Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Д-р Круз-Оренго был поддержан Калифорнийским университетом, Дэвис, Школа ветеринарной медицины Запуска средств.

Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Калифорнийским университетом (UC), Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Дэвиса (IACUC). Уход за животными в UC Davis регулируется несколькими независимыми ресурсами и с 1966 год...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li><li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier.">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).</li><li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+barriers:+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms.">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes &amp; Development. 32, 466-478 (2018).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity.">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li><li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSR/angulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation.">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility.">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li><li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

BBB включает в себя уникальные свойства микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга в сочетании с сложной архитектурой плотных, придерживающихся, "пег-розетки" - узлов, и адгезионные бляшки, критически важные для ЦНС гомеостаза2,3,19. Сво...

Наш мозг является самым важным органом в нашем теле. По этой причине, сохраняя гомеостаз мозга, несмотря на внешние факторы, которые могут вызвать отклонение от нормальной жизни является приоритетом. По мнению некоторых ученых, около 400-500 миллионов лет назад1, позвоночных животных разработали то, что мы теперь знаем, как гематоэнцефалический барьер (BBB)2,3. Этот защитный "забор" оказывает наибольшее влияние на центральную нервную систему (ЦНС) гомеостаза и функции, плотно регулируя транспорт ионов, молекул и клеток между кровью и ЦНС parenchyma. Когда BBB нарушается, мозг становится восприимчивым к токсическим воздействием, инфекции и воспаления. Таким образом, дисфункция BBB связана со многими, если не со всеми, неврологическими и нейроразвития расстройств4,5,6.
Сложная функция BBB приписывается уникальной микроваскулярной ЦНС, соответствующей нервно-сосудистому блоку (НВУ)2,3. Высокоспециализированные эндотелиальные клетки, перициты и астроцитарные конечные ноги являются клеточными компонентами NVU2,3. Внеклеточная матрица, генерируемая этими клетками, также имеет важное значение для физиологии NVU и BBB2,3. Хотя основные клеточные и молекулярные компоненты НВУ сохраняются среди позвоночных, неоднородность сообщается среди заказов и видов7,8. Тем не менее, технические ограничения препятствуют нашей способности в полной мере рассмотреть эти различия в нейробиологии, биомедицинских или трансляционных исследований.
Из-за этого мы расширили метод микрососуд-изоляцию цНС, чтобы сделать его применимым к многочисленным видам из всех пяти позвоночных групп: рыбам, земноводным, рептилиям, птицам и млекопитающим. Протокол описан для использования на мелко-лиссенцефалических и крупногирецефалических позвоночных, в том числе видов с переводной релевантности9. Кроме того, мы включаем другие регионы ЦНС, ранее не исследованные в этом контексте, но имеющие отношение к нейрофизиологии и с огромными клиническими последствиями: гипоталамус, гипофиз и белое вещество. Наконец, мы проверили способность этого метода изоляции в качестве надежного инструмента для выявления изменений в экспрессии белка вдоль NVU и / или BBB9,10,11. В качестве доказательства концепции мы показали, как определить изменения в экспрессии VCAM-1 и JAM-B во время EAE с помощью метода изоляции с последующей иммунофлуоресценцией.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

Изоляция микрососудов из центральной нервной системы (ЦНС) обычно осуществляется путем объединения корковых тканей от нескольких животных, чаще всего грызунов. Такой подход ограничивает анализ свойств гематоэнцефалического барьера (BBB) коре и не позволяет проводить индивидуальное сравнение. Этот проект фокусируется на разработке метода изоляции, который позволяет сравнивать нервно-сосудистую единицу (НВУ) из нескольких областей ЦНС: коры головного мозга, мозжечка, зрительного толка, гипоталамуса, гипофиза, ствола головного мозга и спинного мозга. Кроме того, этот протокол, первоначально разработанный для образцов мурин, был успешно адаптирован для использования в тканях ЦНС от малых и крупных позвоночных видов, из которых мы также можем изолировать микрососуды из белого вещества полушария мозга. Этот метод, в паре с иммуномаркировкой, позволяет количественно определить экспрессию белка и статистическое сравнение между людьми, типом ткани или лечением. Мы доказали эту применимость, оценив изменения экспрессии белка во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), моринмодели нейровоспалительных заболеваний, рассеянного склероза. Кроме того, микрососуды, изолированные этим методом, могут быть использованы, в частности, для таких приложений, как qPCR, RNA-seq и Western blot. Несмотря на то, что это не первая попытка изолировать микрососуды ЦНС без использования ультрацентрифюгации или ферментативной диссоциации, она уникальна по своей искусности для сравнения отдельных лиц и нескольких регионов ЦНС. Таким образом, это позволяет исследует целый ряд различий, которые в противном случае могут оставаться неясными: части ЦНС (кора, мозжечок, оптическая доля, ствол мозга, гипоталамус, гипофиза и спинного мозга), тип ткани ЦНС (серое или белое вещество), лица, экспериментальных групп лечения и видов.

Микрососуды, изолированные от минины ЦНС, показали все внутренние клеточные компоненты нервно-сосудистого блока2,3. Использование либо тромбоцитов эндотелиальной клетки адгезионной молекулы-1 (PECAM, также известный как CD31) или изолектин I...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Целью данного протокола является изоляция микрососудов из нескольких областей центральной нервной системы лиссенцефалических и гиренцефалических позвоночных.

Надежная изоляция микрососудов центральной нервной системы в пяти группах позвоночных

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет проводить сравнение микроваскулярности между различными регионами центральной нервной системы, а также между различными лицами. Этот метод изоляции микровесселя может быть завершен в течение одного дня, и это устраняет необходимость ультрацентрифугации и энзиматической диссоциации. Удаление окося и хороидного сплетения может быть трудно.Будьте уверены, чтобы работать медленно и осторожно, чтобы обеспечить полное удаление каждой ткани. Для вскрытия ткани ЦНС из небольшого образца лиссенцефалических позвоночных поместите собранный мозг в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую раствор MV-1 на льду, и используйте миппы для извлечения гипофиза из селлы турцики черепа. Поместите гипофиз в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку раствора MV-1 на льду и удалите кожу и мышцу, чтобы разоблачить позвоночник.После удаления конечностей, грудной клетки и внутренних органов, используйте 10 миллилитров шприц оснащен 18 калибровочной иглой, чтобы промыть позвоночный столб со свежим раствором MV-1, в хвостовой к росттральному направлению по всему поясничному позвоночному foramen. Затем поместите спинной мозг в 5 миллилитровую трубку, содержащую свежий раствор MV-1. Затем поместите мозг в чашку Петри под рассеченным микроскопом и удалите околение двойным уколом.Не забудьте проверить спинной мозг, чтобы убедиться, что никаких кусочков околиний не осталось. Используйте типсы, чтобы отделить гипоталамус, мозжечок, ствол мозга и кору. При необходимости используйте щипцы и радужную оболочку глаза и весенние ножницы, чтобы вырезать обонятельные луковицы и таламус, и использовать двойной укол, чтобы удалить все колото-нотовидное сплетение из всех желудочков мозга.Для вскрытия тканей ЦНС из большого образца гиренцефалических позвоночных, используйте рассечение микроскопа и двойной кол, щипцы, и радужной оболочки глаза и весенние ножницы, чтобы удалить околение из каждой ткани ЦНС, заботясь, чтобы удалить любые куски хороидного сплетения из желудочков мозга. Для гомогенизации собранных тканей ЦНС, фарш каждого региона ЦНС в один-два миллиметра штук в отдельных чашках Петри. Для гомогенизации тканей ЦНС из мелких позвоночных образцов, используйте передачу пипетки, чтобы добавить один миллилитр раствора MV-1, чтобы приостановить фарш ткани.Затем используйте ту же трубу для передачи коры головного мозга, мозжечка, ствола мозга, оптической доли и части спинного мозга в отдельные 10 миллилитровых стеклянных тканей шлифовальные машины, и использовать PTFE пестик и пять миллилитров MV-1 решение молоть каждый набор тканей около 10 ударов. Передача каждой ткани суспензии в отдельные 15 миллилитров конических труб на льду, и использовать типсы для места гипоталамус и гипофиза в 100 микролитров раствора MV-1, в отдельных 1,7 миллилитров труб. Затем тщательно гомогенизируйте каждую ткань стеклянным микропестлом.Чтобы гомогенизировать большой образец позвоночных, используйте скошенную срезаную трубу для переноса рубленой ткани в мясорубку из 55 миллилитров стеклянной ткани и прикрепите мясорубку к накладным мешалке. Добавьте половину рекомендуемого объема раствора MV-1 в соответствии с конкретной частью ЦНС, гомогенизированной, как указано в таблице, и включите накладный мешалку примерно до 150 вращений в минуту. Тщательно перемести стеклянную трубку вверх и вниз в течение 30 секунд, прежде чем выключить накладные мешалки, чтобы добавить больше MV-1 решение для дополнительной однородности, пока однородный суспензии не будет получен.Затем перенесите гомогенизированную ткань в 50 миллилитровую коническую трубку на льду. Для очистки микровесселя гранулы ткани ЦНС гомогенатов центрифугации, и отказаться от супернатантов. Для небольшой изоляции позвоночных образца микровессела, пипетки коры головного мозга, ствола мозга, оптической доли и гранул спинного мозга, в пяти миллилитров свежего, ледяного раствора MV-2 на образец, примерно в 10 раз, прежде чем добавить еще пять миллилитров ледяного раствора MV-2 в каждую трубку.Тщательно переверните трубки, чтобы смешать, и повторно приостановить гипоталамус и гипофиза гранулы в один миллилитр раствора MV-2. Для большой изоляции микровесселя позвоночного образца добавьте 20 миллилитров ледяного раствора MV-2 в кору головного мозга, мозжечок, ствол головного мозга и гранулы микровесселя спинного мозга, а также повторно приостановите гранулы в трубчатом револьвере при 40 вращениях в минуту в течение примерно 5 минут. В конце повторной суспензии отделяйте ликаты ткани ЦНС центрифугой и медленно вращайте каждую трубку, чтобы супернатант прошел вдоль стенки, чтобы тщательно отделить толстый и плотный слой миелина от жидкого интерфейса от стенок трубки.Отбросьте миелин и жидкие интерфейсы, и промокнуть внутреннюю стену каждой трубки шпателем, завернутый с низким ворса бумаги протрите. Затем используйте витую салфетку с низким ворсином, чтобы поглощать избыток жидкости, и используйте низкосвязные советы, чтобы повторно приостановить каждую гранулу в один миллилитр раствора MV-3. Для microvessel elution и фильтрации, смешать несколько миллилитров свежего раствора MV-3 для каждой ткани ЦНС микровессель суспензии, и при смешивании, чтобы избежать агрегатов, процедить каждую подвеску через ситечко Pruitt в отдельных 50 миллилитров конических труб.Поместите один 20-метровый фильтр нейлоновой сетки на один модифицированный держатель фильтра в регионе CNS. Перенесите держатель фильтра на 50 миллилитровую коническую трубку и промокнете фильтр пятью миллилитров ледяного раствора MV-3, убедившись, что буфер льется вниз по держатель фильтра, в коническую трубку. Перенесите элеваторные микровессы на каждый 20-метровый нейлоновый чистый фильтр и промойте микровесы 5-10 миллилитров ледяного раствора MV-3.Используйте типсы для переноса каждого фильтра в отдельные стаканы, содержащие ледяной раствор MV-3, и аккуратно встряхните каждый фильтр в течение 30 секунд, чтобы отделить микровессы. После перехода на 15 миллилитровую коническую трубку, соберите микровессы путем центрифугации и используйте низкообязательную пипетку, чтобы повторно приостановить каждую гранулу в одном миллилитре ледяного раствора MV-3. Затем перенесите микровесячные суспензии из мелких позвоночных образцов в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку для центрифугации в течение пяти минут при 20 000 раз G, в четыре градуса цельсия.Для крупных позвоночных образцов перенесите суспензию в отдельные пятими миллилитровые центрифуги и добавьте четыре миллилитров раствора MV-3 для центрифугации в течение пяти минут при 2000 раз G при четырех градусах Цельсия. Внутренние компоненты нервно-мышечного блока могут быть обнаружены в микровесселях, изолированных, как попродемонстрировано, путем иммунолабеля для CD31, PDGFR-бета и аквапорина четыре, в том числе корковых, мозжечковых, гипофиза, гипоталамии, ствола мозга и спинного микровессел. Точно так же можно визуализировать экспрессию придерживается-соединения белка VE-кадерин, плотных белков соединения CLDN5 и Зонула Окклюденс-1, трехклеточного соединения белка ангулина-1 и базальных меток хемокина лиганда CXCL motif 12 и гамма-глутамильтрансферазы-1.Кроме того, большинство микровесселей лишены выражения альфа-гладкого мышечного актина, что указывает на то, что этот протокол изоляции избирательно нацелен на малокалиберные микровесы. Микровессели, полученные от других мелких лиссенцефалических позвоночных, таких как птица, лжец, лягушка и рыба, имеют некоторые морфологические особенности, предполагая, что этот метод полезен для дальнейшей характеристики различий в нервно-сосудистых единицах между видами. Количественная оценка изменений в экспрессии белка показывает увеличение молекулы адгезии сосудистой клетки один, и соединение молекулы адгезии B вдоль микровесселей спинного мозга, во время пика экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.Тем не менее, молекулы адгезии сосудистой клетки один также значительно увеличивается в гипофиза микровесселей, и уменьшилась в гипоталамус и ствол мозга микровесселей. Кроме того, изменения наблюдаются в молекуле адгезии сосудистой клетки одним выражением во время хронического экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита во всех тканях ЦНС, а также в экспрессии молекулы адгезии В в гипоталамусе и микровесселях гипофиза. Количественные анализы, такие как западная помарка, ПЦР и иммуногистохимия, могут быть выполнены после этой процедуры, чтобы выявить понимание генов и моделей экспрессии белка в рамках геммоокно-мозгового барьера.Параформальдегид является остро токсичным реагентом, и всегда должны быть обработаны под капотом дыма во время ношения надлежащего СИЗ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Системное и местное доставки лекарств для лечения заболеваний центральной нервной системы у грызунов Модели

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Оптические Перерезка Нервные: Модель взрослых апоптоза нейронов в центральной нервной системе

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Травма Paradigm по расследованию центральной нервной системы в ремонт<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Прямая Внутрижелудочковая поставке лекарственных препаратов грызунов центральной нервной системы

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

В естественных условиях допроса центральной нервной системы Translatome по Polyribosome фракционирования

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...