Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
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크루즈 오렌고 박사는 캘리포니아 대학, 데이비스, 수의학 창업 기금의 학교에 의해 지원되었다.

본 연구의 모든 절차는 캘리포니아 대학 (UC), 데이비스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정 된 지침에 따라. UC 데이비스의 동물 보호는 여러 독립적 인 자원에 의해 규제되며 1966 년부터 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증되었습니다. 돼지 CNS 조직은 동물 과학의 UCD 학과에서 얻은, 육류 과학 연구소. rhesus 원숭이에서 CNS 조직은 캘리포니아 국립 영?...

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	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. 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R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

BBB는 CNS 항상성에 중요한 단단한, 부착-, "페그 소켓"- 접합부 및 CNS 항상성에 중요한 접착 플라크의 정교한 아키텍처에 의해 결합된 뇌 미세 혈관 내피 세포의 독특한특성을포함한다2,3,19. 내피 세포 특성은 주위 세포및 주변 아스트로글리아 말발 공정2,3,19에</su...

우리의 뇌는 우리 몸에서 가장 중요한 기관입니다. 이러한 이유로, 정상에서 편차를 일으킬 수 있는 외부 요인에도 불구 하 고 뇌 항상성을 유지 하는 것이 우선 순위. 일부 학자에 따르면, 약 400-5억 년 전1,척추 동물은 우리가 지금 혈액 뇌 장벽으로 알고 개발 (BBB)2,3. 이 보호 "울타리"는 혈액과 CNS 자렌 치마 사이의 이온, 분자 및 세포의 수송을 엄격하게 조절하여 중추 신경계 (CNS) 항상성 및 기능에 가장 큰 영향을 미칩니다. BBB가 중단되면 뇌는 독성 노출, 감염 및 염증에 취약해집니다. 따라서, BBB 기능 장애는 많은 연관, 전부는 아니지만, 신경 및 신경 발달 장애4,5,6.
BBB의 정교한 기능은 신경 혈관 단위 (NVU)2,3에의해 부합하는 독특한 CNS 미세 혈관 구조에 기인한다. 고도로 전문화된 내피 세포, 회구 및 성상 세포 끝피트는 NVU2,3의세포 성분이다. 이들 세포에 의해 생성된 세포외 기matrix는 또한 NVU 및 BBB 생리학2,3에필수적이다. NVU의 필수 세포 및 분자 성분이 척추동물 사이에서 보존되지만, 이질성은 주문 및 종7,8사이에서 보고된다. 그러나, 기술적 한계는 신경 생물학, 생물 의학, 또는 번역 연구에 있는 이 다름을 완전히 고려하는 우리의 기능을 방해합니다.
이 때문에, 우리는 물고기, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류 : 우리는 모든 다섯 척추 동물 그룹에서 수많은 종에 적용 할 수 있도록 CNS 지역 별 마이크로 혈관 격리 방법을 확장했다. 이 프로토콜은 번역 관련성이 있는 종을 포함하는 작은 계수뇌증 및 큰 자뇌척추동물에 사용하기 위해 기술된다9. 추가적으로, 우리는 이 문맥 내의 전에 조사되지 않은 CNS의 그밖 지구를 포함합니다, 그러나 신경 생리학및 엄청난 임상 연루와 관련있는: 시상 하부, 뇌하수체 및 백색 물질. 마지막으로, 우리는 NVU 및 / 또는 BBB9,10,11을따라 단백질 발현의 변화를 식별하는 신뢰할 수있는 도구로이 격리 방법의 용량을 테스트했습니다. 개념 증명으로서, 우리는 면역형광에 이어 격리 방법을 사용하여 EAE 동안 VCAM-1 및 JAM-B 발현의 변화를 결정하는 방법을 보여주었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

중추 신경계 (CNS)에서 미세 혈관의 분리는 일반적으로 여러 동물, 가장 자주 설치류에서 피질 조직을 결합하여 수행됩니다. 이 접근은 피질에 혈액 두뇌 방벽 (BBB) 속성의 심문을 제한하고 개별적인 비교를 허용하지 않습니다. 이 프로젝트는 여러 CNS 영역에서 신경 혈관 단위 (NVU)의 비교를 허용하는 격리 방법의 개발에 초점을 맞추고: 피질, 소뇌, 광학 엽, 시상 하부, 뇌하수체, 뇌간, 및 척수. 더욱이, 원래 뮤린 견본을 위해 개발된 이 프로토콜은, 우리가 또한 두뇌 반구 백색 물질에서 microvessels를 격리할 수 있는 작고 큰 척추동물 종에서 CNS 조직에 사용을 위해 성공적으로 적응되었습니다. 이 방법은, 면역 표지와 결합될 때, 개별, 조직 모형, 또는 처리 사이 단백질 발현 그리고 통계적인 비교의 정량화를 허용합니다. 우리는 신경염증성 질환, 다발성 경화증의 뮤린 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안 단백질 발현의 변화를 평가함으로써 이러한 적용성을 입증했습니다. 또한, 이 방법으로 분리된 마이크로혈관은 qPCR, RNA-seq 및 웨스턴 블롯과 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 이것은 초원심분리 또는 효소 해리를 사용하지 않고 CNS 마이크로 혈관을 분리하려는 첫 번째 시도가 아니지만 단일 개인 및 다중 CNS 영역의 비교에 대한 숙련도가 독특합니다. 따라서, 그것은 그렇지 않으면 모호한 남아있을 수있는 차이의 범위의 조사를 허용: CNS 부분 (피질, 소뇌, 광학 엽, 뇌간, 시상 하부, 뇌하수체, 척수), CNS 조직 유형 (회색 또는 백색 물질), 개인, 실험 치료 그룹, 및 종.

뮤린 CNS로부터 분리된 미세혈관은 신경혈관 단위2,3의모든 내재세포 성분을 보였다. 내피 세포에 대한 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM, CD31이라고도 함) 또는 isolectin IB4 (내피 세포 글리코칼릭스를 결합하는 당단백질)를 사용하여, 혈소판 유래 성장 인자 β(PDGFRβ) 또는 신경-신경교 항원 2(NG2)는 성상 세포종말피트를 위한 구혈...

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Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

이 프로토콜은 다른 중추 신경계 지역 간의 미세 혈관 분기뿐만 아니라 다른 개인 들 사이의 비교를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 마이크로선박 분리 기술은 하루 내에 완료될 수 있으며, 초원심 분리 및 효소 해리의 필요성을 제거합니다. 수막과 치로이드 신경을 제거하는 것은 어려울 수 있습니다.각 조직의 완전한 제거를 보장하기 위해 천천히 신중하게 작동해야합니다. 작은 lissencephalic 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부를 위해, 얼음에 MV-1 용액을 포함하는 15 밀리리터 원추형 관에 수확한 두뇌를 놓고, 두개골의 셀라 turcica에서 뇌하수체를 회수하기 위하여 집모를 이용하십시오. 뇌하수체를 MV-1 용액의 1.7 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 얼음에 놓고 피부와 근육을 제거하여 척추 컬럼을 노출시합니다.사지, 흉곽 및 내부 장기를 제거 한 후, 18 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 요추 척추 포먼 전체에 걸쳐 코달 - 투 - 로스트랄 방향으로 신선한 MV-1 용액으로 척추 컬럼을 플러시하십시오. 그런 다음 척수를 신선한 MV-1 용액을 포함하는 5 밀리리터 튜브에 놓습니다. 다음으로, 해부 현미경 의 밑에 페트리 접시에 두뇌를 놓고, 이중 갈래 찌르기로 수막을 제거합니다.수막 조각이 남아 있지 않도록 척수를 확인하십시오. 시상 하 부, 소뇌, 뇌 줄기 및 피 질을 분리 하는 집게를 사용 하 여. 필요한 경우, 후각 전구와 시동을 소비하기 위해 집게와 홍채와 봄 가위를 사용하고, 모든 뇌 심실에서 모든 choroid 신경을 제거하기 위해 이중 갈래 찌르기 찌르기를 사용합니다.큰 자임내막 척추 동물 견본에서 CNS 조직 해부를 위해, 해부현미경 및 이중 갈래 찌르기, 집게, 홍채 및 봄 가위를 사용하여 각 CNS 조직에서 수막을 제거하고, 뇌 심실에서 choroid 신경질의 조각을 제거하는 주의하십시오. 수확된 CNS 조직의 균질화를 위해 각 CNS 영역을 개별 페트리 요리 내에서 1~2밀리미터 조각으로 다진다. 작은 척추 동물 표본에서 CNS 조직을 균질화하기 위해, MV-1 용액의 1 밀리리터를 추가하여 다진 조직을 중단하는 이송 파이펫을 사용합니다.그런 다음 동일한 이송 파이펫을 사용하여 피질, 소뇌, 뇌줄기, 광학 엽 및 척수 조각을 개별 10 밀리리터 유리 조직 분쇄기로 분배하고 PTFE 유봉과 MV-1 용액 5개를 사용하여 각 조직 세트를 약 10스트로크로 분쇄합니다. 각 조직 슬러리를 얼음 위에 개별 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 집게를 사용하여 개별 1.7 밀리리터 튜브에 MV-1 용액의 100 마이크로리터에 시상 하부 및 뇌하수체를 배치합니다. 그런 다음 유리 마이크로 페슬로 각 조직을 조심스럽게 균질화합니다.큰 척추 동물 표본을 균질화하려면, 55 밀리리터 유리 조직 분쇄기로 다진 조직을 전송하기 위해 beveled 컷 전송 파이펫을 사용하고, 오버 헤드 교반기에 분쇄기를 부착. 표에 표시된 대로 균질화되는 특정 CNS 부분에 따라 MV-1 용액의 권장 량의 절반을 추가하고 오버헤드 교반기를 분당 약 150회전으로 켭니다. 유리 튜브를 약 30초 동안 위아래로 움직여 오버헤드 교반기를 끄고 균일한 슬러리가 얻어질 때까지 추가균질화를 위해 MV-1 용액을 더 추가합니다.그런 다음 균질화 된 조직을 얼음에 50 밀리리터 원판 튜브로 옮기십시오. 마이크로 용기 정화를 위해, CNS 조직은 원심분리에 의해 균질화하고, 초월제를 폐기한다. 작은 척추 동물 표본 마이크로 선박 절연의 경우, 피질, 소뇌, 뇌 줄기, 광학 엽 및 척수 펠릿을 피펫, 샘플 당 신선한 얼음 차가운 MV-2 용액 5 밀리리터에서 약 10 번, 각 튜브에 얼음 차가운 MV-2 용액 5 밀리리터를 추가합니다.조심스럽게 혼합 튜브를 플립, MV-2 용액의 한 밀리리터에서 시상 하부 및 뇌하수체 펠릿을 다시 중단. 큰 척추 동물 표본 마이크로 혈관 절연의 경우, 피질, 소뇌, 뇌 줄기 및 척수 미세 혈관 펠릿에 얼음 차가운 MV-2 용액 20 밀리리터를 추가하고 약 5 분 동안 분당 40 회전에서 튜브 리볼버에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 재서스펜션의 끝에서, CNS 조직이 원심분리에 의해 리케이트를 분리하고, 각 튜브를 천천히 회전하여 상퍼가 벽을 따라 통과하여 관 벽에서 액체 인터페이스의 두껍고 조밀한 골수진 층을 조심스럽게 분리합니다.골수와 액체 인터페이스를 버리고 각 튜브의 내부 벽을 낮은 보풀 종이 닦아 주걱으로 얼룩. 그런 다음 꼬인 로우 린트 종이 닦기를 사용하여 과도한 액체를 흡수하고 바인딩이 적은 팁을 사용하여 각 펠릿을 MV-3 용액 1밀리리터로 다시 일시 중단합니다. 마이크로용기 용출 및 여과의 경우, 각 CNS 조직 마이크로용기 슬러리에 신선한 MV-3 용액을 몇 밀리리터를 혼합하고, 골재를 피하기 위해 혼합하는 동안, 각 서스펜션을 프루이트 스트레이너를 통해 개별 50 밀리리터 원내 튜브로 변형한다.CNS 영역당 20 마이크로미터 나일론 그물 필터 하나를 하나의 수정된 필터 홀더에 놓습니다. 필터 홀더를 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고, 5밀리리터의 얼음-차가운 MV-3 용액으로 필터를 적시어 버퍼가 필터 홀더아래로 부어 원추형 튜브에 넣습니다. 각 20 마이크로미터 나일론 그물 필터에 용출 된 마이크로 혈관을 전송하고, 얼음 차가운 MV-3 용액의 5 ~ 10 밀리리터로 마이크로 혈관을 헹구는.집게를 사용하여 각 필터를 얼음-차가운 MV-3 용액이 들어 있는 개별 비커로 옮기고 각 필터를 약 30초 동안 부드럽게 흔들어 미세 혈관을 분리합니다. 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴 후 원심분리로 마이크로용기를 수집하고, 저결합 파이펫을 사용하여 얼음-차가운 MV-3 용액 1밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음, 작은 척추 동물 표본에서 마이크로 선박 현탁액을 섭씨 4도에서 20, 000 배 G에서 5 분 동안 원심 분리를위한 1.7 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 이송합니다.큰 척추 동물 표본의 경우 서스펜션을 개별 5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 2, 000배 G에서 5분간 원심분리용 MV-3 용액 4밀리리터를 추가합니다. 신경혈관 부의 본질적인 성분은 CD31, PDGFR 베타 및 아쿠아포린 4에 대한 면역 라벨링에 의해 입증된 바와 같이 마이크로혈관 내에서 검출될 수 있으며, 피질, 소뇌, 뇌하부항, 뇌줄기 및 척추 미세혈관을 포함한다. 마찬가지로, 부착-접합 단백질 VE-cadherin, 단단한 접합 단백질 CLDN5 및 조눌라 옥클루덴스-1, 삼세포 접합 단백질 angulin-1, 및 기저 마크 케모킨 리간드 CXCL 모티프 12, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제-1의 발현이 시각화될 수 있다.더욱이, 마이크로혈관의 대다수는 알파 평활근 액틴의 발현이 결여되어 있으며, 이는 이러한 격리 프로토콜이 선택적으로 작은 구경 마이크로선을 표적으로 한다는 것을 나타낸다. 조류, 거짓말쟁이, 개구리 및 물고기와 같은 다른 작은 lissencephalic 척추 동물에서 얻은 미생물은 이 방법이 종 사이의 신경 혈관 단위의 차이의 추가 특성화에 유용하다는 것을 시사하는 몇 가지 형태학적 특징을 공유합니다. 단백질 발현의 변화의 정량화는 실험적인 자가면역 뇌척수염의 피크 동안 척수 미세혈관을 따라 혈관 세포 접착 분자 1개 및 접합 접착 분자 B의 증가를 나타낸다.그러나, 혈관 세포 접착 분자 하나는 또한 뇌하수체 미세 혈관에서 현저하게 증가하고, 시상 하부 및 뇌간 미세 혈관에서 감소한다. 또한, 모든 CNS 조직에서 만성 실험자가 면역 뇌척수염 동안 혈관 세포 접착 분자 1발식, 그리고 시상하부 및 뇌하부 미생물에서 접합 접착 분자 B 발현에서 변화가 관찰된다. 서양 얼룩, PCR 및 면역 조직 화학과 같은 정량적 분석은 이 절차에 따라 수행되어 혈액-뇌 장벽 내의 유전자 및 단백질 발현 패턴에 대한 통찰력을 나타낼 수 있습니다.파라포름알데히드는 급성 독성 시약이며, 적절한 PPE를 착용하는 동안 항상 연기 후드 에서 처리해야합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

연구

신경과학

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...