Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Le Dr Cruz-Orengo a reçu le soutien de l'Université de Californie, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Toutes les procédures de la présente étude sont conformes aux lignes directrices fixées par l'Université de Californie (UC), le Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les soins aux animaux de l'UC Davis sont réglementés par plusieurs ressources indépendantes et sont entièrement accrédités par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) depuis 1966. Les tissus porcins du SNC ont été obtenus auprès du Département des sciences animales de...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. 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R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

Le BBB comprend les propriétés uniques des cellules endothéliales microvasculature du cerveau couplées par une architecture sophistiquée de serré, adherens-, "peg-socket"- jonctions, et plaques d'adhérence critique pour l'homéostasie du SNC2,3,19. Les propriétés des cellules endothéliales sont induites et maintenues par les péritéytes et les processus d'astroglia environnants2,<sup...

Notre cerveau est l'organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l'homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d'années1, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd'hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l'homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécules et des cellules entre le sang et le parenchyme du SNC. Lorsque le BBB est perturbé, le cerveau devient sensible à l'exposition toxique, l'infection et l'inflammation. Par conséquent, le dysfonctionnement de BBB est associé à beaucoup, sinon tous, désordres neurologiques et neurodevelopmental4,5,6.
La fonction sophistiquée du BBB est attribuée à la microvasculature unique du SNC conforme par l'unité neurovasculaire (NVU)2,3. Les cellules endothéliales hautement spécialisées, les péricytes et les pieds d'extrémité astrocytiques sont les composants cellulaires du NVU2,3. La matrice extracellulaire générée par ces cellules est également essentielle à la physiologie NVU et BBB2,3. Bien que les composants cellulaires et moléculaires essentiels de la NVU soient conservés chez les vertébrés, l'hétérogénéité est signalée chez les ordres et les espèces7,8. Cependant, les limitations techniques entravent notre capacité à considérer pleinement ces différences dans la neurobiologie, la recherche biomédicale ou translationnelle.
Pour cette raison, nous avons élargi une méthode d'isolement micronavire spécifique à la région du SNC pour la rendre applicable à de nombreuses espèces des cinq groupes de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères. Le protocole est décrit pour une utilisation sur les vertébrés de petite-lissencéphale et de grande gyrencéphalie, y compris les espèces avec la pertinence translationnelle9. En outre, nous incluons d'autres régions du SNC non étudiées auparavant dans ce contexte, mais pertinentes à la neurophysiologie et avec des implications cliniques énormes : l'hypothalamus, l'hypotuitaire et la matière blanche. Enfin, nous avons testé la capacité de cette méthode d'isolement comme un outil fiable pour identifier les changements dans l'expression des protéines le long de la NVU et / ou BBB9,10,11. Comme preuve de concept, nous avons montré comment déterminer les changements dans l'expression VCAM-1 et JAM-B pendant EAE utilisant la méthode d'isolement suivie de l'immunofluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

L'isolement des microvaisseaux du système nerveux central (SNC) est généralement effectué en combinant le tissu cortical de plusieurs animaux, le plus souvent des rongeurs. Cette approche limite l'interrogation des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BBB) au cortex et ne permet pas de comparaison individuelle. Ce projet se concentre sur le développement d'une méthode d'isolement qui permet la comparaison de l'unité neurovasculaire (NVU) à partir de plusieurs régions du SNC : cortex, cervelet, lobe optique, hypothalamus, pituitaire, tronc cérébral et moelle épinière. En outre, ce protocole, initialement développé pour les échantillons de murine, a été adapté avec succès pour une utilisation sur les tissus du SNC à partir de petites et grandes espèces de vertébrés à partir de laquelle nous sommes également en mesure d'isoler les micronavires de la matière blanche de l'hémisphère cérébral. Cette méthode, lorsqu'elle est jumelée à l'immunolabeling, permet la quantitation de l'expression des protéines et la comparaison statistique entre les individus, le type de tissu ou le traitement. Nous avons prouvé cette applicabilité en évaluant des changements dans l'expression de protéine pendant l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle murine d'une maladie neuroinflammatoire, sclérose en plaques. En outre, les micronavires isolés par cette méthode pourraient être utilisés pour des applications en aval comme qPCR, RNA-seq, et Western blot, entre autres. Même s'il ne s'agit pas de la première tentative d'isoler les micronavires du SNC sans l'utilisation d'ultracentrifugation ou de dissociation enzymatique, il est unique dans son aptitude à la comparaison des individus isolés et de plusieurs régions du SNC. Par conséquent, il permet d'enquêter sur une gamme de différences qui pourraient autrement rester obscures : parties du SNC (cortex, cervelet, lobe optique, tronc cérébral, hypothalamus, pituitaire et moelle épinière), type tissu du SNC (matière grise ou blanche), individus, groupes de traitement expérimental et des espèces.

Les microvessels isolés du SNC murine ont montré tous les composants cellulaires intrinsèques de l'unité neurovasculaire2,3. Utilisation de la molécule d'adhérence des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM, également connue sous le nom de CD31) ou de l'isolectin IB4 (une glycoprotéine qui lie la cellule endothéliale glycocalyx) pour les cellules endothéliales, Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PD...

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Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Le but de ce protocole est d'isoler les micronavires de plusieurs régions du système nerveux central des vertébrés lissencephalic et gyrencephalic.

Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet la comparaison de la microvasculature entre différentes régions du système nerveux central, ainsi qu’entre différents individus. Cette technique d’isolation des microvétiles peut être complétée en une seule journée, et elle élimine le besoin d’ultracentrifugation et de dissociation enzymatique. Enlever les méninges et le plexus choroïde peut être difficile.Assurez-vous de travailler lentement et soigneusement pour assurer l’ablation complète de chaque tissu. Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un petit spécimen de vertébrés lissencéphales, placez le cerveau récolté dans un tube conique de 15 millilitres contenant la solution MV-1 sur la glace, et utilisez des forceps pour récupérer l’hypophyse de la sella turcica du crâne. Placez l’hypophyse dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre de solution MV-1 sur la glace, et retirez la peau et le muscle pour exposer la colonne vertébrale.Après avoir enlevé les membres, la cage thoracique et les organes internes, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour rincer la colonne vertébrale avec une solution MV-1 fraîche, dans une direction caudale à rostrale dans tout le contre-courant vertébral lombaire. Placez ensuite la moelle épinière dans un tube de 5 millilitres contenant une solution MV-1 fraîche. Ensuite, placez le cerveau dans une boîte de Pétri sous le microscope disséquant, et retirez les méninges avec la piqûre à double proue.Assurez-vous de vérifier la moelle épinière pour vous assurer qu’il ne reste plus de méninges. Utilisez les forceps pour séparer l’hypothalamus, le cervelet, le tronc cérébral et le cortex. Si nécessaire, utilisez des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour exciser les bulbes olfactifs et le thalamus, et utilisez la piqûre à double proue pour enlever tout le plexus choroïde de tous les ventricules du cerveau.Pour la dissection tissulaire du SNC à partir d’un grand spécimen de vertébrés gyrencéphales, utilisez un microscope disséqué et une piqûre à double proue, des forceps et des ciseaux d’iris et de ressort pour enlever les méninges de chaque tissu du SNC, en prenant soin d’enlever tout plexus choroïde des ventricules cérébraux. Pour l’homogénéisation des tissus du SNC récoltés, hacher chaque région du SNC en morceaux d’un à deux millimètres dans des boîtes de Pétri individuelles. Pour homogénéiser les tissus du SNC à partir de petits spécimens de vertébrés, utilisez une pipette de transfert pour ajouter un millilitre de solution MV-1 pour suspendre le tissu haché.Utilisez ensuite la même pipette de transfert pour distribuer le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les morceaux de moelle épinière en broyeurs individuels de tissu de verre de 10 millilitres, et utilisez un pilon PTFE et cinq millilitres de solution MV-1 pour moudre chaque ensemble de tissus pendant environ 10 coups. Transférez chaque boue tissulaire dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres sur la glace, et utilisez des forceps pour placer l’hypothalamus et l’hypophyse dans 100 microlitres de solution MV-1, dans des tubes individuels de 1,7 millilitre. Ensuite, homogénéisez soigneusement chaque tissu à l’aide d’un micropestre en verre.Pour homogénéiser un grand spécimen de vertébrés, utilisez une pipette de transfert coupée biseauté pour transférer le tissu haché dans un broyeur de tissu en verre de 55 millilitres et fixez le broyeur à un agitateur aérien. Ajouter la moitié du volume recommandé de solution MV-1 en fonction de l’homogénéisation de la partie spécifique du SNC indiquée dans le tableau et activer l’agitateur supérieur à environ 150 rotations par minute. Déplacez soigneusement le tube de verre de haut en bas pendant environ 30 secondes avant d’éteindre l’agitateur supérieur pour ajouter plus de solution MV-1 pour une homogénéisation supplémentaire, jusqu’à ce qu’une boue homogène soit obtenue.Transférer ensuite le tissu homogénéisé dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour la purification des microvessels, granulez les tissus du SNC homogénéise par centrifugation et jetez les supernatants. Pour un petit spécimen vertébré isolé par microvessel, pipette le cortex, le cervelet, le tronc cérébral, le lobe optique et les granulés de moelle épinière, en cinq millilitres de solution MV-2 fraîche et glacée par échantillon, environ 10 fois, avant d’ajouter cinq millilitres de solution MV-2 glacée à chaque tube.Retourner soigneusement les tubes pour mélanger, et re-suspendre l’hypothalamus et les granulés pituitaires dans un millilitre de solution MV-2. Pour l’isolement des microvérules de gros spécimens vertébrés, ajouter 20 millilitres de solution MV-2 glacée au cortex, au cervelet, au tronc cérébral et aux granulés de microvéssel de la moelle épinière, et suspendre à nouveau les granulés dans un revolver à tube à 40 rotations par minute pendant environ 5 minutes. À la fin de la suspension, séparez les lycates de tissu cns par centrifugation, et faites pivoter lentement chaque tube pour permettre au surnatant de passer le long du mur pour détacher soigneusement la couche épaisse et dense de myéline sur l’interface liquide des parois du tube.Jetez les interfaces myéline et liquide, et épongez la paroi intérieure de chaque tube à l’aide d’une spatule enveloppée d’un lingette en papier à faible peluche. Ensuite, utilisez un lingette en papier à faible peluche tordue pour absorber l’excès de liquide, et utilisez des pointes à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de solution MV-3. Pour l’élitution et la filtration des microvéraux, mélanger quelques millilitres de solution MV-3 fraîche à chaque boue de microvessel tissu CNS, et tout en mélangeant pour éviter les agrégats, filtrer chaque suspension à travers une passoire Pruitt en tubes coniques individuels de 50 millilitres.Placez un filtre net en nylon de 20 micromètres sur un support de filtre modifié par région CNS. Transférez le porte-filtre sur un tube conique de 50 millilitres et mouillez le filtre avec cinq millilitres de solution MV-3 glacée, en vous assurant que le tampon verse le porte-filtre dans le tube conique. Transférez les microvéssels épuutés sur chaque filtre net en nylon de 20 micromètres et rincez les microvéssels avec cinq à 10 millilitres de solution MV-3 glacée.Utilisez des forceps pour transférer chaque filtre dans des beakers individuels contenant la solution MV-3 glacée, et secouez doucement chaque filtre pendant environ 30 secondes pour détacher les microvéssels. Après le transfert à un tube conique de 15 millilitres, recueillir les microvérules par centrifugation, et utiliser une pipette à faible liaison pour suspendre à nouveau chaque granulé dans un millilitre de glace MV-3 solution. Ensuite, transférez les suspensions de microvérules de petits spécimens vertébrés dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre pour centrifugation pendant cinq minutes à 20 000 fois G, en quatre degrés Celsius.Pour les gros spécimens de vertébrés, transférer la suspension dans des tubes de centrifugeuse individuels de cinq millilitres, et ajouter quatre millilitres de solution MV-3 pour centrifugation pendant cinq minutes à 2000 fois G en quatre degrés Celsius. Les composants intrinsèques de l’unité neurovasculaire peuvent être détectés dans les microvétalliques, isolés comme démontré, par immunolabeling pour CD31, PDGFR-bêta, et aquaporin quatre, y compris les microvétalliques corticales, cerebellar, pituitaires, hypothalamiques, tige de cerveau, et microvétules spinales. De même, l’expression de la protéine VE-cadherin de jonction des adhérents, des protéines de jonction serréeS CLDN5 et Zonula Occludens-1, de l’anguline-1 tricellulaire de protéine de jonction, et des marques basales chemokine ligand CXCL motif 12, et gamma-glutamyltransferase-1, peut être visualisée.En outre, la majorité des microvételles sont dépourvues de l’expression de l’actine musculaire alpha lisse, ce qui indique que ce protocole d’isolement cible sélectivement les microvssels de petit calibre. Les microvérètes obtenues auprès d’autres petits vertébrés lissencéphales, comme les oiseaux, les menteurs, les grenouilles et les poissons, partagent certaines caractéristiques morphologiques, ce qui suggère que cette méthode est utile pour caractériser davantage les différences dans les unités neurovasculaires entre les espèces. La quantification des changements dans l’expression de protéine indique une augmentation de la molécule d’adhérence vasculaire de cellules un, et de la molécule jonctionnelle d’adhérence B le long des microvessels de moelle épinière, pendant le pic de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale.Cependant, la molécule vasculaire d’adhérence de cellules on est également sensiblement augmentée dans les microvessels pituitaires, et diminuée dans les microvessels d’hypothalamus et de tronc cérébral. En outre, des changements sont observés dans la molécule d’adhérence vasculaire de cellules une expression pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale chronique dans tous les tissus de CNS, et dans l’expression jonctionnelle de molécule d’adhérence B dans l’hypothalamus et les microvessels pituitaires. Des analyses quantitatives, telles que la tache occidentale, le PCR et l’immunohistochimie, peuvent être exécutées suivant cette procédure pour révéler des aperçus des modèles d’expression de gène et de protéine dans la barrière de sang-cerveau.Le paraformaldéhyde est un réaccène extrêmement toxique, et doit toujours être manipulé sous le capot de fumée tout en portant le PPE approprié.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Drug Delivery systémique et locale pour traiter les maladies du système nerveux central dans les modèles rongeurs

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Recherche

Neurosciences

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Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

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Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

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Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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