektiği gibi çıkarın ve yenileyin.Ve bir hipodermik koku dağıtım iğnesi sinek başının yaklaşık bir santimetre yerleştirin, dikkat alarak anten için koku iletimi engelleyebilecek hiçbir şey yoktur. Daha sonra görüntüleme odasını hipodermik koku dağıtım iğnesi ile koku dağıtım sistemine bağlayın. Ve sineğin anestezi ve ameliyattan kurtulması için 10 dakika bekleyin.GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için, kızılötesi lazer ile donatılmış çok foton mikroskobun lazerini ve titreşim izole bir tabloya 920 nanometre uyarma dalga boyuna yerleştirilen bir su daldırma amacını ayarlayın ve gfp bandpass filtresi kurun. Z ayar buzlesini kullanarak beynin Z ekseninden geçerek ilgi çekici beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca ilgi alanına odaklamak için kırpma işlevini kullanın.Ve kafanın ön aşağı bakacak şekilde tcan görünümünü döndürün. Ardından kare boyutunu 512'ye 512 piksel olarak ayarlayın ve taranacak bölgeyi seçin. En az dört hertz bir kare oranı elde etmek için, her kare için hesaplanan taramayı süresi dikkate alınarak.Koku uyandıran kalsiyum geçici görselleştirme için, görüntü edinme yazılımı ve koku dağıtım programı bağlama yeteneğine sahip önceden programlanmış bir makro paket başlatın ve bir F0 temel değeri oluşturmak için 6,25 saniye mikroskop yazılımı ölçüm başlar. Koku dağıtım sisteminde, belirli koku kabı vanalarının açılıp kapanması yla tetiklenen LED'lerin aydınlatılarak burada belirtilen 2,5 saniyelik koku uyarıcısını teslim edin. Ardından koku ofset sonunda kayıt 12,5 saniye.Daha sonra aynı şekilde ikinci ve üçüncü bir odorant için teslimat tekrarlayın. Bu kurulumda bağkurlu klimayı gerçekleştirmek için, 12 90 volt elektrik şoku ile birlikte 60 saniye boyunca şartlı uyarıcı artı-koku sunmak için bilgisayar kontrollü koku dağıtım sistemini kullanın. 60 saniyelik bir aradan sonra, elektrik çarpması olmadan 60 saniye boyunca tek başına şartlı uyarıcı-eksi-koku mevcut.Eğitim sonrası kokuyu, eğitim aşamasını tamamladıktan üç dakika sonra eğitim öncesi koku stimülasyon protokolünü tekrarlayarak tekrar kalsiyum transansyonu uygulayın. Ardından görüntüleme dosyalarını daha sonraki görüntü çözümlemesi için uygun bir biçimde kaydedin. Burada temsili mantar vücut çıkışı nöron görüntüleri, gösterildiği gibi elde edilen görülebilir.Nöronun aksonal bölmelerinde ifade edilmeyen dHomer-GCaMP3 sensörünün özel bölümsel ekspresyonu dendritik bölmede noktalama işareti gösterir. Daha düşük genlik koku yanıtları dHomer-GCaMp3 ifade sineklerde görülebilir rağmen açık, sitosolik GCaMP6f ifade sinekler ile karşılaştırıldığında. Burada, tek bir sineğin temsili kalsiyum izleri, bireysel preparatlar arasında elde edilebilen gürültü seviyesi ve genlikte farklılıklar göstermektedir.Bu teknik, alt hücresel düzeyde görselleştirme imkanını, koku gösterimlerinin nasıl modüle edildir ve bellek aşamalarının klima ile nasıl oluştuğunu açmıştır. Bu tür deneyler mantar gövdesi gibi karmaşık beyin yapıları anlayışımızı genişletmek için hayati önem taşımaktadır, ve nasıl bağşılı anılar nöronların dağıtılmış popülasyonları arasında depolanır karakterize etmek.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole kaynaklı çıra fare modeli

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

Sinaptik Plastisite ile Dendritik Dikenlerin 3D Modellemesi

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...