Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
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クルーズ・オレンゴ博士は、カリフォルニア大学デービス獣医学部スタートアップファンドの支援を受けました。

本研究のすべての手順は、カリフォルニア大学(UC)、デイビス制度動物ケア・使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従っています。UCデイビスの動物ケアは、いくつかの独立したリソースによって規制されており、1966年以来、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定のための協会によって完全に認定されています。豚CNS組織は、食肉科学研究所動物科学UCD学科から得られま...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li><li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier.">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).</li><li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+barriers:+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms.">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes &amp; Development. 32, 466-478 (2018).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity.">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li><li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSR/angulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation.">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility.">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li><li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

BBBは、緊密な、付着物、"ペグソケット"-接合、およびCNS恒常性2、3、19に不可欠な接着プラークの洗練されたアーキテクチャによって結合された脳微小血管系内皮細胞のユニークな特性を含む。内皮細胞特性は、ペリサイトおよび周囲のアストログリア末脚注プロセス2、3、19...

私たちの脳は、私たちの体の中で最も重要な器官です。このため、正常からの逸脱を引き起こす可能性のある外的要因にもかかわらず、脳恒常性を維持することが優先事項である。一部の学者によると、約4億〜5億年前の1、脊椎動物は、私たちが今血液脳関門(BBB)2、3として知っているものを開発しました。この保護「フェンス」は、血液とCNSパレンチマ間のイオン、分子、細胞の輸送を厳密に調節することにより、中枢神経系(CNS)恒常性および機能に最も大きな影響を及ぼします。BBBが破壊されると、脳は毒性暴露、感染、炎症を受けやすくなります。したがって、BBB機能障害は、すべてではないにしても、神経学的および神経発達障害4、5、6に関連している。
BBBの高度な機能は、神経血管ユニット(NVU)2、3によって適合されたユニークなCNS微小血管系に起因する。高度に専門化された内皮細胞、ペリサイト、および星値状端足は、NVU2、3の細胞成分である。これらの細胞によって生成される細胞外マトリックスは、NVUおよびBBB生理学2、3にも不可欠である。NVUの必須細胞成分および分子成分は脊椎動物の間で保存されるが、異質性は、秩序および種7、8の間で報告される。しかし、技術的な制限は、神経生物学、生物医学、または翻訳研究におけるこれらの違いを十分に考慮する能力を妨げる。
このため、CNS領域特異的なマイクロ血管分離法を拡充し、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類の5つの脊椎動物群から多数の種に適用できるようにしました。このプロトコルは、小リッセンセファリックおよび大ギレンセファリック脊椎動物に使用するために記載されており、翻訳関連性9を有する種を含む。さらに、我々は、この文脈内で以前に調査されていないCNSの他の領域が含まれていますが、神経生理学に関連し、驚異的な臨床的意味を持つ:視床下部、下垂体、および白色物質。最後に、NVUおよび/またはBBB9、10、11に沿ったタンパク質発現の変化を同定するための信頼できるツールとして、この単離方法の容量を試験した。概念実証として、EAE中のVCAM-1およびJAM-B発現の変化を、免疫蛍光に続いて単離法を用いて決定する方法を示した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

中枢神経系(CNS)からの微小血管の単離は、一般的に、複数の動物、最も頻繁にげっ歯類からの皮質組織を組み合わせることによって行われる。このアプローチは、血液脳関門(BBB)特性の尋問を皮質に制限し、個々の比較を可能にしません。このプロジェクトは、皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、脊髄など、複数のCNS領域からの神経血管ユニット(NVU)の比較を可能にする単離方法の開発に焦点を当てています。さらに、もともとマウスサンプル用に開発されたこのプロトコルは、脳半球白物から微小血管を分離することができる小さな大きな脊椎動物種のCNS組織での使用に適応することに成功しました。この方法は、免疫標識と組み合わせると、タンパク質発現の定量と個体、組織型、または治療間の統計的比較を可能にする。神経炎症性疾患、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)におけるタンパク質発現の変化を評価することで、この応用性を証明した。さらに、この方法で隔離されたマイクロ容器は、qPCR、RNA-seq、ウェスタンブロットなどの下流アプリケーションに使用できます。これは、超遠心分離または酵素解離を使用せずにCNSマイクロ容器を分離する最初の試みではありませんが、単一の個人と複数のCNS領域の比較に対するその熟達性においてユニークです。したがって、CNS部分(皮質、小脳、視葉、脳幹、視床下部、下垂体、脊髄)、CNS組織型(灰色または白色物質)、個体、実験的治療群、および種。

マウスCNSから単離された微小血管は、神経血管ユニット2、3のすべての固有の細胞成分を示した。血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM、CD31とも呼ばれる)またはアイソレクチンIB4(内皮細胞グリコカリックスと結合する糖タンパク質)のいずれかを内皮細胞に使用し、 血小板由来増殖因子β(PDGFRβ)またはニューロングリア抗原2(NG2)は...

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Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

このプロトコルは、異なる中枢神経系領域間、ならびに異なる個体間の微小血管系の比較を可能にするため、重要である。このマイクロ容器の分離技術は1日で完了することができ、超遠心分離および酵素解離の必要性を排除する。髄膜および脈絡膜叢を除去することは困難であり得る。各組織の完全な除去を確実にするためにゆっくりと慎重に動作するようにしてください。小さなリセンサイル脊椎動物標本からのCNS組織解剖の場合、採取した脳を氷上のMV-1溶液を含む15ミリリットルの円錐管に入れ、鉗子を使用して頭蓋骨のセラ・ターシカから下垂体を取り出す。下垂体をMV-1溶液の1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管に氷の上に置き、皮膚と筋肉を取り除いて椎骨柱を露出させる。手足、胸部および内臓を取り除いた後、18ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、椎骨柱を新鮮なMV-1溶液で洗い流し、腰椎骨の前部を通して尾骨からrostral方向に洗い流す。次に、新鮮なMV-1溶液を含む5ミリリットルのチューブに脊髄を入れる。次に、脳を解剖顕微鏡の下のペトリ皿に入れ、二重突起のプリックで髄を取り除きます。髄の破片が残っていないかどうかを確認するために、脊髄を確認してください。視床下部、小脳、脳幹、皮質を分離するために鉗子を使用してください。必要に応じて、鉗子と虹彩とバネはさみを使用して嗅球や視床を切除し、二重突っ張りのプリックを使用してすべての脳室から脈絡叢のすべてを取り除きます。大きな変頭筋脊椎動物標本からのCNS組織解剖には、解剖顕微鏡と二重突起プリック、鉗子、虹彩、スプリングハサミを使用して各CNS組織から髄膜を取り除き、脳室から脈絡叢の断片を取り除くように注意してください。収穫されたCNS組織の均質化のために、各CNS領域を個々のペトリ皿内の1〜2ミリメートルの部分にミンチする。小さな脊椎動物の標本からCNS組織を均質化するには、トランスファーピペットを使用して、1ミリリットルのMV-1溶液を添加して、ひき肉組織を懸濁させる。その後、同じトランスファーピペットを使用して、皮質、小脳、脳幹、眼用ローブ、脊髄片を個々の10ミリリットルガラス組織グラインダーに分配し、PTFE害虫と5ミリリットルのMV-1溶液を使用して各組織を約10ストローク粉砕します。各組織スラリーを氷上の個々の15ミリリットルの円錐管に移し、鉗子を使用して視床下部と下垂体を100マイクロリットルのMV-1溶液に入れ、個々の1.7ミリリットルのチューブに入れる。次に、各組織をガラスマイクロペステスルで慎重に均質化する。大きな脊椎動物の標本を均質化するには、斜め切り移管ピペットを使用して、55ミリリットルのガラス組織グラインダーに切り身組織を移し、グラインダーをオーバーヘッドスターラーに取り付けます。表に示すように均質化されている特定のCNS部分に従ってMV-1溶液の推奨量の半分を追加し、オーバーヘッドスターラーを毎分約150回転にします。ガラス管を慎重に上下に約30秒間動かしてから、オーバーヘッドスターラーをオフにして、均質化のためにMV-1溶液を追加し、均質なスラリーが得られるまで追加します。次に、均質化した組織を氷上の50ミリリットルの円錐管に移す。マイクロ容器精製のために、ペレットは、遠心分離によってCNS組織を均質化し、上清を廃棄する。小さな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、ピペット皮質、小脳、脳幹、光学ローブおよび脊髄コードペレットは、サンプル当たり新鮮な氷冷MV-2溶液の5ミリリットルで、約10回、各チューブにさらに5ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加える。慎重に混合するためにチューブを反転し、MV-2溶液の1ミリリットルで視床下部および下垂体ペレットを再中断します。大きな脊椎動物標本のマイクロ血管分離のために、皮質、小脳、脳幹および脊髄のマイクロ容器のペレットに20ミリリットルの氷冷MV-2溶液を加え、約5分間毎分40回転でチューブリボルバーのペレットを再中断する。再懸濁の終わりには、CNS組織のリカチを遠心分離で分離し、各チューブをゆっくりと回転させて上澄みを壁に沿って通過させ、液体界面の厚くて緻密なミエリン層をチューブ壁から慎重に取り外します。ミエリンと液体のインターフェースを捨て、低糸状紙のワイプで包まれたヘラで各チューブの内側の壁をしみまきます。次に、ねじった低糸状紙ワイプを使用して余分な液体を吸収し、低結合チップを使用して各ペレットを1ミリリットルのMV-3溶液中で再懸濁させます。マイクロ容器溶出およびろ過の場合、新鮮なMV-3溶液を各CNS組織マイクロ容器スラリーに数ミリリットル混合し、凝集体を避けるために混合しながら、プルイットストレーナーを通して各懸濁液を個々の50ミリリットル円錐形チューブにひずむ。CNS領域ごとに1つの変更されたフィルターホルダーに1つの20マイクロメートルナイロンネットフィルターを置きます。フィルターホルダーを50ミリリットルの円錐状チューブに移し、5ミリリットルの氷冷MV-3溶液でフィルターを濡らし、バッファーがフィルターホルダーを下に注ぎ、円錐形のチューブに入れます。溶出したマイクロ容器を各20マイクロメートルのナイロンネットフィルターに移し、5~10ミリリットルの氷冷MV-3溶液でマイクロ容器をすすきます。鉗子を使用して、各フィルターを氷冷MV-3溶液を含む個々のビーカーに移し、各フィルターを約30秒間静かに振ってマイクロ容器を取り外します。15ミリリットル円錐形チューブに移管した後、遠心分離によってマイクロ容器を回収し、低結合ピペットを使用して、1ミリリットルの氷冷MV-3溶液中の各ペレットを再懸濁させます。次いで、小さな脊椎動物の標本からマイクロ容器の懸濁液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、20,000倍Gで5分間、摂氏4度で遠心分離を行う。大型脊椎動物標本の場合は、懸濁液を個々の5ミリリットル遠心管に移し、4度で2,000倍Gで5分間遠心分離するためのMV-3溶液を4ミリリットル加えます。神経血管ユニットの固有成分は、示されているように、CD31、PDGFR-β、および皮質、小脳、下垂体、視床下部、脳幹、および脊髄マイクロ血管を含む4つのアクアポリンの免疫標識によって、示されるように単離されたマイクロ血管内で検出することができる。同様に、被着体結合タンパク質VE-カドヘリンの発現は、CLDN5及びゾヌラ・オクルデンス−1の緊密な接合タンパク質、三細胞結合タンパク質アングリン-1、及び基底マル・ケモカイン・リガンドCXCLモチーフ12、およびガンマグルタミルトランスビ転移酵素-1の発現を可視化することができる。さらに、マイクロ血管の大部分はアルファ平滑筋アクチンの発現を欠いており、この分離プロトコルが選択的に小口径マイクロ血管を標的とすることを示している。鳥、うそつき、カエル、魚などの他の小さなリセンサイル脊椎動物から得られたマイクロ血管は、いくつかの形態学的特徴を共有し、この方法は、種間の神経血管単位の違いのさらなる特徴付けに有用であることを示唆している。タンパク質発現の変化を定量化すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎のピーク時に、脊髄マイクロ血管に沿った血管細胞接着分子1および結合接着分子Bの増加が明らかになる。しかしながら、血管細胞接着分子1は下垂体の微細血管においても有意に増加し、視床下部および脳幹マイクロ血管において減少した。また、全てのCNS組織において慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎の際に血管細胞接着分子1発現、視床下部および下垂体マイクロ血管におけるB発現の接合接着分子に変化が見られる。ウェスタンブロット、PCR、免疫体化学などの定量分析を行い、この手順に従って血液脳関門内の遺伝子およびタンパク質発現パターンに関する洞察を明らかにすることができます。パラホルムアルデヒドは、急性毒性試薬であり、適切なPPEを身に着けている間、常に煙のフードの下で処理する必要があります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...