Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Dr. Cruz-Orengo foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Davis, Escola de Medicina Veterinária Start Up Funds.

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Califórnia (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O cuidado animal em UC Davis é regulado por diversos recursos independentes e foi acreditado inteiramente pela associação para a avaliação e o accreditation do animal do laboratório internacional (AAALAC) desde 1966. Tecidos sincie foram obtidos do Departamento de Ciências Animais da UCD, Laboratório de Ciências da Carne. Teci...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. 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R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

O BBB inclui as propriedades únicas das células endotélias de microvasculatura cerebral juntamente com uma arquitetura sofisticada de junções apertadas, aderentes, "peg-soquete" e placas de adesão críticas para a homeostasedoSNC2,3,19. As propriedades das células endotélias são induzidas e mantidas pelos pericitos e pelos processos circundantes astroglia end-foot2,3,...

Nosso cérebro é o órgão mais importante do nosso corpo. Por esta razão, manter a homeostase cerebral, apesar de fatores externos que podem desencadear um desvio da normalidade é uma prioridade. De acordo com alguns estudiosos, cerca de 400-500 milhões de anos atrás1, animais vertebrados desenvolveram o que hoje conhecemos como a barreira hemato-hematograse (BBB)2,3. Esta "cerca" protetora exerce a maior influência sobre a homeostase e as funções do sistema nervoso central (SNC), regulando firmemente o transporte de íons, moléculas e células entre sangue e snc. parenchyma. Quando o BBB é interrompido, o cérebro torna-se suscetível à exposição tóxica, infecção e inflamação. Portanto, a disfunção BBB está associada a muitos distúrbios neurológicos e neurodesenvolvimentais4,5,6.
A função sofisticada do BBB é atribuída à microvasculatura cns única conformada pela unidade neurovascular (NVU)2,3. Células endotélias altamente especializadas, pericitos e pés finais ascícticos são os componentes celulares do NVU2,3. A matriz extracelular gerada por essas células também é essencial para a fisiologia NVU e BBB2,3. Embora componentes celulares e moleculares essenciais do NVU sejam conservados entre vertebrados, a heterogeneidade é relatada entre ordens eespécies 7,8. No entanto, limitações técnicas impedem nossa capacidade de considerar plenamente essas diferenças em pesquisa sonoridade, biomédica ou translacional.
Devido a isso, expandimos um método de isolamento de micronavios específico da região do SNC para torná-lo aplicável a inúmeras espécies de todos os cinco grupos vertebrados: peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. O protocolo é descrito para uso em vertebrados pequenos lissencefálicos e de grande girofálico, incluindo espécies com relevância translacional9. Além disso, incluímos outras regiões do SNC não investigadas antes neste contexto, mas relevantes para a neurofisiologia e com tremendas implicações clínicas: hipotálamo, hipófise e matéria branca. Por fim, testamos a capacidade deste método de isolamento como uma ferramenta confiável paraidentificar mudanças na expressão de proteínas ao longo da NVU e/ou BBB9,10,11. Como prova de conceito, mostramos como determinar as mudanças na expressão VCAM-1 e JAM-B durante o EAE usando o método de isolamento seguido de imunofluorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

O isolamento de microvasos do sistema nervoso central (SNC) é comumente realizado apartir da combinação de tecido cortical de múltiplos animais, na maioria das vezes roedores. Esta abordagem limita o interrogatório de propriedades de barreira sangue-cérebro (BBB) ao córtex e não permite a comparação individual. Este projeto se concentra no desenvolvimento de um método de isolamento que permite a comparação da unidade neurovascular (NVU) de várias regiões do SNC: córtex, cerebelo, lobo óptico, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal. Além disso, este protocolo, originalmente desenvolvido para amostras de urina, foi adaptado com sucesso para uso em tecidos do SNC de pequenas e grandes espécies de vertebrados das quais também somos capazes de isolar microvasos da matéria branca do hemisfério cerebral. Este método, quando emparelhado com imunorotulagem, permite a quantidade de expressão proteica e comparação estatística entre indivíduos, tipo de tecido ou tratamento. Provamos essa aplicabilidade avaliando mudanças na expressão de proteínas durante encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de urina de uma doença neuroinflamatória, esclerose múltipla. Além disso, micronavios isolados por este método poderiam ser usados para aplicações a jusante como qPCR, RNA-seq e mancha ocidental, entre outros. Mesmo que esta não seja a primeira tentativa de isolar micronavios do SNC sem o uso de ultracentrifugação ou dissociação enzimática, é único em sua adeptness para a comparação de indivíduos solteiros e múltiplas regiões do SNC. Portanto, permite a investigação de uma série de diferenças que, de outra forma, podem permanecer obscuras: porções do SNC (córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral, hipotálamo, hipófise e medula espinhal), tipo de tecido cns (matéria cinzenta ou branca), indivíduos, grupos de tratamento experimental e espécies.

Microvasos isolados do CNS de urina mostraram todos os componentes celulares intrínsecos da unidade neurovascular2,3. Usando molécula de adesão de plaquetas endotelial-1 (PECAM, também conhecida como CD31) ou isolectinA IB4 (uma glicoproteína que liga o glycocalyx endotelilista) para células endotélias, plaquetas derivaram fator de crescimento-β (PDGFRβ) ou antígeno neuronal-glial 2 (NG2) para pericitos e aquaporina-4 (A...

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Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Este protocolo é significativo porque permite a comparação da microvasculatura entre diferentes regiões do sistema nervoso central, bem como entre diferentes indivíduos. Esta técnica de isolamento de microvessel pode ser completada dentro de um único dia, e elimina a necessidade de ultracentrifugação e dissociação enzimática. Remover as meninges e o plexo coroide pode ser difícil.Certifique-se de trabalhar devagar e com cuidado para garantir a remoção completa de cada tecido. Para dissecção tecidual CNS de uma pequena amostra de vertebrados lissencéceicos, coloque o cérebro colhido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo solução MV-1 no gelo, e use fórceps para recuperar a hipófise da sella turcica do crânio. Coloque a pituitária em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro de solução MV-1 no gelo, e remova a pele e o músculo para expor a coluna vertebral.Depois de remover os membros, a caixa torácica e os órgãos internos, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para lavar a coluna vertebral com uma solução MV-1 fresca, em uma direção caudal-rostral em todo o forame vertebral lombar. Em seguida, coloque a medula espinhal em um tubo de 5 mililitros contendo uma solução MV-1 fresca. Em seguida, coloque o cérebro em uma placa de Petri sob o microscópio dissecando, e remova os meninges com picada de ponta dupla.Certifique-se de verificar a medula espinhal para garantir que não restam pedaços de meninges. Use os fórceps para separar o hipotálamo, cerebelo, tronco cerebral e córtex. Quando necessário, use fórceps e íris e tesouras de mola para extirir as lâmpadas olfativas e o tálamo, e use o espinho de duas pontas para remover todo o plexo coroide de todos os ventrículos cerebrais.Para dissecção de tecido CNS de uma grande amostra de vertebrados gyrencecencerásicos, use um microscópio dissecando e um espinho de duas pontas, fórceps e íris e tesoura de mola para remover as meninges de cada tecido CNS, tomando o cuidado de remover quaisquer pedaços de plexo choroide dos ventrículos cerebrais. Para homogeneização dos tecidos CNS colhidos, pique cada região do CNS em pedaços de um a dois milímetros dentro de placas de Petri individuais. Para homogeneizar os tecidos CNS de pequenas amostras de vertebrados, use uma pipeta de transferência para adicionar um mililitro de solução MV-1 para suspender o tecido picado.Em seguida, use a mesma pipeta de transferência para distribuir o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pedaços de medula espinhal em moedores individuais de tecido de vidro de 10 mililitros, e use um pilão PTFE e cinco mililitros de solução MV-1 para moer cada conjunto de tecidos por cerca de 10 golpes. Transfira cada chorume de tecido para tubos cônicos individuais de 15 mililitros no gelo, e use fórceps para colocar o hipotálamo e a pituitária em 100 microliters de solução MV-1, em tubos individuais de 1,7 mililitros. Em seguida, homogeneize cuidadosamente cada tecido com uma micropéda de vidro.Para homogeneizar uma grande amostra de vertebrados, use uma pipeta de transferência de corte chanfrada para transferir o tecido picado para um moedor de tecido de vidro de 55 mililitros, e anexar o moedor a um agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1 de acordo com a parte específica do CNS sendo homogeneizada conforme indicado na tabela, e ligue o agitador aéreo para aproximadamente 150 rotações por minuto. Mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 segundos antes de desligar o agitador aéreo para adicionar mais solução MV-1 para homogeneização adicional, até que um chorume homogêneo seja obtido.Em seguida, transfira o tecido homogeneizado para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para purificação de microvasos, a pelota do tecido CNS homogeneiza por centrifugação e descarta os sobrenantes. Para um pequeno espécime vertebrado isolamento de microvessel, pipeta o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas de medula espinhal, em cinco mililitros de solução MV-2 fresca e gelada por amostra, cerca de 10 vezes, antes de adicionar mais cinco mililitros de solução MV-2 gelada a cada tubo.Vire cuidadosamente os tubos para misturar, e suspenda as pelotas hipotálamo e pituitária em um mililitro de solução MV-2. Para o isolamento de microvessel de amostras de vertebrados grandes, adicione 20 mililitros de solução MV-2 gelada ao córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvessel da medula espinhal, e suspenda as pelotas em um revólver de tubo a 40 rotações por minuto por cerca de 5 minutos. No final da re-suspensão, separe os tecidos CNS por centrifugação e gire lentamente cada tubo para permitir que o supernatante passe ao longo da parede para desprender cuidadosamente a espessa e densa camada de mielina na interface líquida das paredes do tubo.Descarte as interfaces mielina e líquida, e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula enrolada com um lenço de papel de fiapo baixo. Em seguida, use uma limpeza de papel de fiapo de baixo fiapo torcido para absorver o excesso de líquido e use pontas de baixa ligação para suspender novamente cada pelota em um mililitro de solução MV-3. Para elução e filtragem de microvalhos, misture alguns mililitros de solução MV-3 fresca para cada pasta de microvessel de tecido CNS, e enquanto se mistura para evitar agregados, coe cada suspensão através de um coador Pruitt em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.Coloque um filtro de rede de nylon de 20 micrômetros em um suporte de filtro modificado por região CNS. Transfira o suporte do filtro para um tubo cônico de 50 mililitros e molhe o filtro com cinco mililitros de solução MV-3 gelada, certificando-se de que o tampão despeje o suporte do filtro, no tubo cônico. Transfira os microvexes elucidos para cada filtro de rede de nylon de 20 micrômetros e enxágue os microvaxes com cinco a dez mililitros de solução MV-3 gelada.Use fórceps para transferir cada filtro para béquers individuais contendo a solução MV-3 gelada e agite suavemente cada filtro por cerca de 30 segundos para separar os microvexes. Depois de transferir para um tubo cônico de 15 mililitros, colete os microvessels por centrifugação e use uma pipeta de baixa ligação para suspender derreta cada pelota em um mililitro de solução MV-3 gelada. Em seguida, transfira as suspensões de microvaxis de pequenos espécimes vertebrados em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro para centrifugação por cinco minutos a 20.000 vezes G, em quatro graus celsius.Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão para tubos individuais de centrífugas de cinco mililitros e adicione quatro mililitros de solução MV-3 para centrifugação por cinco minutos a 2.000 vezes G em quatro graus celsius. Os componentes intrínsecos da unidade neurovascular podem ser detectados dentro de microvexilhões, isolados como demonstrado, por imunolabeling para CD31, PDGFR-beta e aquaporina quatro, incluindo os microvessels cortical, cerebelar, pituitário, hipotálamo, tronco cerebral e microvessels espinhais. Da mesma forma, a expressão da proteína de junção de aderentes VE-cadherin, as proteínas de junção apertada CLDN5 e Zonula Occludens-1, a proteína de junção tricelular angulin-1, e as marcas basais chemokine ligand CXCL motivo 12, e gama-glutamyltransferase-1, podem ser visualizadas.Além disso, a maioria dos microvaxes são desprovidos da expressão de actina muscular suave alfa, indicando que este protocolo de isolamento tem como alvo seletivamente microvessels de pequeno calibre. Microvaxes obtidos de outros pequenos vertebrados lissencéceicos, como aves, mentirosos, sapos e peixes, compartilham algumas características morfológicas, sugerindo que este método é útil para uma caracterização adicional das diferenças nas unidades neurovasculares entre as espécies. A quantificação das mudanças na expressão proteica revela um aumento na molécula de adesão celular vascular um, e a molécula de adesão juncional B ao longo de microvexes da medula espinhal, durante o pico da encefalomielite autoimune experimental.No entanto, a molécula de adesão celular vascular um também é significativamente aumentado em microvessels pituitários, e diminuiu nos microvessels hipotálamo e tronco cerebral. Além disso, alterações são observadas na molécula de adesão celular vascular uma expressão durante encefalomielite autoimune experimental crônica em todos os tecidos CNS, e na expressão da molécula de adesão da junção B nos microvessels hipotálamo e pituitário. Análises quantitativas, como a mancha ocidental, a PCR e a imunohistoquímica, podem ser realizadas após este procedimento para revelar insights sobre padrões de expressão genética e proteica dentro da barreira hematoencefálica.Paraformaldeído é um reagente agudamente tóxico, e deve ser sempre manuseado sob o capô da fumaça enquanto usa EPI adequado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Neurociência

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...