Name: reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Dr Cruz-Orengo stöddes av University of California, Davis, skolan för veterinärmedicin starta upp medel.

Alla förfaranden i denna studie är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av University of California (UC), Davis institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Djuromsorg på UC Davis regleras av flera oberoende resurser och har ackrediterats fullt ut av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International (AAALAC) sedan 1966. Svin CNS vävnader erhölls från UCD Institutionen för djur vetenskaper, kött vetenskap laboratorium. CNS-vävnader från Rhesus makake...

<ol>
	<li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago.">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412 (2015).</li><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li><li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders.">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders.">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li><li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier.">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544 (2016).</li><li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+barriers:+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms.">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes &amp; Development. 32, 466-478 (2018).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity.">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li><li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li><li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSR/angulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation.">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li><li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility.">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li><li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation.">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells.">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li><li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis.">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li><li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis.">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li><li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy.">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208 (2015).</li><li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels.">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li><li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels.">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li><li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex:+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer's+disease.">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li><li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice.">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048 (2017).</li></ol>

BBB innehåller de unika egenskaperna hos hjärnans mikrovaskulatur endotelceller i kombination med en sofistikerad arkitektur av tight-, anhängare-, "Peg-socket"-korsningar, och vidhäftning plack kritisk för CNS homeostas2,3,19. Endotelceller egenskaper induceras och upprätthålls av pericyter och den omgivande astroglia slutet fot processer2,3,<sup class...

Vår hjärna är den viktigaste orgeln i vår kropp. Av denna anledning, hålla hjärnan homeostas trots yttre faktorer som kan utlösa en avvikelse från normalitet är en prioritet. Enligt vissa forskare, cirka 400 – 500 miljoner år sedan1, ryggradsdjur utvecklat vad vi nu känner som blod-hjärnbarriären (BBB)2,3. Detta skyddande "staket" utövar det största inflytandet över centralanervsystemet (CNS) homeostas och funktioner genom att tätt reglera transporten av joner, molekyler, och celler mellan blod och CNS parenkymet. När BBB störs, hjärnan blir mottagliga för toxisk exponering, infektion, och inflammation. Därför är BBB dysfunktion förknippad med många, om inte alla, neurologiska och neurologiska utvecklingsstörningar4,5,6.
Den sofistikerade funktionen av BBB tillskrivs den unika CNS mikrovaskulatur formas av neurovaskulära enhet (NVU)2,3. Mycket specialiserade endotelceller, pericyter, och astrocytic slutet av fötterna är de cellulära komponenterna i NVU2,3. Den extracellulära matris som genereras av dessa celler är också viktigt att NVU och BBB fysiologi2,3. Även om viktiga cellulära och molekylära komponenter i NVU bevaras bland ryggradsdjur, rapporteras heterogenitet bland order och arter7,8. Men tekniska begränsningar hindrar vår förmåga att till fullo beakta dessa skillnader i neurobiologi, biomedicinsk eller translationell forskning.
På grund av detta utökade vi en CNS regionspecifika microvessel-isoleringsmetod för att göra den tillämplig på många arter från alla fem ryggradsdjur grupper: fisk, amfibier, reptiler, fåglar och däggdjur. Protokollet beskrivs för användning på små-lissencephalic och stora gyrencephalic-ryggradsdjur, inklusive arter med translationell relevans9. Dessutom, vi inkluderar andra regioner i CNS som inte undersökts tidigare i detta sammanhang, men relevant för neurofysiologi och med oerhörda kliniska konsekvenser: hypotalamus, hypofysen, och vit materia. Slutligen testade vi kapaciteten hos denna isoleringsmetod som ett pålitligt verktyg för att identifiera förändringar i proteinuttryck längs med NVU och/eller BBB9,10,11. Som ett proof-of-koncept, visade vi hur man bestämmer förändringar i VCAM-1 och JAM-B uttryck under EAE med isolerings metoden följt av immunofluorescens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Used as fixative (4% PFA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 MW Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>9004-54-0</td>
			<td>Used for MV-2 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps, student quality</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 100 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431752-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 70 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Deskwork low-binding tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS4151</td>
			<td>Same as below but cheaper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Poly-D-Lysine</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3439-100-01</td>
			<td>Used for slide coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21432</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10029</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Pronged Tissue Pick</td>
			<td>FST</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>Used for removal of meninges and choroid plexus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Used for CNS tisssue dissection and handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps, student</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Same as above but cheaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22493008</td>
			<td>Better quality than the tips above (more expensive).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td>Used for bone removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for removal of pig and macaque dural sac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10</td>
			<td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td>
			<td>GP1.5_10</td>
			<td>Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CXCL12, biotinylated</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>500-P87BGBT</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-JAM-B</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1074</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21424</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PDGFR&#946;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1042</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A21249</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35552</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG-DyLight 650</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SA5-10021</td>
			<td>Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth</td>
			<td>FST</td>
			<td>11054-10</td>
			<td>Use for nylon filter net holding and shaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CM</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1M liquid buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>Used for MV-1 solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td>
			<td>I21414</td>
			<td>Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaGrange Scissors, serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>14173-12</td>
			<td>Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide 8-well unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CLDN5</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35-2500</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GGT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab55138</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Human CD31</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>BBA7</td>
			<td>Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-NFM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>RMO-270</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;SMA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MA5-11547</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Net, roll</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY6000010</td>
			<td>Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2002500</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Filter Nets, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>NY2004700</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Used to coverslip slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-AQP4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LSR</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SAB2107967</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-OSP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53041</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-VE-Cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33168</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD31</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 550274</td>
			<td>Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-VCAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BD 553329</td>
			<td>Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Ringer&#39;s Solution, Frog</td>
			<td>Aldon Corporation</td>
			<td>IS5066</td>
			<td>Used for amfibian anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 555</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32355</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-ALEXA 647</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S32357</td>
			<td>Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-12</td>
			<td>Used for removal of muscle and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, sharp-blunt</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-16</td>
			<td>Used for decapitation (except pig and macaque)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 13 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0001300</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0004700</td>
			<td>Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>50-165-7277</td>
			<td>Used for blocking and antibody diluent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>62400-904 (DWK #903475)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-384 (DWK #357979)</td>
			<td>Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL</td>
			<td>VWR (Supplier DWK Life Sciences)</td>
			<td>14231-372 (DWK #357994)</td>
			<td>Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable isolation of central nervous system microvessels across five vertebrate groups

Isolering av mikrokärl från centralanervsystemet (CNS) utförs vanligen genom att kombinera kortikal vävnad från flera djur, oftast gnagare. Detta tillvägagångssätt begränsar förhör av blod-hjärnbarriären (BBB) egenskaper till cortex och tillåter inte för individuell jämförelse. Detta projekt fokuserar på utveckling av en isoleringsmetod som möjliggör jämförelse av neurovaskulär enhet (NVU) från flera CNS regioner: cortex, cerebellum, Optic Lobe, hypotalamus, hypofys, hjärnstammen, och ryggmärgen. Dessutom, detta protokoll, ursprungligen utvecklades för murina prover, framgångsrikt anpassats för användning på CNS-vävnader från små och stora ryggradsdjur som vi också kan isolera mikrofartyg från hjärnhalvan vit materia. Denna metod, när den paras ihop med immunolabeling, möjliggör kvantifiering av proteinuttryck och statistisk jämförelse mellan individer, vävnadstyp, eller behandling. Vi bevisade denna tillämplighet genom att utvärdera förändringar i proteinuttryck under experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), en murin modell av en neuroinflammatorisk sjukdom, multipel skleros. Dessutom kan mikrofartyg som isolerats med denna metod användas för nedströmsprogram som qPCR, RNA-SEQ och Western blot, bland annat. Även om detta inte är det första försöket att isolera CNS mikrofartyg utan användning av ultracentrifugering eller enzymatisk dissociation, det är unikt i sin adeptness för jämförelsen av enskilda individer och flera CNS regioner. Därför, det gör det möjligt för utredning av en rad skillnader som annars kan förbli oklara: CNS portioner (cortex, cerebellum, optisk LOB, hjärnstammen, hypotalamus, hypofys, och ryggmärgen), CNS vävnad typ (grå eller vit materia), individer, experimentella behandlingsgrupper och arter.

Mikrofartyg isolerade från murin CNS visade alla inneboende cellulära komponenter i neurovaskulär enhet2,3. Använda antingen trombocyt endotelcelladhesion molekyl-1 (PECAM, även känd som CD31) eller isolectin IB4 (ett glykoprotein som binder endotelcellglykocalyx) för endotelceller, trombocythärledd tillväxtfaktor-β (PDGFRβ) eller neuron-Glial antigen 2 (NG2) för pericyter och aquaporin-4 (AQP4) för astrocytiska änd ...

Watch this Scientific Journal Video about Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups at JoVE.com

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Målet med detta protokoll är att isolera mikrofartyg från flera regioner i det centralanervsystemet hos lissencephalic och gyrencephalic-ryggradsdjur.

Tillförlitlig isolering av mikrokärl i centralanervsystemet över fem ryggradsdjur

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Detta protokoll är betydande eftersom det möjliggör jämförelse av mikrovaskulatur mellan olika centrala nervsystemet regioner, liksom mellan olika individer. Denna microvessel isoleringsteknik kan slutföras inom en enda dag, och det eliminerar behovet av ultracentrifugeringen och enzymatisk dissociation. Ta bort hjärnhinnorna och choroid plexus kan vara svårt.Var noga med att arbeta långsamt och noggrant för att säkerställa fullständig borttagning av varje vävnad. För CNS vävnad dissektion från en liten lissencephalic ryggradsdjur exemplar, placera den skördade hjärnan i en 15 milliliter koniska röret som innehåller MV-1 lösning på is, och använda tlyckor för att hämta hypofysen från sella turcica av skallen. Placera hypofysen i en 1,7 milliliter mikrocentrifug röret av MV-1 lösning på is, och ta bort huden och muskeln för att exponera kotpelaren.Efter avlägsnande av armar och ben, bröstkorg och inre organ, använd en 10 milliliter spruta utrustad med en 18 gauge nål för att spola ryggraden med färsk MV-1 lösning, i en caudal-till-rostral riktning i hela ländkotan foramen. Placera sedan ryggmärgen i ett 5 milliliter rör som innehåller färsk MV-1 lösning. Placera därefter hjärnan i en petriskål under dissekering mikroskop, och ta bort hjärnhinnorna med dubbel-pronged prick.Var noga med att kontrollera ryggmärgen för att säkerställa att inga bitar av hjärnhinnor finns kvar. Använd tänjarna för att separera hypotalamus, lillhjärnan, hjärnstammen, och cortex. Vid behov, använd tång och iris och vårsax till punktskatt luktlökar och thalamus, och använda dubbel-pronged prick för att ta bort alla av choroid plexus från alla hjärnan ventriklarna.För CNS vävnad dissektion från en stor gyrencefalisk ryggradsdjur exemplar, använd en dissekera mikroskop och en dubbel-pronged prick, tång, och iris och våren sax för att ta bort hjärnhinnorna från varje CNS vävnad, var noga med att ta bort eventuella bitar av koroidplexus från hjärnan ventriklarna. För homogenisering av de skördade CNS-vävnaderna, färs varje CNS-region i en till två millimeter bitar inom enskilda petriskålar. För att homogenisera CNS-vävnader från små ryggradsdjur, använd en överföringspipett för att lägga till en milliliter MV-1-lösning för att suspendera den malda vävnaden.Använd sedan samma överföringspipett för att fördela cortex, lillhjärnan, hjärnstammen, optisk lob och ryggmärgsbitarna i enskilda 10 milliliter glasvävnadskvarnar, och använd en PTFE-mortelstöt och fem milliliter MV-1-lösning för att mala varje uppsättning vävnader för cirka 10 slag. Överför varje vävnadsslammry till individuella 15 milliliter koniska rör på is, och använd tänjningar för att placera hypotalamus och hypofysen i 100 mikroliter av MV-1-lösning, i individuella 1,7 milliliterrör. Sedan, noggrant homogenisera varje vävnad med ett glas mikropestle.För att homogenisera ett stort ryggradsdjur exemplar, använd en avfasad skära överföring pipett för att överföra den malda vävnaden till en 55 milliliter glas vävnad kvarn, och fästa kvarnen till en overhead omrörare. Tillsätt hälften av den rekommenderade volymen av MV-1-lösning enligt den specifika CNS-delen som homogeniseras enligt vad som anges i tabellen, och sätt på omröraren på ungefär 150 rotationer per minut. Flytta försiktigt glasröret upp och ner i ca 30 sekunder innan du stänger av omröraren för att lägga till mer MV-1 lösning för ytterligare homogenisering, tills en homogen slurry erhålls.Överför sedan den homogeniserade vävnaden till ett koniskt rör på 50 milliliter på is. För microvessel rening, pellet CNS vävnaden homogenates genom centrifugeringen, och kassera supernatanterna. För en liten ryggradsdjur microvessel isolering, pipettera cortex, lillhjärnan, hjärnstammen, optisk lob och ryggmärg pellets, i fem milliliter av färska, iskall MV-2 lösning per prov, ca 10 gånger, innan du lägger till fem milliliter av iskall MV-2 lösning till varje rör.Vänd försiktigt rören för att blanda, och åter upphäva hypotalamus och hypofysen pellets i en milliliter av MV-2 lösning. För stora ryggradsdjur microvessel isolering, tillsätt 20 milliliter iskall MV-2 lösning till cortex, lillhjärnan, hjärnstammen och ryggmärgen microvessel pellets, och åter upphäva pellets i ett rör revolver på 40 rotationer per minut i ca 5 minuter. Vid slutet av återupphängning, separera CNS-vävnadens lykater genom centrifugering, och rotera långsamt varje rör för att låta supernatanten passera längs väggen för att försiktigt lösgöra det tjocka och täta myelinskiktet på vätskegränssnittet från rörväggarna.Kasta myelin och flytande gränssnitt, och blot insidan väggen i varje rör med en spatel insvept med en låg-ludd papper torka. Använd sedan en vriden låglindad papperstorka för att absorbera överflödig vätska, och använd lågbindande tips för att åter upphäva varje pellet i en milliliter MV-3-lösning. För mikrovessel eluering och filtrering, blanda några milliliter färsk MV-3 lösning till varje CNS vävnad microvessel slurry, och samtidigt blanda för att undvika aggregat, stam varje suspension genom en Pruitt sil till enskilda 50 milliliter koniska rör.Placera ett nätfilter med 20 mikrometer nylon på en modifierad filterhållare per CNS-region. Överför filterhållaren på ett koniskt rör på 50 milliliter, och fukta filtret med fem milliliter iskall MV-3-lösning, var förvissad om att bufferten häller ner filterhållaren, i det koniska röret. Överför eluted microvessels på varje 20 mikrometer nylon nettofilter, och skölj mikrofartyg med fem till 10 milliliter iskall MV-3 lösning.Använd forceps för att överföra varje filter till enskilda bägare som innehåller den iskalla MV-3-lösningen, och skaka försiktigt varje filter i ca 30 sekunder för att lossa mikrofartygen. Efter överföring till en 15 milliliter koniska röret, samla mikrovess genom centrifugeringen, och använda en låg-bindande pipett att åter upphäva varje pellet i en milliliter iskall MV-3 lösning. Överför sedan mikrovessel suspensioner från små ryggradsdjur exemplar till en 1,7 milliliter mikrocentrifugrör för centrifugering i fem minuter vid 20, 000 gånger G, i fyra grader celsius.För stora ryggradsdjur, överför suspensionen till enskilda fem milliliter centrifugrör, och tillsätt fyra milliliter MV-3 lösning för centrifugering i fem minuter vid 2, 000 gånger G i fyra grader celsius. De inneboende komponenterna i neurovaskulära enheten kan detekteras inom microvessels, isolerade som visats, genom immunolabeling för CD31, PDGFR-beta och aquaporin fyra, inklusive den kortikala, cerebellar, hypofysen, hypotalatisk, hjärnstammen och spinal microvessels. Likaså kan uttrycket av adherens-junction protein VE-cadherin, tight junction proteiner CLDN5 och Zonula Occludens-1, tricellular junction protein angulin-1, och basal markes chemokine ligand CXCL motiv 12, och gamma-glutamyltransferase-1, visualiseras.Dessutom är majoriteten av microvessels saknar uttryck för alfa glatt muskel aktin, vilket tyder på att denna isolering protokoll selektivt mål små kaliber microvessels. Microvessels erhållna från andra små lissencephalic ryggradsdjur, som fågel, liard, groda, och fisk, dela vissa morfologiska funktioner, vilket tyder på att denna metod är användbar för ytterligare karakterisering av skillnader i neurovaskulära enheter mellan arter. Kvantifiering av förändringarna i proteinuttryck avslöjar en ökning av vaskulär celladhesion molekyl ett, och junctional adhesion molekyl B längs ryggmärgen microvessels, under toppen av experimentella autoimmun encefalomyelit.Kärlcelladhesionsmolekyl en är dock också betydligt ökad i hypofysen microvessels, och minskade i hypotalamus och hjärnstammen microvessels. Dessutom är förändringar observeras i vaskulär celladhesionsmolekyl ett uttryck under kronisk experimentell autoimmun encefalomyelit i alla CNS vävnader, och i junctional adhesion molekyl B uttryck i hypotalamus och hypofysen microvessels. Kvantitativa analyser, såsom western blot, PCR och immunohistokemi, kan utföras efter denna procedur för att avslöja insikter i gen- och proteinuttrycksmönster inom blod - hjärnbarriären.Paraformaldehyd är en akut giftig reagens, och ska alltid hanteras under draghuven medan du bär korrekt PPE.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Systemisk och lokal Drug Delivery för behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet i gnagarmodeller

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Synnerven transection: En modell av Vuxen Neuron apoptos i det centrala nervsystemet

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skada Paradigm att undersöka centrala nervsystemet Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Förhör av centrala nervsystemet Translatome av Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...