Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

El Dr. Cruz-Orengo contó con el apoyo de la Universidad de California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Todos los procedimientos del presente estudio están de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California (UC). El cuidado de animales en UC Davis está regulado por varios recursos independientes y ha sido totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC) desde 1966. Los tejidos del SNC porcino se obtuvieron del Departamento de Ciencias Animales de la UCD, ...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li><li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier.">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).</li><li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+barriers:+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms.">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes &amp; Development. 32, 466-478 (2018).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity.">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li><li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSR/angulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation.">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility.">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li><li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

El BBB incluye las propiedades únicas de las células endoteliales de microvasculatura cerebral del cerebro acopladas por una sofisticada arquitectura de uniones estrechas, adheridas, "peg-socket", y placas de adhesión críticas para la homeostasisdelSNC2,3,19. Las propiedades de las células endoteliales son inducidas y mantenidas por pericitos y los procesos de pie final de la astroglia circundante2<s...

Nuestro cerebro es el órgano más importante de nuestro cuerpo. Por esta razón, mantener la homeostasis cerebral a pesar de factores externos que pueden desencadenar una desviación de la normalidad es una prioridad. Según algunos eruditos, hace unos 400-500 millones de años1, los animales vertebrados desarrollaron lo que ahora conocemos como la barrera hematoencefálica (BBB)2,3. Esta "cerca" protectora ejerce la mayor influencia sobre la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) y funciona regulando estrechamente el transporte de iones, moléculas y células entre la sangre y el parénquima del SNC. Cuando el BBB se interrumpe, el cerebro se vuelve susceptible a la exposición tóxica, infección, y la inflamación. Por lo tanto, la disfunción BBB se asocia con muchos, si no todos, trastornos neurológicos y neurodesarrollo4,5,6.
La sofisticada función del BBB se atribuye a la microvasculatura única del SNC conformada por la unidad neurovascular (NVU)2,3. Células endoteliales altamente especializadas, pericitas y pies de punta astrocíticos son los componentes celulares de la NVU2,3. La matriz extracelular generada por estas células también es esencial para la fisiología NVU y BBB2,3. Aunque los componentes celulares y moleculares esenciales de la NVU se conservan entre los vertebrados, la heterogeneidad se reporta entre las órdenes y las especies7,8. Sin embargo, las limitaciones técnicas impiden nuestra capacidad de considerar plenamente estas diferencias en la neurobiología, la investigación biomédica o traslacional.
Debido a esto, ampliamos un método de aislamiento de microbuques específico de la región del SNC para hacerlo aplicable a numerosas especies de los cinco grupos de vertebrados: peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos. El protocolo se describe para su uso en vertebrados lisencéfalos y grandes, incluidas las especies con relevancia traslacional9. Además, incluimos otras regiones del SNC no investigadas antes en este contexto, pero relevantes para la neurofisiología y con tremendas implicaciones clínicas: el hipotálamo, la hipófisis y la materia blanca. Por último, probamos la capacidad de este método de aislamiento como una herramienta fiable para identificar cambios en la expresión proteica a lo largo de la NVU y/o BBB9,10,11. Como prueba de concepto, mostramos cómo determinar los cambios en la expresión VCAM-1 y JAM-B durante EAE utilizando el método de aislamiento seguido de inmunofluorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

El aislamiento de los microvasculares del sistema nervioso central (SNC) se realiza comúnmente mediante la combinación de tejido cortical de múltiples animales, la mayoría de las veces roedores. Este enfoque limita el interrogatorio de las propiedades de la barrera hematoencefálica (BBB) a la corteza y no permite la comparación individual. Este proyecto se centra en el desarrollo de un método de aislamiento que permite la comparación de la unidad neurovascular (NVU) de múltiples regiones del SNC: corteza, cerebelo, lóbulo óptico, hipotálamo, hipófisis, tronco encefálico y médula espinal. Además, este protocolo, desarrollado originalmente para muestras murinas, fue adaptado con éxito para su uso en tejidos del SNC de especies de vertebrados pequeños y grandes de los que también somos capaces de aislar microvas de la materia blanca del hemisferio cerebral. Este método, cuando se combina con inmunoetiquetado, permite la cuantificación de la expresión de proteínas y la comparación estadística entre individuos, tipo de tejido o tratamiento. Demostramos esta aplicabilidad evaluando los cambios en la expresión de proteínas durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo murino de una enfermedad neuroinflamatoria, esclerosis múltiple. Además, los microbuques aislados por este método podrían utilizarse para aplicaciones posteriores como qPCR, RNA-seq y Western blot, entre otros. Aunque este no es el primer intento de aislar los microrridos del SNC sin el uso de ultracentrifugación o disociación enzimática, es único en su adecuación para la comparación de individuos individuales y múltiples regiones del SNC. Por lo tanto, permite la investigación de una gama de diferencias que de otro modo pueden permanecer oscuras: porciones del SNC (córtex, cerebelo, lóbulo óptico, tronco encefálico, hipotálamo, hipófisis y médula espinal), tipo de tejido del SNC (materia gris o blanca), individuos, grupos de tratamiento experimental, y las especies.

Los microvasos aislados del SNC murino mostraron todos los componentes celulares intrínsecos de la unidad neurovascular2,3. Usando molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM, también conocida como CD31) o isolctina IB4 (una glicoproteína que une la célula endotelial glicocalyx) para células endoteliales, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) o antígeno de la neurona-glial 2 (NG2) p...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

El objetivo de este protocolo es aislar los microvasculares de múltiples regiones del sistema nervioso central de vertebrados lisencéfalos y gyrencéfalos.

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Este protocolo es significativo porque permite la comparación de la microvasculatura entre diferentes regiones del sistema nervioso central, así como entre diferentes individuos. Esta técnica de aislamiento de microcuelos se puede completar en un solo día, y elimina la necesidad de ultracentrifugación y disociación enzimática. Extirpar las meninges y el plexo coroides puede ser difícil.Asegúrese de trabajar lentamente y cuidadosamente para asegurar la eliminación completa de cada tejido. Para la disección de tejido del SNC de un pequeño espécimen de vertebrado lissencéfalo, coloque el cerebro cosechado en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga solución MV-1 sobre hielo, y use fórceps para recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo. Coloque la hipófisis en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros de solución mv-1 sobre hielo, y retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral.Después de extraer las extremidades, la caja torácica y los órganos internos, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para vaciar la columna vertebral con una solución fresca de MV-1, en una dirección caudal-rostral en todo el foramen vertebral lumbar. A continuación, coloque la médula espinal en un tubo de 5 mililitros que contenga una solución de MV-1 fresca. A continuación, coloca el cerebro en una placa de Petri bajo el microscopio de disección y retira las meninges con un pinchazo de doble punta.Asegúrese de revisar la médula espinal para asegurarse de que no queden trozos de meninges. Utilice los fórceps para separar el hipotálamo, el cerebelo, el tallo cerebral y la corteza. Cuando sea necesario, utilice fórceps e iris y tijeras de resorte para extirpar las bombillas olfativas y el tálamo, y utilice el pinchazo de doble punta para eliminar todo el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales.Para la disección de tejido del SNC de una gran muestra de vertebrados girofalálicos, utilice un microscopio diseccionador y un pinchazo de doble punta, fórceps y tijeras de iris y resorte para eliminar las meninges de cada tejido del SNC, teniendo cuidado de eliminar cualquier pedazo de plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Para la homogeneización de los tejidos cosechados del SNC, pica cada región del SNC en trozos de uno a dos milímetros dentro de los platos individuales de Petri. Para homogeneizar los tejidos del SNC a partir de pequeñas muestras de vertebrados, utilice una pipeta de transferencia para añadir un mililitro de solución MV-1 para suspender el tejido picado.Luego utilice la misma pipeta de transferencia para dispensar la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y las piezas de la médula espinal en amoladoras individuales de tejido de vidrio de 10 mililitros, y utilice un pestillo de PTFE y cinco mililitros de solución MV-1 para moler cada conjunto de tejidos durante unos 10 trazos. Transfiera cada suspensión de tejido en tubos cónicos individuales de 15 mililitros sobre hielo, y use fórceps para colocar el hipotálamo y la hipófisis en 100 microlitros de solución MV-1, en tubos individuales de 1,7 mililitros. Luego, homogeneizar cuidadosamente cada tejido con una micropesta de vidrio.Para homogeneizar una muestra de vertebrado grande, utilice una pipeta de transferencia de corte biselado para transferir el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio de 55 mililitros, y unir la amoladora a un agitador superior. Agregue la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1 de acuerdo con la porción específica del SNC que se homogeneiza como se indica en la tabla, y encienda el agitador superior a aproximadamente 150 rotaciones por minuto. Mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 segundos antes de apagar el agitador superior para agregar más solución MV-1 para una homogeneización adicional, hasta obtener una suspensión homogénea.A continuación, transfiera el tejido homogeneizado a un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para la purificación de microvajillones, el tejido del SNC homogeneiza por centrifugación y desecha los sobrenadantes. Para un pequeño aislamiento de microvajón de muestra de vertebrados, pipetee la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal, en cinco mililitros de solución MV-2 fresca y helada por muestra, unas 10 veces, antes de agregar cinco mililitros más de solución MV-2 helada a cada tubo.Voltear cuidadosamente los tubos para mezclar, y volver a suspender el hipotálamo y pellets pituitarios en un mililitro de solución MV-2. Para el aislamiento de microvajillones de muestras de vertebrados grandes, agregue 20 mililitros de solución de MV-2 helada a la corteza, cerebelo, tallo cerebral y pellets de microvajimos de la médula espinal, y vuelva a suspender los gránulos en un revólver de tubo a 40 rotaciones por minuto durante unos 5 minutos. Al final de la re-suspensión, separar el tejido del SNC lycates por centrifugación, y girar lentamente cada tubo para permitir que el sobrenadante pase a lo largo de la pared para separar cuidadosamente la capa de mielina gruesa y densa en la interfaz líquida de las paredes del tubo.Deseche las interfaces de mielina y líquido, y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Luego, utilice una toallita de papel retorcida de baja pelusa para absorber el exceso de líquido, y use puntas de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución MV-3. Para la elución y filtración de microvajillones, mezcle unos pocos mililitros de solución de MV-3 fresco para cada lodo de microvajillones de tejido del SNC, y mientras se mezcla para evitar agregados, colalice cada suspensión a través de un colador Pruitt en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.Coloque un filtro de red de nylon de 20 micrómetros en un soporte de filtro modificado por región del SNC. Transfiera el soporte del filtro a un tubo cónico de 50 mililitros y moje el filtro con cinco mililitros de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro, en el tubo cónico. Transfiera los microvajillones eluidos a cada filtro de red de nylon de 20 micrómetros y enjuague los microvajillones con cinco a 10 mililitros de solución mv-3 helada.Utilice fórceps para transferir cada filtro a vasos individuales que contengan la solución MV-3 helada, y agite suavemente cada filtro durante unos 30 segundos para separar las microvajillones. Después de transferir a un tubo cónico de 15 mililitros, recoja los microvajillones por centrifugación y utilice una pipeta de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución de MV-3 helada. A continuación, transfiera las suspensiones de microvajillones de pequeños especímenes vertebrados a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para centrifugación durante cinco minutos a 20.000 veces G, en cuatro grados centígrados.Para especímenes de vertebrados grandes, transfiera la suspensión a tubos individuales de centrífuga de cinco mililitros y agregue cuatro mililitros de solución MV-3 para centrifugación durante cinco minutos a 2.000 veces G en cuatro grados centígrados. Los componentes intrínsecos de la unidad neurovascular se pueden detectar en microvasculares, aislados como se ha demostrado, mediante inmunoetiquetado para CD31, PDGFR-beta y aquaporina cuatro, incluidos los microvasculares corticales, cerebelosos, hipófilos, hipotalámicos, cerebrales y espinales. Del mismo modo, se puede visualizar la expresión de la proteína de unión adherens-unión VE-cadherina, las proteínas de unión apretada CLDN5 y Zonula Occludens-1, la angulina-1 de proteína de unión tricelular y las marcas basales chemokina ligando CXCL motif 12, y gamma-glutamyltransferase-1.Además, la mayoría de los microvajillones están desprovistos de la expresión de actina muscular lisa alfa, lo que indica que este protocolo de aislamiento se dirige selectivamente a microcubares de pequeño calibre. Los microvasculares obtenidos de otros pequeños vertebrados lissencéfalos, como el ave, el mentiroso, la rana y el pez, comparten algunas características morfológicas, lo que sugiere que este método es útil para una mayor caracterización de las diferencias en las unidades neurovasculares entre las especies. La cuantificación de los cambios en la expresión de proteínas revela un aumento en la molécula de adhesión de células vasculares uno, y la molécula de adhesión unión B a lo largo de microvasculares de la médula espinal, durante el pico de la encefalomielitis autoinmune experimental.Sin embargo, molécula de adhesión de células vasculares uno también se incrementa significativamente en microvasculares pituitarias, y disminuyó en el hipotálamo y microvasculares de tronco cerebral. Además, se observan cambios en la molécula de adhesión de células vasculares una expresión durante la encefalomielitis autoinmune experimental crónica en todos los tejidos del SNC, y en la expresión de la molécula de adhesión de unión B en el hipotálamo y los microvasculares pituitarios. Los análisis cuantitativos, como la mancha occidental, la PCR y la inmunohistoquímica, se pueden realizar siguiendo este procedimiento para revelar información sobre los patrones de expresión de genes y proteínas dentro de la barrera hematoencefálica.El paraformaldehído es un reactivo agudamente tóxico y siempre debe manipularse bajo la campana de humos mientras se usa un EPP adecuado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Medicamentos sistémicos y locales de entrega para el Tratamiento de Enfermedades del Sistema Nervioso Central en modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Investigación

Neurociencias

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...