Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Dr. Cruz-Orengo ble støttet av University of California, Davis, School of Veterinary Medicine oppstart Funds.

Alle prosedyrer i denne studien er i samsvar med retningslinjene satt av University of California (UC), Davis institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Animal Care ved UC Davis er regulert av flere uavhengige ressurser og har blitt fullstendig akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) siden 1966. Svin CNS vev ble innhentet fra UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory. CNS vev fra rhesus aper ble innhentet fra California Nationa...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li><li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier.">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).</li><li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+barriers:+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms.">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes &amp; Development. 32, 466-478 (2018).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity.">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li><li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSR/angulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation.">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility.">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li><li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

Den BBB inkluderer de unike egenskapene til hjernen microvasculature endothelial celler kombinert med en sofistikert arkitektur av stramme-, adherens-, "Peg-socket"-knutepunkter, og vedheft plaketter avgjørende for CNS homeostase2,3,19. Endothelial celler egenskaper er indusert og vedlikeholdt av pericytes og de omkringliggende astroglia ende-fots prosesser2,3,</su...

Vår hjerne er det viktigste organet i kroppen vår. Av denne grunn, holde hjernen homeostase tross eksterne faktorer som kan utløse et avvik fra normalitet er en prioritet. Ifølge noen forskere, om lag 400 til 500 millioner år siden1, virveldyr dyr utviklet det vi nå kjenner som Blood-Brain Barrier (BBB)2,3. Denne beskyttende "gjerde" utøver den største innflytelsen over sentralnervesystemet (CNS) homeostase og funksjoner ved å tett regulere transport av ioner, molekyler, og celler mellom blod og CNS parenchyma. Når BBB er forstyrret, blir hjernen utsatt for giftig eksponering, infeksjon og betennelse. Derfor BBB dysfunksjon er forbundet med mange, om ikke alle, nevrologiske og neurodevelopmental lidelser4,5,6.
Den sofistikerte funksjon av BBB er tilskrevet den unike CNS microvasculature likedannet av nevrovaskulære enhet (NVU)2,3. Høyt spesialiserte endothelial celler, pericytes, og astrocytic ende-føtter er cellulære komponenter i NVU2,3. Den ekstracellulære matrise generert av disse cellene er også avgjørende for NVU og BBB fysiologi2,3. Selv om essensielle cellulære og molekylære komponenter av NVU er bevart blant virveldyr, er heterogenitet rapportert blant ordre og Art7,8. Men tekniske begrensninger hindre vår evne til å fullt ut vurdere disse forskjellene i nevrobiologi, biomedisinsk eller translational forskning.
På grunn av dette, utvidet vi en CNS region-spesifikk microvessel-isolasjon metode for å gjøre det gjelder for mange arter fra alle fem virveldyr grupper: fisk, amfibier, reptiler, fugler og pattedyr. Protokollen er beskrevet for bruk på små-lissencephalic og store-gyrencephalic virveldyr, inkludert arter med translational relevans9. I tillegg inkluderer vi andre regioner av CNS ikke undersøkt før i denne sammenheng, men relevant for nevrofysiologi og med enorme kliniske implikasjoner: hypothalamus, hypofysen, og hvit materie. Til slutt, testet vi kapasiteten til denne isolasjons metoden som et pålitelig verktøy for å identifisere endringer i protein uttrykk langs NVU og/eller BBB9,10,11. Som en proof-of-konseptet, viste vi hvordan du fastslår endringer i VCAM-1 og JAM-B uttrykk under EAE bruke isolasjons metoden etterfulgt av immunofluorescence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

Isolering av microårene fra sentralnervesystemet (CNS) er vanligvis utføres ved å kombinere kortikale vev fra flere dyr, oftest gnagere. Denne tilnærmingen begrenser avhør av blod-hjerne barriere (BBB) egenskaper til cortex og tillater ikke for individuelle sammenligning. Dette prosjektet fokuserer på utvikling av en isolasjons metode som gjør det mulig for sammenligning av nevrovaskulære enheten (NVU) fra flere CNS-regioner: cortex, lillehjernen, optikk flik, hypothalamus, hypofysen, hjernestammen, og ryggmargen. Videre ble denne protokollen, opprinnelig utviklet for murine prøver, med hell tilpasset for bruk på CNS vev fra små og store virveldyr arter som vi er også i stand til å isolere microårene fra hjernen halvkule hvit materie. Denne metoden, når den er sammenkoblet med immunolabeling, tillater kvantifisering av protein uttrykk og statistisk sammenligning mellom individer, vevs type, eller behandling. Vi beviste dette anvendelsen ved å evaluere endringer i protein uttrykk under eksperimentell autoimmune encefalomyelitt (EAE), en murine modell av en neuroinflammatory sykdom, multippel sklerose. I tillegg kan microårene isolert med denne metoden brukes til nedstrøms programmer som qPCR, RNA-SEQ og Western Blot, blant andre. Selv om dette ikke er første forsøk på å isolere CNS microårene uten bruk av ultracentrifugation eller enzymatisk dissosiasjon, er det unikt i sin Adeptness for sammenligning av enkeltpersoner og flere CNS regioner. Derfor tillater det for etterforskning av en rekke forskjeller som kan ellers forbli obskure: CNS porsjoner (cortex, lillehjernen, optikk, hjernestammen, hypothalamus, hypofysen, og ryggmargen), CNS vev type (grå eller hvit materie), enkeltpersoner, eksperimentelle behandlingsgrupper og arter.

Microårene isolert fra murine CNS viste alle indre cellulære komponenter av nevrovaskulære Unit2,3. Ved hjelp av enten blodplater endothelial celle vedheft molekyl-1 (PECAM, også kjent som CD31) eller isolectin IB4 (en glykoprotein som binder endothelial celle glycocalyx) for endothelial celler, blodplater avledet vekstfaktor-β (PDGFRβ) eller Nevron-gliacellene antigen 2 (NG2) for pericytes og aquaporin-4 (AQP4) for astrocyt...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Målet med denne protokollen er å isolere microårene fra flere regioner i det sentrale nervesystemet i lissencephalic og gyrencephalic virveldyr.

Pålitelig isolering av sentrale nervesystemet Microårene over fem virveldyr grupper

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Denne protokollen er betydelig fordi den tillater sammenligning av mikrovasulatur mellom ulike sentralnervesystemregioner, så vel som mellom forskjellige individer. Denne mikrovessel isolasjonsteknikken kan fullføres innen en enkelt dag, og det eliminerer behovet for ultracentrifugation og enzymatisk dissosiasjon. Fjerne meninges og choroid plexus kan være vanskelig.Sørg for å arbeide sakte og forsiktig for å sikre fullstendig fjerning av hvert vev. For CNS vev disseksjon fra en liten lissencephalic virveldyr prøve, plasser den høstede hjernen i en 15 milliliter konisk rør som inneholder MV-1 løsning på is, og bruk tang for å hente hypofysen fra sella turcica av skallen. Plasser hypofysen i et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør av MV-1-løsning på is, og fjern huden og muskelen for å eksponere vertebralkolonnen.Etter å ha fjernet lemmer, brystkassen og indre organer, bruk en 10 milliliter sprøyte utstyrt med en 18 gauge nål for å skylle vertebralkolonnen med fersk MV-1-løsning, i en caudal-til-rostral retning gjennom lumbale vertebral foramen. Legg deretter ryggmargen i et 5 ml rør som inneholder fersk MV-1-løsning. Deretter plasserer du hjernen i en petriskål under det dissekerende mikroskopet, og fjerner meningene med dobbeltdelt prikk.Pass på å sjekke ryggmargen for å sikre at ingen biter av meninges er igjen. Bruk tangen til å skille hypothalamus, lillehjernen, hjernestammen og cortex. Når det er nødvendig, bruk tang og iris og vårsaks for å avgiftsdirektoratet olfaktoriske pærer og thalamus, og bruk den dobbeltdelte prikken for å fjerne alle choroid plexus fra alle hjerneventriklene.For CNS vev disseksjon fra en stor gyrencephalic virveldyr prøve, bruk et dissekere mikroskop og en dobbelt-pronged stikk, tang, og iris og våren saks for å fjerne meninges fra hvert CNS vev, ta vare på å fjerne noen biter av choroid plexus fra hjernen ventriklene. For homogenisering av høstet CNS vev, hakke hver CNS-regionen i en til to millimeter stykker i individuelle Petri retter. For å homogenisere CNS vev fra små virveldyr prøver, bruk en overføring pipette for å legge til en milliliter MV-1 løsning for å suspendere hakket vev.Bruk deretter den samme overføringspipetten til å dispensere cortex, lillehjernen, hjernestammen, optisk lobe og ryggmargsstykker i individuelle 10 ml glassvevskverner, og bruk en PTFE pestle og fem milliliter MV-1-løsning for å male hvert sett med vev i ca 10 slag. Overfør hvert vev slurry til individuelle 15 milliliter koniske rør på is, og bruk tang til å plassere hypothalamus og hypofysen i 100 mikroliter MV-1 løsning, i individuelle 1,7 milliliter rør. Deretter homogeniserer du forsiktig hvert vev med et glassmikropestle.For å homogenisere en stor virveldyrprøve, bruk en skråskåret overføringspipette for å overføre hakket vev til en 55 milliliter glassvevskvern, og fest jekselen til en overhead rører. Tilsett halvparten av det anbefalte volumet av MV-1-løsningen i henhold til den spesifikke CNS-delen som homogeniseres som angitt i tabellen, og slå på overhead røreren til ca 150 rotasjoner per minutt. Flytt glassrøret forsiktig opp og ned i ca. 30 sekunder før du slår av røreren for overhead for å legge til mer MV-1-løsning for ytterligere homogenisering, til en homogen slam oppnås.Deretter overfører homogenisert vev til et 50 milliliter konisk rør på is. For mikrovessel rensing, pellet CNS vev homogeniserer ved sentrifugering, og kaste supernatanter. For en liten virveldyrprøve mikrovessel isolasjon, pipette cortex, lillehjernen, hjernestammen, optisk lobe og ryggmargspellets, i fem milliliter med frisk, iskald MV-2 løsning per prøve, ca 10 ganger, før du legger til fem flere milliliter iskalde MV-2 løsning til hvert rør.Vend rørene forsiktig for å blande, og re-suspendere hypothalamus og hypofyse pellets i en milliliter MV-2 løsning. For store virveldyr prøve mikrovessel isolasjon, tilsett 20 milliliter iskalde MV-2 løsning på cortex, cerebellum, hjernestamme, og ryggmargen microvessel pellets, og re-suspendere pellets i en rør revolver ved 40 rotasjoner per minutt i ca 5 minutter. På slutten av re-suspensjon, skille CNS vev lycates ved sentrifugering, og sakte rotere hvert rør for å tillate supernatant å passere langs veggen for å forsiktig løsne det tykke og tette myelin laget på flytende grensesnitt fra rørveggene.Kast myelin og flytende grensesnitt, og blot den indre veggen av hvert rør med en slikkepott innpakket med en lav-lo papir tørk. Deretter bruker du en vridd papirsletting med lavt lo for å absorbere overflødig væske, og bruk lavbindingsspisser til å suspendere hver pellet i én milliliter MV-3-oppløsning. For mikrovessel elution og filtrering, bland noen milliliter frisk MV-3 løsning til hver CNS vev microvessel slurry, og mens du blander for å unngå aggregater, spenne hver suspensjon gjennom en Pruitt sil i individuelle 50 milliliter koniske rør.Plasser ett 20 mikrometer nylonnettfilter på en modifisert filterholder per CNS-region. Overfør filterholderen til et konisk rør på 50 milliliter, og våt filteret med fem milliliter iskald MV-3-løsning, og pass på at bufferen helles ned filterholderen, inn i det koniske røret. Overfør de eluted mikroveslene til hvert 20 mikrometer nylonnettfilter, og skyll mikroveslene med fem til 10 milliliter iskald MV-3-løsning.Bruk tang til å overføre hvert filter til individuelle beger som inneholder den iskalde MV-3-løsningen, og rist forsiktig hvert filter i ca. 30 sekunder for å løsne mikroveslene. Etter overføring til et konisk rør på 15 milliliter, samle mikroveslene ved sentrifugering, og bruk en lavbindingspipette til å suspendere hver pellet i en milliliter iskald MV-3-løsning. Deretter overfører microvessel suspensjoner fra små virveldyr prøver til en 1,7 milliliter mikrocentrifuge rør for sentrifugering i fem minutter ved 20,000 ganger G, i fire grader celsius.For store virveldyrprøver, overfør suspensjonen til individuelle fem milliliter sentrifugerør, og tilsett fire milliliter MV-3-løsning for sentrifugering i fem minutter ved 2000 ganger G i fire grader celsius. De indre komponentene i den nevrovaskulære enheten kan påvises i mikrovessler, isolert som demonstrert, ved immunolabeling for CD31, PDGFR-beta og aquaporin fire, inkludert kortikale, lillehjernen, hypofysen, hypothalamus, hjernestamme og spinal mikrovessels. Likeledes, uttrykket av adherens-junction protein VE-cadherin, tette knutepunkt proteiner CLDN5 og Zonula Okkluder-1, tricellulære knutepunkt protein angulin-1, og basal merker chemokine ligand CXCL motiv 12, og gamma-glutamyltransferase-1, kan visualiseres.Videre er flertallet av mikroveslene blottet for uttrykket av alfa glatt muskel actin, noe som indikerer at denne isolasjonsprotokollen selektivt retter seg mot småkaliber mikrovessler. Mikrovesker hentet fra andre små lissencephalic virveldyr, som fugl, løgnere, frosk og fisk, deler noen morfologiske egenskaper, noe som tyder på at denne metoden er nyttig for videre karakterisering av forskjeller i nevrovaskulære enheter mellom arter. Kvantifisering av endringene i proteinuttrykket avslører en økning i vaskulær celleadhesjonsmolekyl ett, og junctional adhesjonsmolekyl B langs ryggmargsmikrovessler, under toppen av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt.Imidlertid er vaskulær celle adhesjon molekyl en også betydelig økt i hypofysen mikrovessels, og redusert i hypothalamus og brainstem mikrovessels. I tillegg observeres endringer i vaskulær celle vedheftmolekyl ett uttrykk under kronisk eksperimentell autoimmun encefalomyelitt i alle CNS-vev, og i junctional adhesjonsmolekyl B uttrykk i hypothalamus og hypofysen mikrovessels. Kvantitative analyser, som vestlig flekk, PCR og immunohistochemistry, kan utføres etter denne prosedyren for å avsløre innsikt i gen- og proteinuttrykksmønstre innenfor blod-hjernebarrieren.Paraformaldehyd er et akutt giftig reagens, og bør alltid håndteres under røykhetten mens du bruker riktig PPE.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...